Sirkulerende tumor DNA

pre-analytiske betraktningerrediger

når blod samles I EDTA-rør og lagres, begynner de hvite blodcellene å lyse og frigjør genomisk villtype DNA i prøven i mengder som vanligvis er mange ganger høyere enn ctDNA er tilstede i. Dette gjør deteksjon av mutasjoner eller andre ctDNA biomarkører vanskeligere. Bruk av kommersielt tilgjengelige cellestabiliseringsrør kan forhindre eller forsinke lysis av hvite celler og dermed redusere fortynningseffekten av ctDNA. Sherwood et al demonstrert overlegen påvisning AV KRAS mutasjoner i matchet prøver samlet i BÅDE EDTA K3 OG Streck BCT rør. Fordelene med cellestabiliseringsrør kan realiseres i situasjoner der blod ikke umiddelbart kan bearbeides til plasma.

Andre prosedyrer kan også redusere mengden AV» forurensende » villtype DNA og gjøre deteksjon av ctDNA mer mulig:

• frys aldri en blodprøve før du trekker ut plasmaet for ctDNA-analyse
• Behandle prøven til plasma innen 2-4 timer (hvis den samles INN I EDTA-rør)
• bruk ALDRI hepariniserte rør, heparin hemmer PCR Ved å etterligne den spiralformede strukturen TIL DNA
• Utfør et dobbelt sentrifugeringstrinn (sentrifugering av blodet for å fjerne plasma, og gjenta deretter på plasma for å fjerne fra rusk i bunnen av røret) for å fjerne mer cellulært rusk før dna-ekstraksjon.
• Plasma er bedre enn serum for ctDNA utvinning

Ekstraksjon av ctDNAEdit

hovedappellen til ctDNA-analysen er at den ekstraheres på en ikke-invasiv måte gjennom blodinnsamling. Oppkjøp av cfDNA eller ctDNA krever vanligvis innsamling av omtrent 3 ml blod i EDTA-belagte rør. BRUK AV EDTA er viktig for å redusere koagulering av blod. Plasma – og serumfraksjonene av blod kan separeres gjennom et sentrifugeringstrinn. ctDNA eller cfDNA kan deretter ekstraheres fra disse fraksjonene. Selv om serum har en tendens til å ha høyere nivåer av cfDNA, tilskrives dette primært DNA fra lymfocytter. Høye nivåer av kontaminerende cfDNA er suboptimale fordi dette kan redusere følsomheten til ctDNA-deteksjon. Derfor bruker de fleste studier plasma for ctDNA-isolasjon. Plasma behandles deretter igjen ved sentrifugering for å fjerne gjenværende intakte blodceller. Supernatanten brukes TIL DNA-ekstraksjon, som kan utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett.

Analyse av ctDNAEdit

analysen av ctDNA etter ekstraksjon krever bruk av ulike forsterknings-og sekvenseringsmetoder. Disse metodene kan deles inn i to hovedgrupper basert på om målet er å forhøre alle gener i en målrettet tilnærming, eller om målet er å overvåke spesifikke gener og mutasjoner i en målrettet tilnærming.

Ikke-Målrettede tilnærmingerrediger

et helt genom eller hele eksomsekvenserende tilnærminger kan være nødvendig for å oppdage nye mutasjoner i tumor-DNA mens man overvåker sykdomsbyrden eller sporer legemiddelresistens. Ikke-målrettede tilnærminger er også nyttige i forskning for å observere tumor heterogenitet eller å oppdage nye legemiddelmål. Men mens ikke-målrettede metoder kan være nødvendige i visse applikasjoner, er det dyrere og har lavere oppløsning. Dette gjør det vanskelig å oppdage sjeldne mutasjoner, eller i situasjoner hvor lave ctDNA-nivåer er tilstede (for eksempel minimal gjenværende sykdom). Videre kan det være problemer med å skille MELLOM DNA fra tumorceller og DNA fra normale celler ved hjelp av en hel genomtilnærming.

