Skjult i vanlig syn–svært rikelig og variert planktonisk ferskvann Chloroflexi

Overflod Og mangfold Av phylum Chloroflexi i ferskvannsmiljøer

basert PÅ 16s rrna lese overflod fra 117 metagenomer fra innsjøer, reservoarer og elver, representanter For phylum chloroflexi besto opp til 7% av prokaryote samfunnet i epilimnion (fig. 1a, b), men med store svingninger. I likhet med tidligere observasjoner dominerte CL500-11-linjen hypolimnionprøver (nå minst 16% i alle, men en prøve, og nesten 27% i En prøve Fra Lake Biwa) (Fig. 1c), bortsett fra en mindre kjent gruppe referert TIL SOM tk10-klyngen. Flertallet AV TK10-relaterte 16s rRNA-sekvenser i SILVA-databasen stammer fra jord, menneskelig hud eller ukjente metagenomiske prøver, mens bare fire (1.5%) er fra ferskvann (Tilleggsfil 1: Figur S1A).

Overraskende nok ble epilimnion-prøvene dominert av sekvenser tilknyttet «SL56 marine group»(opp til ca. 5% av totalt prokaryotisk samfunn). SL56 – relaterte sekvenser AV SILVA har blitt utvunnet fra en ferskvannssjø og Global Ocean Series datasets (GOS) . IMIDLERTID ER GOS-prøven som DE ble beskrevet, faktisk et ferskvannsdatasett, Lake Gatun (Panama). Det er ganske tydelig fra våre resultater (Fig. 1; Tilleggsfil 1: Figur S2) at denne klyngen er konsekvent funnet bare i innsjøer, reservoarer, og elver, men ikke i det marine habitat, noe som tyder på at det har blitt feilaktig referert til som en » marine gruppe.»En annen gruppe av sekvenser, referert TIL SOM JG30-KF-CM66, beskrevet fra ulike miljøer (uran gruvedrift avfall haug, jord, ferskvann, marine vannsøyle, og sediment), ble funnet å være fortrinnsvis fordelt i elver (spesielt Elven Amazon)enn innsjøer (Fig. 1a, b), om enn ved svært lave forekomster(maksimalt 1% av totale prokaryoter). Lignende forekomster ble funnet i brakpiasjøen (dyp 40 m og 150 m) (Tilleggsfil 1: Figur S2).

vi kunne imidlertid ikke finne støtte for TILSTEDEVÆRELSEN AV ENTEN SAR202-klyngen eller ferskvannssøsteren clade CL500-9 i alle undersøkte ferskvannsmetagenomiske datasett. I marine og brakete habitater FINNES SAR202 nesten utelukkende i de mørke aphotiske lagene, hvor DE står for opptil 30% av det prokaryotiske samfunnet . HVIS DET ER NOEN SAR202-relaterte klader i ferskvannshabitater, er de absolutt ikke veldig rikelig eller kanskje ikke stammer fra vannsøylen i den opprinnelige rapporten (Tilleggsfil 1: Figur S1). Alt i alt, selv om relative forekomster Av Klorflexi i ferskvann epilimnia er langt lavere enn i dypere farvann, de er hjem til en rik og utbredt samling av nye grupper.

med disse observasjonene er det også tydelig at i de akvatiske miljøene som undersøkes her (ferskvann, brakkvann og marine), er mangfoldet Av Klorflexi-representanter vesentlig forskjellig, med ferskvannsmiljøene som har et fylogenetisk mer variert utvalg av grupper enn enten brakkvannet eller det marine. Videre er det klare bevis for forekomst av ferskvannsgrupper (f. eks. SL56) og marine og brakk bare grupper (SAR202), gjentar at saltholdighet er en barriere mot mikrobielle habitat overganger mellom ferskvann og marine økosystemer . Det er på ingen måte en uoverstigelig barriere som relativt nylige overganger fra ferskvann til marine (f. eks ferskvann » Ca. Methylopumilus spp.»og marine om43) og i revers (marine Pelagibacter og ferskvann LD12 ) har begge blitt foreslått. Det er imidlertid sannsynlig at gruppene som finnes i brakmiljøer, kanskje bare er bedre «primet» for mer vellykkede forays. Vi finner eksempler på grupper som finnes i ferskvann og brakkvann metagenomer (JG30-KF-CM66 OG CL500-11).

