Sammenlignende måling av CNP og NT-proCNP i humane blodprøver: en metodisk evaluering

Introduksjon

c-type natriuretisk peptid (CNP), identifisert i 1990 Av Sudoh et al., er det eldgamle medlemmet av natriuretisk peptidfamilien . CNP stimulerer selektivt den humane natriuretiske peptidreseptoren 2 (NPR2), som aktiverer den cGMP-avhengige kinasen (cGK) ved å heve intracellulær konsentrasjon av cGMP . I tillegg binder CNP NPR3 og deaktiverer i sin tur proteinkinase A ved Gi-proteinavhengig hemming av adenylatsyklase . CNP har antiproliferative og anti-migrerende egenskaper og ble også identifisert som en endotelavledet avslappende faktor . VIDERE hemmer CNP neointimal restenose, reduserer vaskulær constrictive remodeling og hjerte iskemi-reperfusjon skade . CNP spiller en viktig rolle i beinvekst, reproduksjon, nervevekst, reendotelialisering, samt nyre -, bukspyttkjertel – og hjertefunksjon . I tillegg har CNP nylig blitt anerkjent for å være involvert i utviklingen av aterosklerotisk plakkdannelse .

på grunn AV overflod AV CNP-funksjoner har dette peptidet oppnådd økende interesse for kardiovaskulær forskning de siste årene. Studier av CNP-konsentrasjoner i blodprøver er imidlertid inkonsekvente. Noen av disse studiene målte konsentrasjoner AV CNP eller dets amino-terminal pro-peptid (NT-proCNP) i serumprøver og andre brukte plasmaprøver . Dessverre er det ennå ikke rapportert detaljer om mulige forsinkelser under blodprøvetaking og påfølgende prøvebehandling. I den tilgjengelige litteraturen så langt finnes det ingen data på forskjellen MELLOM cnp / NT-proCNP-konsentrasjoner mellom serum og plasmaprøver. Også innflytelsen av forsinkelsen av blodprøvebehandling forblir uklar. I tillegg varierte CNP-konsentrasjonen i serum-og plasmaprøver markant (Tabell 1). Derfor var målet med denne studien å svare på følgende metodologiske spørsmål: (1) forårsaker forsinket behandling av blodprøver lagret ved romtemperatur skjevhet? (2) er det noen forskjell mellom serum og plasmakonsentrasjoner AV CNP eller NT-proCNP? (3) Er disse forskjellene tidsavhengige?

Metoder

vi studerte 12 frivillige menn(gjennomsnittsalder 29 ± 2 år, normalvekt, ingen medikamentell behandling, ingen tidligere kardiovaskulære eller andre sykdommer, 3 røykere). Fra alle undersøkte fag ble informert samtykke innhentet. Tripletter av fastende blodprøver ble tatt fra alle frivillige klokka 8 om morgenen. Blodprøver ble tatt ved bruk av 7,5 ml s-Monovette® innsamlingssystem (Sarstedt, Nübrecht, Tyskland) som enten inneholdt koagulasjonsaktivator (Kaolin) for serumprøver, natriumsitrat for plasmaprøver eller Kalium-EDTA for fullblodsprøver. Alle prøver for baseline-analyser ble umiddelbart sentrifugert ved 2 000 × g i 10 min ved 4°C og supernatant ble lagret ved -70°C til analyse. Ved midtveisanalyser (30 minutter eller 2 timer) ble plasmaprøver sentrifugert ved 2000 × g i 10 minutter ved romtemperatur. Supernatant ble fjernet og lagret ved romtemperatur i 30 min eller 2 timer. Etter blodpropp ble serumprøver behandlet identisk med plasmaprøver. Supernatant ble lagret og lagret også ved romtemperatur i 30 min eller 2 timer. Hele blodprøver ble lagret ved romtemperatur uten sentrifugering. Etter 30 min eller 2 timer ble fullblodsprøver sentrifugert ved 2 000 × g i 10 min ved 4°C. Supernatant ble fjernet og lagret ved -70°C til analyse. Konsentrasjonen AV CNP ble målt ved BRUK AV CNP-22 EIA-Settet (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. NT-proCNP-konsentrasjonen ble målt ved HJELP AV NT-proCNP EIA-Settet (Biomedica, Wien, Østerrike) i henhold til produsentens protokoll. Enveis ANOVA ble brukt til sammenligning mellom grupper. For parvise sammenligninger ble t-testen anvendt. Data er vist som middel ± standardavvik (SD) eller 95% konfidensintervall (95%-KI). Statistisk signifikans ble antatt ved p < 0,05. Data ble analysert ved bruk av MedCalc® For Windows, Versjon 10.0.1.0 (Medcalc Software, Mariakerke, Belgia).