Hele genom-eller eksomsekvensering bruker VANLIGVIS DNA-sekvenseringsteknologier med HØY gjennomstrømning. Begrense sekvensering til bare hele exome i stedet kan redusere utgifter og øke hastigheten, men på bekostning av å miste informasjon om mutasjoner i ikke-koding regulatoriske regioner AV DNA. Mens du bare ser PÅ DNA-polymorfier gjennom sekvensering, skiller IKKE DNA FRA tumor eller normale celler, dette problemet kan løses ved å sammenligne mot en kontrollprøve av normalt DNA (FOR EKSEMPEL DNA oppnådd gjennom en bukkalpinne.) Det er viktig at hele genomet og hele eksomsekvensering er nyttige for første mutasjonsoppdagelse. Dette gir informasjon for bruk av mer sensitive målrettede teknikker,som deretter kan brukes til sykdomsovervåking.

hele genomsekvensering gjør det mulig å gjenopprette de strukturelle egenskapene til cfDNA, størrelsen på fragmenter og deres fragmenteringsmønstre. Disse unike mønstrene kan være en viktig kilde til informasjon for å forbedre deteksjonen av ctDNA eller lokalisere opprinnelsesvevet til disse fragmentene. Størrelse-valg av korte fragmenter (< 150bp) med in vitro eller i silico metoder kan forbedre utvinningen av mutasjoner og kopi nummer aberrasjoner.

Digital KaryotypingEdit

denne metoden ble opprinnelig utviklet av laboratoriet Til Bert Vogelstein, Luis Diaz og Victor Velculescu Ved Johns Hopkins University. I motsetning til normal karyotyping hvor et fargestoff brukes til å flekke kromosomale bånd for å visualisere kromosomene, bruker digital karyotyping DNA-sekvenser av loci gjennom genomet for å beregne kopi nummer variasjon. Kopier nummervariasjoner er vanlige i kreftformer og beskriver situasjoner der tap av heterozygositet av et gen kan føre til redusert funksjon på grunn av lavere uttrykk, eller duplisering av et gen, noe som fører til overuttrykk.

Personlig analyse av omarrangerte ender (PARE)Edit

etter at hele genomet er sekvensert ved hjelp av en høy gjennomstrømning sekvensering metode, slik Som Illumina HiSeq, PARE brukes på data for å analysere kromosom rearrangements og translokasjoner. Denne teknikken ble opprinnelig utviklet for å analysere solid tumor DNA, men ble modifisert for ctDNA applikasjoner.

DNA-Metylering Og Hydroksymetyleringrediger

Riktig epigenetisk merking er viktig for normal genuttrykk og cellefunksjon, og avvikende endringer i epigenetiske mønstre er et kjennetegn på kreft. En normal epigenetisk status opprettholdes i en celle i det minste delvis GJENNOM DNA-metylering. Måling av avvikende metyleringsmønstre i ctDNA er mulig på grunn av stabil metylering AV DNA-REGIONER referert til som «cpg-øyer». Metylering av ctDNA kan påvises ved bisulfittbehandling. Bisulfittbehandling omdanner kjemisk ikke-metylerte cytosiner til uracil, mens metylerte cytosiner forblir umodifiserte. DNA blir deretter sekvensert, og eventuelle endringer I DNA-metyleringsmønsteret kan identifiseres. DNA-hydroksymetylering ER et tilsvarende assosiert merke som har vist seg å være en prediktiv markør for sunne versus syke tilstander i cfDNA, inkludert kreft. Måling av avvikende hydroksymetyleringsmønstre i ctDNA har blitt bevist av forskere ved University Of Chicago (Chuan He lab) Stanford University (Quake lab) og Selskapet Cambridge Epigenetix.

Målrettet approachesEdit

i en målrettet tilnærming kan sekvensering av ctDNA rettes mot et genetisk panel konstruert basert på mutasjonelle hotspots for kreft av interesse. Dette er spesielt viktig for å informere behandling i situasjoner der mutasjoner er identifisert i druggable mål. Det er også mulig å tilpasse målrettet analyse av ctDNA til hver pasient ved å kombinere væskebiopsier med standard primære vevsbiopsier. Hele genomet eller hele eksomsekvensering av primærtumorbiopsi gjør det mulig å oppdage genetiske mutasjoner som er spesifikke for pasientens tumor, og kan brukes til etterfølgende målrettet sekvensering av pasientens ctDNA. Den høyeste sensitiviteten til ctDNA-deteksjon oppnås gjennom målrettet sekvensering av spesifikke single nucleotide polymorphisms (SNPs). Vanlige muterte gener, som onkogener, som vanligvis har hotspot-mutasjoner, er gode kandidater for målrettede sekvenseringsmetoder. Omvendt har de fleste tumorsuppressorgener et bredt spekter av mulige tap av funksjonsmutasjoner gjennom hele genet, og som sådan er de ikke egnet for målrettet sekvensering.

