Rollen av chordin / bmp signaler i pattedyrs pharyngeal utvikling og DiGeorge syndrom | Utvikling

RESULTATER

Gastrulasjonsdefekter I Chrd-/- mus

Chrd-utskilt Bmp-bindende protein uttrykkes i museknuten andits derivater, notochord og pharyngeal endoderm(Fig. 1A-F). Chrd-proteinet inneholder fire cysteinrike (CR) domener, som alle er i stand til å binde Bmp.CR1 og CR3 viser den høyeste affiniteten for Bmp4, og kan motvirke bmp-signalerpå mRNA-injeksjon i Xenopus-embryoer(Larrain et al., 2000). Togenerate en null allel Av Chrd, vi utarbeidet en målretting constructwith oversettelse stoppe kodoner i de tre mulige leserammer innenfor signal peptid regionen. Stoppkodonene ble etterfulgt av en frameshift og innsetting, ETTER CR1, AV IRES-lacZ og PGK-neo kassetter som videredisrupted Chrd genet (Fig.1G). Transkripsjoner fra Dette Chrdtm1DR-allelet (heretter Referert Til Som Chrd-) var uoppdagelige inChrd – / – embryoer på knutepunktet (Fig. 1J, pilspiss).

Heterozygote Chrd-mus var levedyktige og fruktbare og ble parret tilogenerate Chrd – / – embryoer av ulike utviklingsmessige stages.At Dag E8.5, observerte vi tilstedeværelsen av resorpsjon knuter i livmoren avgravide kvinner og en liten reduksjon i forventet antallchrd – / – embryoer(50 gjenvunnet, 57 forventet). Fourgenotype homozygote mutantembryoer viste en klar reduksjon i størrelsen påden embryonale regionen, ledsaget av en utvidelse av allantois medrespekt på resten av embryoet(Fig.2A, A’). I histologiske seksjoner, en betydelig hypoplasiav nevralplaten(Fig.2B, B’), fravær av somites og notochord (Fig. 2c, C’), og anabundans av ekstra-embryonale mesodermale celler i allantois(Fig. 2D, D’) varobservert. Resten av mutantene (46) var morfologisk uutslettelige fra deres heterozygote og villtype kullmates. Fenotypen av fourabnormale mutanter var lik, men mindre uttalt enn, den buktralisering av mesoderm observert i dobbelt homozygot Chrd; Nogmutants (Bachiller et al.,2000) der i tillegg var fremre avkortinger av nevralplaten også tilstede.

I sebrafisk og Xenopus, inaktivering Av Chrd forårsaker anexpansion av ventral mesoderm og reduksjon av dorsal mesoderm og neuralplate (Schulte-Merker et al.,1997). I pattedyr dannes mesodermen under gastrulasjon vedinntrykk av epiblastceller gjennom den primitive streken. Celler som går ut på den bakre enden av den primitive streken beveger seg inn i den ekstra-embryonale regionen hvor de gir opphav til en mesodermal avstamning (allantois, amnion og bloodislands av plommesekken) tilsvarende ventral mesoderm ofXenopus. Derimot er celler som ligger i flere fremre områder avstreak forbli inne i embryoet riktig og produsere paraksial, mellomliggendeog lateral plate mesoderm av fremtiden stammen. Den tidlige fenotypen avchrd – / – mutanter, hvor allantois er utvidet vedutfall av embryonale mesoderm, er i samsvar med en tidlig ventralizationav musembryoen. Denne fenotypen må føre til død av de berørtedyr, da ingen homozygot mutant med unormal allantois ble gjenopprettet fradisseksjoner i senere stadier. Analyse av denne fenotypen med molekylærmarkørerble ikke utført fordi så få unormale embryoer ble oppnådd.

Perinatal dødelighet

Bare 49% (95 av 194) av De forventede Chrd-/-dyrene ble gjenfunnet ved fødselen, alle med samme penetrantfenotype. Av disse var flertallet dødfødt, men noen få forsøkte, uten hell, å blåse opp lungene. Eksternt, homozygote mutant neonatervar litt mindre enn deres villtype kullmates og viste cyanose, mikrocefali og reduksjon av det ytre øret, som ble satt unormalt nærttil øyet (Fig . 3A’).Histologisk undersøkelse (Fig.3B’-C’) avslørte mangelen på thymus (t, et derivativav den tredje pharyngeal pouch) og sekundær gane (p), og hypoplasia av det indre øret (ie) i mutantene. Anterior lobe og pars intermedia of thefituitary gland (pi), begge avledet fra dorsal oral ectoderm umiddelbartved siden av den cephalic grensen til den fremre endodermen, var normal (Fig. 3C, C’). Dette definerte rostralgrensen for fenotypen i oropharynx, medmalformasjoner begrenset til derivater Av Chrd-expressingendoderm. Skjoldbruskkjertelen, som danner i ventral pharyngeal endoderm ved theforamen caecum, differensierte, men var hypoplastisk og av uregelmessig form(Th, Fig. 3C’). Theparathyroidkjertler, derivater av pharyngeal pouches 3 og 4, var fraværende (data ikke vist), en observasjon i samsvar med neonatal hypokalcaemiaseen hos personer Med DiGeorge syndrom(DiGeorge, 1968). Vi konkludererat fenotypen Av Chrd – / – dødfødte mus rekapitulerer de fleste funksjonene beskrevet hos slike personer.