de store ferskvann Chloroflexi representanter

Automatisert binning Av Chloroflexi-relaterte contigs fra samlinger av hver 57 datasett som tilhører 14 forskjellige miljøer (28 innsjøer/reservoarer, 26 elver, og 3 brakk datasett) resulterte i segregering av 102 MAGs (metagenome-montert genomer) totalt (Tilleggsfil 2: Tabell S1). Fylogenomisk analyse Av MAGs med 30% eller høyere fullstendighet (n = 53) viser at et bemerkelsesverdig høyt mangfold Av MAGs ble gjenvunnet fra praktisk talt alle kjente Klorflexi-klasser (Fig. 2). Trettifem MAGs utgjorde tre separate roman klasse nivå linjer uten tilgjengelige kultiverte representanter (SL56, TK10, OG JG30-KF-CM66).

mens fluorescens in situ hybridisering etterfulgt av katalysert reporter deponering (CARD-FISH) oppdaget høye tall AV CL500-11 celler I Lake Zurich epilimnion under delvis mixis i vinter, topp overflod nivåer ble alltid funnet i dypere soner, i Begge Lake Zurich (opp til 11% av alle prokaryoter; Fig. 3a) Og Lake Biwa (opp til 14%; Fig. 3d). Cl500-11 overflod korrelert negativt med både temperatur og klorofyll a konsentrasjon (Tilleggsfil 1: Figur S3). I Ř Reservoarprøver var IMIDLERTID CL500-11 under deteksjonsgrensen (< 0,18%), noe som tyder på at dette relativt grunne habitatet (maksimal dybde 43 m) ikke representerer en foretrukket nisje for denne gruppen bakterier (Tilleggsfil 1: Figur S4). CL500 – 11 celler har tidligere blitt visualisert AV KORTFISK og vist seg å være store, buede celler . Lignende former og størrelser ble observert i FISKEPRØVER fra Zurichsjøen med gjennomsnittslengder på 0.92 µ (område 0.4–1.6 µ; n = 277) og bredder på 0.28 µ (område 0.19–0.39 µ). Analyse av cellevolumene (median 0.06 µ3) og biomasse for denne klyngen sammenlignet med alle prokaryoter (Fig. 3c) antyder et ekstremt høyt bidrag AV CL500 – 11-populasjonen til total mikrobiell biomasse. Deres biomasse til overflodforhold er nesten 2, dvs. ved 10% overflod utgjør de nesten 20% av den totale prokaryotiske biomassen, noe som indikerer en bemerkelsesverdig tilpasning til den relativt oligotrofiske dype hypolimnionen, og oppnår høye populasjoner selv med sine store cellestørrelser.

vi gjenvunnet 11 MAGs (10 ferskvann, 1 brakkvann) FOR CL500-11 totalt. Alle fire MAGs Av Lake Biwa fra forskjellige måneder danner en enkelt art. De to artene fra Lake Zurich ser imidlertid ut til å eksistere i løpet av året (Mars, Mai og November) med en art som forgrener seg sammen med DEN tidligere beskrevne MAG fra Lake Michigan (CL500-11-LM) og de andre artene har nære representanter også i brakkhav (> 95% ANI) og lignende metagenomiske fragment rekrutteringsmønstre (Fig. 2 og 4c). Vi foreslår kandidaten slekten Profundisolitarius (Pro. fun.di. so. li. ta ‘ri.us. L. adj. profundus dyp; L. adj. solitarius alene; N. l. masc. n. Profundisolitarius en eneste eneboer fra dypet) innenfor Candidatus Profundisolitariaceae fam. nov. for CL500 – 11 klyngen (Klasse Anaerolinea).