Målrettede tilnærminger har fordelen av å forsterke ctDNA gjennom polymerasekjedereaksjoner (PCR) eller digital PCR. Dette er spesielt viktig når man analyserer ctDNA, ikke bare fordi det er relativt lave NIVÅER AV DNA som sirkulerer i blodet, men også fordi ctDNA utgjør en liten andel av det totale cellefrie DNA ekstrahert. Derfor kan forsterkning av interesseområder drastisk forbedre følsomheten til ctDNA-deteksjon. Imidlertid kan forsterkning GJENNOM PCR introdusere feil gitt den iboende feilfrekvensen AV DNA-polymeraser. Feil introdusert under sekvensering kan også redusere følsomheten for å oppdage ctDNA-mutasjoner.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Edit

denne metoden er avledet fra digital PCR, opprinnelig navngitt Av Bert Vogelstein gruppe Ved Johns Hopkins University. Droplet Digital PCR benytter en dråpegenerator for å partisjonere enkeltbiter AV DNA i dråper ved hjelp av en olje / vannemulsjon. Deretter oppstår individuelle polymerasekjedereaksjoner i hver dråpe ved bruk av utvalgte primere mot regioner av ctDNA og fortsetter til endepunkt. Tilstedeværelsen av sekvensene av interesse måles av fluorescerende prober, som binder seg til den forsterkede regionen. ddPCR tillater svært kvantitativ vurdering av allel og mutantfrekvenser i ctDNA, men er begrenset av antall fluorescerende prober som kan brukes i en analyse (opptil 5). Sensitiviteten til analysen kan variere avhengig AV MENGDEN DNA analysert og er rundt 1 av 10.000.

Perler, Emulgering, Amplifikasjon, Og Magnetics (BEAMing)Edit

denne teknikken bygger På Dråpe Digital PCR for å identifisere mutasjoner i ctDNA ved hjelp av flowcytometri. Etter at ctDNA er ekstrahert fra blod, UTFØRES PCR med primere designet for å målrette mot interessegruppene. Disse primere inneholder også spesifikke DNA-sekvenser, eller koder. Det forsterkede DNA blandes med streptavidin-belagte magnetiske perler og emulgeres til dråper. Biotinylerte primere designet for å binde seg til kodene brukes til å forsterke DNA. Biotinylering tillater det forsterkede DNA å binde seg til magnetiske perler, som er belagt med streptavidin. ETTER AT PCR er fullført, separeres DE DNA-bundet perlene ved hjelp av en magnet. DNA på perlene blir deretter denaturert og tillatt å hybridisere med fluorescerende oligonukleotider som er spesifikke for HVER DNA-mal. De resulterende perle-DNA-kompleksene analyseres deretter ved hjelp av flowcytometri. Denne teknikken er i stand til å fange allel og mutasjonsfrekvenser på grunn av kobling med ddPCR. I motsetning til ddPCR kan imidlertid ET større ANTALL DNA-sekvenser bli forhørt på grunn av fleksibiliteten ved bruk av fluorescentbundne prober. En annen fordel med dette systemet er AT DET ISOLERTE DNA også kan brukes til nedstrøms sekvensering. Følsomhet er 1,6 i 104 til 4,3 i 105.