Resultater

som vist i Figur 1a var baseline konsentrasjoner av CNP i serum, plasma og fullstendige blodprøver henholdsvis 0,997 ± 0,379 ng/ml, 1,933 ± 0,699 ng/ml og 0,991 ± 0,489 ng/ml. Plasmakonsentrasjonen av CNP var signifikant høyere sammenlignet med serum og fullblodsprøver ved alle tidspunkter (ANOVA , p = 0,001 ved baseline, p < 0,001 ved 30 ‘ min. og p = 0,003 ved 120 ‘ min.). Ingen signifikant forskjell ble observert mellom serum og fullblodsprøver på noe tidspunkt (ANOVA, p > 0,05). Baseline konsentrasjoner av NT-proCNP i serum -, plasma-og fullblodsprøver var henholdsvis 58,5 ± 28,3 pg/ml, 60,3 ± 23,9 pg/ml og 50,7 ± 21,4 pg/ml (Figur 1b). Ingen signifikant forskjell ble funnet mellom gruppene på noe tidspunkt (ANOVA, p > 0,05). I fullblodsprøver økte konsentrasjonen av laktat signifikant etter 2 timer sammenlignet med baseline verdi (3,2 ± 0,8 mM vs. 2,0 ± 0,6 mM, p < 0,001). I tillegg ble pH-verdien redusert fra 7.34 ± 0.03 ved baseline til 7,29 ± 0,03 etter 2 timer (p < 0,001).

Diskusjon

vår studie viste At CNP og NT-proCNP er stabile i serum og i fulle blodprøver i minst to timer ved romtemperatur. Følgelig er stabiliteten TIL cnp-peptidet sannsynligvis ikke påvirket av noen forsinkelse i prøvebehandling i minst to timer. ProCNP er allerede rapportert (produsentens protokoll, ukjente lagringsforhold for blodprøver) for å være stabil i minst 2,5 timer. Følgelig bekreftet våre eksperimenter stabiliteten TIL NT-proCNP selv ved romtemperatur. Konsentrasjonen AV NT-proCNP i alle prøvetyper holdt seg konstant i løpet av tiden i opptil 2 timer, noe som indikerer langvarig stabilitet av dette proteinet. Som listet i Tabell 1 er gjennomsnittlig konsentrasjon AV NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg/ml) målt i denne studien var innenfor det rapporterte området (Se Tabell 1) av friske individer (3,7-432 pg/ml).

i motsetning TIL NT-proCNP var konsentrasjonen av CNP signifikant høyere i plasmaprøver sammenlignet med serum og fullblodsprøver (Figur 1). Så langt har verken vår gruppe eller produsentens tekniske tjeneste funnet noe bevis for påvirkning av prøvetype på ELISA-analysen som ble brukt i denne studien. Ved baseline var imidlertid supernatant av plasma og fullblodsprøver identiske, med unntak av den type blodkoaguleringshemmer som ble brukt. Denne inhibitoren var natriumsitrat i plasmagruppen og EDTA i full blodprøvegruppe. Fullblodsprøver viste sammenlignbare resultater med serumprøver (p = 0,98). Derfor er det mest sannsynlig at natriumsitrat kan påvirke den målte konsentrasjonen av CNP i plasma betydelig og dermed forfalske resultatene oppnådd ved denne teknikken.

uventet var baseline-konsentrasjoner AV CNP i både plasma – og serumprøver omtrent tusen ganger høyere enn i andre rapporter (Tabell 1). I alle disse studiene Ble Radioimmunoassay (Ria-Kit) brukt til bestemmelse av CNP-konsentrasjoner. I to andre studier var DERIMOT de målte CNP-konsentrasjonene i serum-og plasmaprøver sammenlignbare med våre resultater med hensyn til størrelsen på dimensjonen . Interessant, i sistnevnte studier ble det samme ELISA-Settet brukt som i vår undersøkelse. Selv etter omfattende evaluering av ulike interne og eksterne faktorer, ble det ikke funnet noen tilfredsstillende forklaring på dette avviket. Kontrollmålinger ved bruk av eksogent CNP i humant serum viste en ikke-signifikant målefeil på +7,8% (95%-KI: –). CNP-peptidet som ble brukt til referansekurven ble syntetisert av produsenten selv (Phoenix). I kontrast ble CNP-peptidet brukt som «eksogen» kontroll levert av Bachem. Som sikret av begge produsentene var sekvenser av aminosyrer identiske og disulfidbindinger ble dannet i begge peptidene.