PÅ DEN annen side er SL56-gruppen den dominerende linjen i Ř Reservoar (maksimum 1.1%), både VED 16s rRNA og KORTFISKANALYSER (Fig. 1 og 3). Maksimal forekomst ble nesten alltid funnet på rundt 5-20 m ved temperaturer på ca. 15 hryvnias C, noe som tyder på at denne gruppen hovedsakelig er epilimnetisk (Tilleggsfil 1: Tall S3 og S4). Denne regionen av vannsøylen (termoklin), bortsett fra å ha en temperaturgradient, har også betydelig lavere lysintensitet i forhold til overflatelag. Peak forekomster av lavt lys tilpasset cyanobacterium Planktothrix rubescens på rundt 13 m dybde i stratifisert sommer profiler Av Lake Zurich sammenfaller med maksimal forekomst AV SL56 (Tilleggsfil 1: Figur S3). SL56-cellene er stangformede og langstrakte (gjennomsnittlig lengde = 0.68 ± 0.25 µ; gjennomsnittlig bredde = 0.35 ± 0.09 µ; n = 6; Fig. 3e). Så vidt vi vet, er dette den første rapporten fra en ferskvannsspesifikk Chloroflexi-gruppe som ser ut til å trives i epilimnion.

Totalt 14 MAGs ble gjenfunnet FOR SL56 klynge (1 inneholder 16s rRNA) og danner en klasse-nivå avstamning, betydelig avvikende Fra alle kjente Klorflexi (Fig. 2). Deres eneste slektning er en enkelt MAG (Chloroflexi CSP1-4) beskrevet fra akvifer sediment . 16S rRNA-kladen SOM CSP1-4 angivelig er tilknyttet, Er Gitt-GS-136, og flertallet av sekvenser i denne kladen stammer fra enten jord-eller elvesedimenter (informasjon FRA SILVA-taksonomi). Vi var imidlertid ikke i stand til å oppdage NOEN 16s rRNA-sekvens (delvis eller fullstendig) i den tilgjengelige genomsekvensen AV CSP1-4. Den neste nærmeste clade (I 16s rRNA taksonomi) Til Gitt-GS-136 OG SL56 ER KD4-96, hvis sekvenser ble oppnådd fra de samme habitatene (se Tilleggsfil 1: Figur S1B). I tillegg kommer alle kjente 16s rRNA-sekvenser FRA SL56-gruppen bare fra ferskvann(Lake Gatun, Lake Zurich, etc.). Tatt sammen, det ser ut til at de nærmeste fylogenetiske slektninger av ferskvann SL56 avstamning bebo jord eller sediment habitater.

SL56 MAGs ble rekonstruert fra geografisk fjerne steder (Europa, Nord-Og Sør-Amerika, Fig. 2), og minst ni forskjellige arter kunne påvises (ANI, Fig. 1). Ingen MAGs ble hentet Fra Lake Biwa prøver, men tre 16s rRNA sekvens ble hentet i ubundne contigs. De rekonstruerte MAGs distribueres globalt langs ferskvannsdatasett fra epilimnion (ingen oppdaget i dyp hypolimnion) (Fig. 4 Og Tilleggsfil 1: Figur S6). INGEN SL56 MAGs ble rekonstruert fra Kaspihavet, og ingen av de gjenvunnet genomer rekruttert fra brakk metagenomer. Vi foreslår kandidatgruppen Limnocylindrus (Lim.no.cy.lin ‘ drus. Gr. fem. n. limne a lake; L. masc. n. cylindrus en sylinder; N. L. masc. n. Limnocylindrus en sylinder fra en innsjø) innenfor Limnocylindrusfamilien fam. nov., Limnocylindrales ord.nov., Og Limnocylindria classis. nov. for Chloroflexi SL56 klyngen.