Personlig Profilering Av Kreft ved dyp Sekvensering (CAPP-Seq)Rediger

denne metoden ble opprinnelig beskrevet Av Ash Alizadeh og Maximilian Diehns grupper ved Stanford University. Denne teknikken bruker biotinylerte oligonukleotidvelgerprober for å målrette sekvenser AV DNA som er relevante for ctDNA-deteksjon. Offentlig tilgjengelige kreftdatabaser ble brukt til å konstruere et bibliotek med prober mot tilbakevendende mutasjoner i kreft ved å beregne deres gjentakelsesindeks. Protokollen ble optimalisert for de lave DNA-nivåene som ble observert i ctDNA-samlingen. Deretter gjennomgår det isolerte DNA dyp sekvensering for økt følsomhet. Denne teknikken tillater forhør av hundrevis AV DNA-regioner. Ctdna-deteksjonsfølsomheten til CAPP-Seq er rapportert å være 2,5 molekyler i 1.000.000.

Merket AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq)Rediger

TAM-Seq tillater målrettet sekvensering av hele gener for å oppdage mutasjoner i ctDNA. Først utføres et generelt forsterkningstrinn ved bruk av primere som spenner over hele genet av interesse i 150-200bp-seksjoner. Deretter brukes et microfluidics-system til å feste adaptere med en unik identifikator til hver amplicon for ytterligere å forsterke DNA i parallelle singleplex-reaksjoner. Denne teknikken ble vist å kunne identifisere mutasjoner spredt I tp53 tumor suppressor genet i avanserte eggstokkreft pasienter. Følsomheten til denne teknikken er 1 i 50.

Sikker-Sekvensering (Safe-Seq)Rediger

denne metoden ble opprinnelig beskrevet Av Bert Vogelstein og hans gruppe Ved Johns Hopkins University. Safe-Seq reduserer feilfrekvensen for massivt parallell sekvensering for å øke følsomheten for sjeldne mutanter. Det oppnår dette ved tillegg av en unik identifikator (UID) sekvens til HVER DNA-mal. DNA forsterkes deretter ved hjelp av de tilsatte Uider og sekvensert. ALLE DNA-molekyler med samme uid (en uid-familie) bør ha samme rapporterte DNA-sekvens siden de ble forsterket fra ett molekyl. Mutasjoner kan imidlertid innføres gjennom forsterkning, eller feil base oppdrag kan kalles i sekvensering og analyse trinn. Tilstedeværelsen AV UID gjør at disse metodiske feilene kan skilles fra ekte mutasjoner av ctDNA. En mutasjon regnes som en ‘supermutant’ hvis 95% av sekvensert leser er enige. Følsomheten til denne tilnærmingen er 9 i 1 million.

duplex sequencingEdit

denne metoden er en forbedring på de enkle Uid-ene som er lagt til I Safe-Seq-teknikken. I duplekssekvensering fungerer randomisert dobbeltstrenget DNA som unike koder og er festet til en invariant spacer. Kodene er knyttet til begge ender av et DNA-fragment (α-og β-kodene), som resulterer i to unike maler for PCR – en strand med en α-tag-en på 5′ – enden og en β-tag-en på 3′ – enden og den andre strand med en β-tag-en på 5′ – enden og en α-tag-en på 3′ – enden. DISSE DNA-fragmentene forsterkes deretter med primere mot de invariante sekvensene av kodene. Det forsterkede DNA blir sekvensert og analysert. DNA med dupleksadaptere sammenlignes og mutasjoner aksepteres bare hvis det er enighet mellom begge strengene. Denne metoden tar hensyn til både feil fra sekvensering og feil fra TIDLIG STADIUM PCR forsterkning. Følsomheten til tilnærmingen til å oppdage mutanter er 1 i 10^7.

Integrated Digital Error Suppression (iDES)-forbedret CAPP-SeqEdit

iDES forbedrer capp-Seq analyse av ctDNA for å redusere feil og dermed øke følsomheten for deteksjon. Rapportert i 2016, kombinerer iDES CAPP-Seq med duplex barcoding sekvensering teknologi og med en beregningsalgoritme som fjerner stereotype feil knyttet TIL capp-Seq hybridisering trinn. Metoden integrerer også tosidig sekvensering der det er mulig, og inkluderer metoder for mer effektiv tosidig gjenoppretting fra cellefritt DNA. Følsomheten til denne forbedrede versjonen AV CAPP-Seq er 4 i 100.000 eksemplarer.