skjelettdefekter

i skjelettpreparater Av Chrd – / – nyfødte dyr var appendikulære og lumbale bein normale, men basen av skallen ogdet fremre aksiale skjelettet presenterte flere feil. Endringer itemporal bein inkludert mangel på squama temporalis (st) og forkorte ofthe zygomatic arch (Fig.4A, A’). Vi har også observert en betydelig hypoplasi av thehyoid bein og av skjoldbruskkjertelen og cricoid laryngeal brusk (Fig. 4B’), og anabnormalt liten kjeve (Fig.4C’). I bunnen av skallen var aliphenoid (as)normalt, men i midtlinjen ble basioccipital (bo) og basisphenoid(bs) bein smeltet sammen, og presphenoid (ps) var hypoplastisk(Fig. 4D, D’). Konsistentmed de histologiske funnene klarte palatinhyllene ikke å strekke seg medialtfor å danne den sekundære ganen. I øret, tympanisk ring og otisk kapselble redusert og misdannet (Fig.4D’). Skjelettmisdannelser ble også observert i livmorhalsenog thoracic regioner i vertebral kolonnen. Vertebrale legemer (vb) varmindre I Chrd – / – nyfødte (Fig. 4E’), med forsinkelsedosifikasjon og sporadisk tap av andre elementer i ryggvirvlene somspinøse prosesser, nevrale buer og den fremre buen på atlasen(Fig. 4E ‘ andFig. 5A’).

skjelettdefektene til Chrd-mutanter var allerede detekterbare incartilage kondensasjoner Ved E14.5 (Fig.5A, A’). I tillegg til å være en av de mest kjente av disse, er det også en del av det som kalles basioccipital og basisphenoid brusk.5B, B’). Det fremre notochordet, som var tilstede imidtlinje av villtype basioccipital, var fraværende I Chrd mutanter(Fig. 5B, B’). Fraværet av anterior notochord ble bekreftet ved histologisk undersøkelse av cervikal region Ved E14.5 (Fig.5F’).

beinene som er berørt av Chrd-mutasjonen, har svært forskjelligeopprinnelse. Den basioccipital er rent av somitic opprinnelse; deler av thebasisphenoid oppstå fra endokondrale ossification av cephalic mesenchyme; thepalatine stammer fra intramembranous ossification av nevrale crest-derivedmesenchyme; de otiske kapslene skiller seg fra en blanding av paraksiale mesodermand nevrale kamceller; og hyoid er strengt nevrale kam avledet(Le Douarin Og Kalcheim,1999). Midt i et slikt mangfold av linjer, synes det samlende prinsippet om fenotypen å være plasseringen av misdannede strukturer i nærhet Av Chrd-expressing axial mesendoderm(Fig. 1E). Denne tolkningen er i samsvar med den observerte for tidlig degenerasjon av anteriornotochord I Chrd – / – dyr, og med kravet ofprechordal plate og mesendoderm avledet signaler for utvikling avskjelett av hodet (Belo et al.,1998; Couly et al.,2002; David et al.,2002).