TK10 16s rRNA-sekvenser ble funnet ved høyeste forekomst I Lake Biwa hypolimnion-prøver (maksimalt ca. 2%) (Fig. 1a, c). Cellene var ovoide med en estimert lengde på 1.08 ± 0.1 µ og bredde på 0.84 ± 0.09 µ (n = 12; Fig. 3e). En sammenhengende klynge av ni MAGs (tre som inneholder 16s Rrna Tilleggsfil 1: Figur S1) fra geografisk fjerne steder (Europa, Asia Og Nord-Amerika) ble gjenfunnet. Disse bemerkelsesverdig kosmopolitiske organismene som blomstrer i dypere sjølag er ikke veldig forskjellige (ANI-verdier > 95%). Dette tilsynelatende lave mangfoldet kan være en konsekvens av en meget spesialisert nisje eller hva som er mer sannsynlig, et resultat av en relativt nylig overgang til ferskvann, som ligner På » Ca. Fonsibacter» (LD12 Alphaproteobacteria). Ingen 16s rrna representanter ble påvist trygt i marine eller brakk metagenomer om noen 16s rRNA sekvenser AV SILVA database er innhentet fra marine sedimenter og vannsøyle (Tilleggsfil 1: Figur S1). Nærmeste slektninger FRA 16s rRNA synes å være enten fra jord eller fra sedimentprøver som tyder på at disse kan være deres opprinnelige habitat. Interessant ER tk10-klyngen også dyp forgrening, først ETTER SL56 og CSP1 – 4 i det fylogenetiske treet Av Klorflexi som helhet, og alle Andre Klorflexi-representanter (MAGs eller isolatgenomer) ser ut til å stamme fra en gren som er forskjellig for begge disse. Vi foreslår kandidat slekten Umbricyclops (Um.bri.cy clops.l. fem. N. umbra skygge; L. masc. n. cyclops (Fra Gr. Runde øyne; Cyclops) en cyclops; N. l. masc. N. Umbricyclops et rund øye som bor i skyggen) innenfor Umbricyclopaceae fam. nov., Umbricyclopales ord.nov., Og Umbricyclopia classis november. for denne gruppen av organismer.

KORTFISK-resultatene viser AT jg30-KF-CM66-cellene er sfæriske med en estimert diameter på 0.56 µ (±0.15 µ; n = 8; Fig. 3e); det ble imidlertid observert svært lave andeler (< 0,28%) FOR JG30-KF-CM66 I Lake Zurich og Ř Reservoardybdeprofilene (tilleggsfil 1: Tall S3 og S4). Vi fikk 12 MAGs, for det meste fra dypvannssøylen (åtte brakkvann, fire ferskvann), en med en nær komplett 16s sekvens, som dannet en ny klasse nivå avstamning i fylogenomisk analyse (Fig. 1). De nærmeste slektningene til Disse Magene er marine SAR202 og Dehalococcoidea(Fig. 1 Og Tilleggsfil 1: Figur S1). Innenfor denne klyngen kan man skille forskjellige grupper av brakkvann Og ferskvannsmagger. Vi foreslår kandidaten slekten Bathosphaera (Ba.tho.sphae ‘ ra. Gr. adj. bathos dyp; L. fem. n.sphaera a sfære; N. l. fem. N. Bathosphaera en coccoid bakterier som lever i dyp) innenfor Bathosphaeraceae fam. nov., Bathosphaerales ord.nov. Og Bathosphaeria classis. nov. For Chloroflexi jg30-KF-CM66 klyngen.

vi gjenvunnet Også MAGs i klassene Chloroflexia (fire MAGs) Og Caldilineae (To MAGs) (Fig. 1). Chloroflexia MAGs var relatert til mesophilic Oscillochloris trichoides DG-6 I sub-order Chloroflexineae (en MAG) og tre Andre MAGs Til Kouleothrix aurantiaca I Kouleotrichaceae fam. nov. danner en ny underordre som vi foreslår navnet Kouleothrichniae underordre. nov. Ingen Av Disse MAGs viser noen betydelig fragment rekruttering bortsett fra deres opprinnelsessted. Ytterligere 14 MAGs fra Kaspian tilknyttet SAR202-klyngen som ikke vil bli nærmere diskutert her som de allerede er beskrevet .