resultatene av interne kontrollmålinger kan imidlertid oppsummeres som følger: For det første viste kontrollmålingene som ble utført i vår studie at ELISA-settene ble brukt riktig, i samsvar med produsentens instruksjoner. For det andre bekreftet målinger ved hjelp av kontrollprøver egnetheten til standardkurven som ble brukt. For det tredje viste kontrollserumprøver som inneholdt eksogen CNP akseptabel nøyaktighet og resultatene var innenfor forventet størrelsesorden. For det fjerde er en høyere konsentrasjon AV CNP i plasmaprøver mest sannsynlig en artefakt forårsaket av natriumsitrat.

Som Rapportert Av Clerico og medarbeidere, er sammenlignbare store forskjeller i resultater mellom ULIKE ria-og EIA-metoder også kjent for, for EKSEMPEL ANP og BNP . Clerico og medarbeidere konkluderte med at de store forskjellene i disse resultatene mest sannsynlig skyldes spesifisiteten til monoklonale eller polyklonale antistoffer som brukes, utformingen av immunanalysesystem (konkurransedyktig vs ikke-konkurransedyktig analyse), den analytiske matrisen (serum vs EDTA vs heparinisert plasma) som brukes, og mengden sirkulerende former for natriuretiske peptider, som tidligere rapportert FOR ANP og BNP immunoassays . Disse metodiske kildene til bias kan også tenkes for cnp-og nt-proCNP-analyser og dermed forklare den store forskjellen i resultatene i de siterte studiene (Tabell 1).

Begrensninger av studien

vi erkjenner at en prøvestørrelse på 12 er for liten til å konkludere med at det ikke er noen forskjell i det hele tatt. Men fra et statistisk synspunkt vil det være viktig å spesifisere hvor stor forskjellen må være for å være av medisinsk relevans. Etter vår kunnskap er sistnevnte ennå ikke klart definert. Derfor ble midler og 95% konfidensintervaller av alle tiltak gitt i figuren for å gjøre det mulig for hver leser å tegne sin egen tolkning fra dataene også.

når det gjelder serum-og plasmakonsentrasjoner, må det nevnes at verdiene rapportert I Tabell 1 ble målt med ulike metoder (RIA, ELISA) hos pasienter med ulike sykdommer. Det ville vært veldig nyttig å sammenligne CNP-ria med cnp-ELISA-analyser ved å bruke de samme prøvene, fordi en tusen ganger forskjell i størrelsesorden forblir merkbar. Dessverre var RIA-analysemålinger ikke tilgjengelige i vårt laboratorium. For nt-proCNP-konsentrasjonen ble Sistnevnte sammenligning undersøkt av Olney og medarbeidere som viste at den kommersielle ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Wien, Østerrike) ga verdier som i gjennomsnitt var 21% (område 11-52%) AV ria-verdiene. Kryssvalidering av referansestandarden FOR ELISA-settet ved BRUK AV ria-analyse viste en uenighet på 15% .

Sammendrag

Målinger av CNP og NT-proCNP var mest sannsynlig upåvirket av forsinkelse av prøveprosesjon eller type blodprøve (unntatt CNP i plasmaprøver). For plasmaprøver var KUN EDTA antikoagulerte blodprøver egnet for CNP ELISA-analysen som ble brukt i denne studien. Følgelig kan konsentrasjonen AV CNP og NT-proCNP brukes i kliniske anvendelser for å bestemme CNP-effekter. Det bør også tas i betraktning at konsentrasjonen AV NT-proCNP, som bare er et biprodukt av det aktive peptidet, kan skjule CNP ‘ s sanne natur. Avvik i målte CNP-konsentrasjoner bestemt enten VED ria-analyser eller VED ELISA-analyser er imidlertid fortsatt uforklarlig, men synes mest sannsynlig å skyldes metodologiske problemer. Derfor , som anbefalt FOR ANP og BNP, må immunoassays for CNP også standardiseres eller harmoniseres i fremtiden.