DiGeorge – lignende kardiovaskulære defekter

cyanosen observert ved fødselen kan være et tegn på hjertesvikt. For å undersøke dette videre, disseksjoner på forskjellige stadier av embryonalutvikling ble utført. På E14.5, hjertene tilchrd – / – dyr viste et enkelt fartøy, i stedet fornormale to, i hjerteutløpskanalen(Fig. 5D, D’, E, E’).Denne tilstanden er kjent hos mennesker som vedvarende truncus arteriosus og er viktig misdannelse hos personer Med DiGeorge syndrom. Mangelen påseparasjon mellom den stigende aorta og lungekroppen kan økearbeidsbelastningen til høyre ventrikel forårsaker hypertrofi, samt vasodilatasjon, ødem og blødning sett I e14.5 embryoer(Fig. 5C’). Som inDiGeorge syndrom, defekter i det kardiovaskulære systemet utvidet beyond theoutflow kanalen og inkluderte de store fartøy avledet fra svelget archarteries (Fig. 6). I nyfødtechrd mutanter, felles carotis direkte sluttet seg til truncusarteriosus, noe som resulterer i fravær av brachiocephalic arterien og en del avaortabuen (Fig. 6A-C).Lungearteriene stammer direkte fra den proksimale trunkusarteriosus, noe som resulterer i fravær av en felles lungestamme(Fig. 6A-C). I tillegg ble det observert lateralfeil, med en unormal høyre sving av aortain 40% av mutantene(Fig. 6, sammenlign 6Ewith 6F). Når disseksjoner ble utført fra baksiden, detkan sees at, avhengig av sidevirkningen av den nedadgående aorta, høyre eller venstre subklaviske arterier vedtok en unormal retroøsofagealposisjon (Fig . 6D-F). Similardefects har blitt beskrevet i chick embryoer med nevrale crest celler ablations(Kirby et al., 1983), og inmice bærer slettinger I DiGeorge congenic regionen(Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001) ormutasjoner I Tbx1 og Fgf8 (Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome Og Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al.( 2002b).

ved fødselen var bare 49% av de forventede Chrd homozygote mutantergjenoppdaget. Imidlertid var 48 av de forventede 56 (86%) Chrd-/-embryoene fortsatt i live i kull dissekert Ved E14.5, en frekvens som ikke var signifikant forskjellig fra den som ble observert Ved E8.5 (88%). Den kraftige økningeni dødelighet etter E14.5 sammenfaller med full manifestasjon avkardiovaskulær fenotype, og antyder at sirkulasjonsfeil er viktig årsak Til dødelighet Av Chrd – / – embryoer undersen svangerskap.

Pharyngeal abnormaliteter

for å bestemme utbruddet av pharyngeal fenotype dissekerte vi gravidkvinner fra heterozygote parringer på forskjellige tidspunkter etter coitum. På E9.0, astage Hvor Chrd uttrykkes i pharyngeal endoderm, Kan Chrd – / – embryoer identifiseres ved en innrykk i nakkeområdet (Fig.7A’, pil). De otiske vesiklene av mutantene ble reduserttil halvparten av deres normale diameter(Fig .7A’, pilspisser) og den andre (hyoid) pharyngeal arch was missing. Pharyngeal buer tre til seks aldri dannet i mutant embryoer(Fig. 7B ‘ og data notshown). De manglende eller misdannede strukturer er enten direkte forløpere ellerspille induktive roller under utviklingen av mange av organene som er defektive ved fødselen I Chrd – / – mus. Som de fleste av thefenotypiske abnormiteter observert hos nyfødte mutanter har deres embryologiskeopprinnelse i pharyngeal endoderm og peripharyngeal region, analyserte vi uttrykket av en rekke gener kjent for å ha viktige utviklingsroller i menneskelig arvelig sykdom.

Vi undersøkte først uttrykket Av Pax3, en transkripsjonsfaktoruttrykt i neural crest, dorsal neural tube og somites(Goulding et al., 1991). Inhumans, PAX3 er mutert i nevrale crest sykdommer utpekt waardenburg syndrom type 1 og 3 (Strachan And Read, 1994) andis en co-regulator, sammen MED SOX10, av mikroftalmi orMITF genet (Bondurand et al., 2000), transkripsjonsfaktoren mutert I Waardenburg syndromtype 2a hos mennesker (Tassabehji et al.,1994). Mutasjon Av Pax3 i splotch (Sp2H) mus resulterer i hjertefeil, inkludertvedvarende truncus arteriosus, samt misdannelse av thymus, skjoldbruskkjertelog parathyroidkjertler (Conway et al.,1997). Vi fant At Pax3-uttrykk varskille mellom mutant-og villtype-embryoer Ved E7.5 (ikke vist),men ved E10.5 ble det observert signifikante forskjeller. Pax3-positiveneural crest celler som vandrer gjennom svelget buer 3, 4 og 6 (Fig. 7C, pilspisser) var sjelden detekterbar I Chrd – / – dyr(Fig. 7C’). Disse neuralcrest celler befolke septum skille aorta fra lunge arteriei utløpskanalen, eller conotruncal region, av hjertet(Li et al., 2000). Den failureof hjerte nevrale crest å nå hjertet forklarer mangel på utstrømning tractseptation og påfølgende kardiovaskulær fenotype observert inChrd mutanter. Interessant, uttrykk For Pax3 i andre vev sliksom mandibulær (md) komponent av den første pharyngeal arch, dermomyotomes (dm) og myoblast forløpere i forbenene (fl)var upåvirket(Fig. 7C’).