bidrag av ferskvannskloroflexi i økosystemets funksjon

Metabolsk innsikt i rekonstruert Klorflexi MAGs (fullstendighet ≥ 30%) foreslår en primært heterotrofisk livsstil som i noen grupper forsterkes av lysdrevet energiproduksjon via enten rhodopsiner (CL500-11, Chloroflexales, SL56 og TK10) eller aerob anoksygenisk fototrofi (Chloroflexales). MAGs av hver klynge inneholder nødvendige gener for sentral karbohydratmetabolisme, inkludert glykolyse, glukoneogenese og trikarboksylsyre syklus. Nøkkelgener for assimilatorisk sulfatreduksjon (3 ‘- fosfoadenosin 5 ‘ – fosfosulfat (PAPS) syntase og sulfatadenyltransferase) var fraværende i de fleste MAGs som tyder på utnyttelse av eksogene reduserte svovelforbindelser . Denitrifiseringsgener (nitratreduktase / nitritoksidoreduktase alfa-og beta-underenheter og nitritreduktase) ble funnet I TK10 MAGs, men de påfølgende enzymer som var ansvarlige for produksjonen av molekylært nitrogen var fraværende.

I akvatiske miljøer Er Thaumarchaeota og Cyanobakterier hovedkilden til kobalamin og dets corrinoidforløpere for det store samfunnet av auxotrofer eller de få som er i stand til å redde . De novo syntese av kobalamin har en høy metabolsk kostnad, Og Black Queen Hypotesen har blitt fremsatt som en forklaring på grunner til at bare noen få samfunnsmedlemmer utfører sin produksjon . Ingen av De rekonstruerte Chloroflexi MAGs kode nødvendige gener for corrin ring biosyntese fra grunnen av, og høy affinitet kobalamin (BtuBFCD) eller andre mistenkte corrinoid (DET1174-DET1176) transportører manglet også som kan være en konsekvens av genom ufullstendighet eller bruk av en ubeskrevet transportør. Men ikke alle disse organismene synes å være auxotrophs Som MAGs AV JG30-KF-CM66 klynge kode gener for kobinamid til kobalamin berging vei som benytter importerte corrinoids sammen med mellomprodukter fra riboflavin biosyntese vei å syntetisere kobalamin . ZH-chloro-G3 mag inneholder en nesten fullstendig kobalamin berging (bare mangler CobC) og riboflavin biosyntese pathway (Tilleggsfil 3: Tabell S2).

Flagellar montering gener var til stede i flere MAGs AV CL500-11 og TK10 klynger (Fig. 1 Og Tilleggsfil 3: Tabell S2). Imidlertid manglet L – og P-ringkomponentene som forankrer flagella til den ytre membranen i alle flagellerte MAGs og referansegenomer Av Klorflexi (F.Eks. Thermomicrobium , Sphaerobacter). I Tillegg, MAGs og referanse Chloroflexi genomer ikke kode gener for lps biosyntese og ingen sekresjon systemer, bortsett Fra Sec Og Tat, ble detektert (type I-IV sekresjon systemer som er forankret i den ytre membran er fraværende) (Tilleggsfil 3: Tabell S2). Tatt sammen, komparativ genomikk av Tilgjengelige Chloroflexi genomer styrke slutninger at mens elektronmikrografer foreslå to elektron tette lag i de fleste medlemmer av denne rekke, Chloroflexi sannsynlig ha en enkelt lipid membran (monoderm) i stedet for to (diderms).

Rhodopsin-lignende sekvenser ble gjenkjent i 18 MAGs av denne studien fra representanter FOR CL500-11, Klorfleksi, SL56 OG TK10 som er fylogenetisk nærmest xanthorhodopsiner (Tilleggsfil 1: Figur S8A Og B), og er innstilt for å absorbere grønt lys lik andre ferskvann og kyst rhodopsins (Tilleggsfil 1: Figur S8C). Flere MAGs koder gener for karotenoidbiosyntese, slik at muligheten for en karotenoidantenne som er kjennetegnet for xanthorhodopsiner . Av restene involvert med binding salinixanthin (den dominerende karotenoid Av Salinibacter ruber), fant vi et overraskende høyt antall konservert (10 identisk ut av 12 i minst en rhodopsinsekvens) (Tilleggsfil 1: Figur S8D), noe som tyder på at en karotenoidantenne kan bindes, noe som gjør minst noen av disse sekvensene bonafide xanthorhodopsins.

selv representanter FOR CL500 – 11 OG TK10 som hovedsakelig finnes i hypolimnion under stratifisering, er i stand til fototrofi; de kan imidlertid potensielt få tilgang til photic zone om vinteren og tidlig vår mixis. Bortsett fra rhodopsin-basert photoheterotrophy, vi også hentet MAGs av klassen Chloroflexia koding gener for photosystem TYPE II reaksjon sentrum proteiner L OG M (pufL og pufM), bacteriochlorophyll, og karotenoid biosyntese. PufM-gensekvensene klynger sammen med andre Klorflexi-relaterte pufM-sekvenser (Tilleggsfil 1: Figur S9). Imidlertid ble det ikke funnet bevis for karbonfiksering, enten via 3-hydroksypropionatveien eller Calvin–Bensonsyklusen i noe fotosystem som bærer MAG som kan være en konsekvens av mag ufullstendighet. Det kan også være at disse er aerobe anoksygene fototrofer som ikke fikser karbon, f .eks.

Evolusjonær historie av pelagisk Klorflexi

det fremgår av fylogenomiske analyser at samlingen av representanter For phylum Chloroflexi gjenvunnet i dette arbeidet, sammen med de eksisterende genomsekvensene fra isolater Og MAGs, bare gir en delvis skisse av den komplekse evolusjonære historien til phylum som helhet. For eksempel, de mest divergerende grener » Ca. Limnocylindria «(sl56 klynge) Og » Ca. Umbricyclopia «(tk10 klynge) har praktisk talt ingen nær familie bortsett fra en akvifer sediment MAG (relatert Til » Ca. Limnocylindria»). Imidlertid har relaterte 16s rRNA kloner blitt gjenvunnet fra jord/sedimenter for begge disse gruppene, noe som tyder på overganger til en pelagisk livsstil (Tilleggsfil 1: Figur S1B).

Faktorisering av fraværet av relaterte marine 16s rRNA-sekvenser for disse gruppene, i tillegg til deres uoppdagelighet i marine metagenomiske datasett, antyder også et forfedre fra jord / sediment i stedet for saltvannsmiljøet. Selv om muligheten for en marin opprinnelse ikke formelt kan utelukkes, synes retningen av en overgang fra jord / sediment til ferskvannssøyler mest sannsynlig. Videre, gitt At » Ca. Limnocylindria » Og » Ca. Umbricyclopia «divergerer før divergensen Av klassene Dehalococcoidea og marine SAR202 (klasse» Ca. Monstramaria»), som er den eneste økologisk relevante marine Chloroflexi kjent som ennå (den førstnevnte i marine sedimenter og sistnevnte i dyphavs vannsøyle), er det sannsynlig at forfedrenes Chloroflexi oppsto i en jord/sediment habitat. Suksessen til marine SAR202 i de dype havene er bemerkelsesverdig; det er den mest distribuerte, kanskje numerisk mest tallrike Chloroflexi-gruppen på planeten. Imidlertid har noen 16s rRNA-sekvenser fra sine nærmeste slektninger, Dehalococcoidea, også blitt gjenvunnet fra ferskvannssedimenter, selv om det store flertallet ser ut til å være fra dype marine sedimenter (begge anoksiske habitater).