deretter utførte vi in situ hybridiseringer Med Sox10, et genemutert hos personer Med Waardenburg syndrom type 4(Pingault et al., 1998) detuttrykkes i nevrale crest-og Schwann-celler. Ved E7.5 var uttrykket ofSox10 det samme i Chrd – / – embryoer og intheir wild – type kullmates (data ikke vist). Ved E9.5, Sox10uttrykk i dorsale rotganglia (drg) på stammen var normal (Fig. 7b, B’), menfordelingen av glialceller som uttrykker Sox10 avslørte spesifikkefeil i organiseringen av det perifere nervesystemet i nakken oghodeområdet av mutantene (Fig.7B’). Spesielt viste kraniale sensoriske ganglier merketunormaliteter. Trigeminal (tr) og vestibulo-cochlear (vc) ganglia, som tilsvarer Henholdsvis v OG VIII kranialnervene, ble lokalisertnærmere Sammen I Chrd – / – embryoer enn hos villtypelittermates. I tillegg ble unormale nerveprojeksjoner som forbinder de to avdem sett (Fig. 7B’, pilspiss). Genikulatet (g), petrosal (p) og nodose (n) ganglia,som svarer TIL kranialnervene VII, IX OG X, var mest berørt, og viste en ekstrem reduksjon i størrelse eller fullstendig fravær. Disse tre gangliaoriginate fra epibranchial placodes, og er kjent for å kreve inductivesignals fra fremre endoderm for deres riktig utvikling(Begbie et al., 1999). Den manglende epibranchial placode-avledede ganglia indikerer at den utskilte proteinChrd er nødvendig for aktiviteten til det induktive signalet utgitt avfaryngeale endoderm.

Pax9 er en transkripsjonsfaktor som kreves for utviklingen av thepharyngeal endoderm og dets derivater i musen(Peters og Balling, 1999; Peters et al., 1998). På E9.5, uttrykk For Pax9 i pharyngeal endoderm ofChrd – / – embryoer var svakere enn i deres villtypelittermates (pe, Fig.7D, D’). Pax9-uttrykk viste at størrelsen ogform av svelget ble endret i Chrd-mutantene, med pharyngealpouches redusert til en enkelt hevelse i den fremre delen (Fig. 7E, E’). Thehypoplasia i svelget ble bekreftet av histologiske seksjoner Av E14. 5embryos, hvor den fremre endodermen dukket opp som et tynt rør som skisserte agreatly redusert lumen (ph, Fig.5F, F’). Reduksjonen av pharyngeal endoderm har også blitt observert I Xenopus Chrd knockdowns (Oelgeschlä et al.,2003). Ikke-faryngeale regioner der Pax9 mRNA ernormalt uttrykt, som de somitiske sklerotomene (sc) og ansiktsmesenkym(fm), viste ikke forskjeller i fordelingen eller overflod av transkripsjoner (Fig.7F, F’).

vi konkluderer fra disse studiene at endringer I Pax3, Sox10 ogpax9 uttrykk er begrenset til et svært begrenset område av widerexpression domener, noe som tyder på at mangel på utskilt protein Chrdspecifically forstyrrer lokale regulatoriske veier som virker i peripharyngealregion rundt Chrd-uttrykke endoderm.

tbx1-og Fgf8-uttrykk krever akkordin

for å studere samspillet Mellom Chrd og gener som er kjent for å forårsake digeorge eller DiGeorge-lignende fenotyper hos mus, analyserte vi uttrykket ofTbx1 og Fgf8 i Chrd-mutantembryoer. Tbx1 er medlem Av t-box-familien av transkripsjonsfaktorer (Papaioannou og Silver,1998). Det kart innenfor dgs / VCFS 22q11 mikrodeletion hos menneskerog har nylig vist seg å forårsake DiGeorge-lignende fenotype ved inaktivering i mus (Jerome Og Papaioannou,2001; Lindsay et al.,2001; Merscher et al.,2001; Vitelli et al.(2002a). Ekspresjon Av Tbx1 ble endret ird – / – embryoer. I villtype e7. 5 dyr, Tbx1uttrykkes i forgrunnen (fremtidig pharyngeal endoderm) og hodet mesoderm(Fig. 8A). På dette stadiet viste mutant kullmates en klar reduksjon I nivåene Av Tbx1expression i de samme områdene(Fig.8A’). Reduksjonen I Tbx1 mRNA var like klari faryngealområdet Av Chrd homozygote embryoer Ved E8.0, E8.5 oge9.0 (Fig.8B’,C’, D’). Tverrgående histologiske seksjonerviste at på mobilnivå overflod Av tbx1 transkripsjonerble drastisk redusert i endoderm, både i svelget og foregut opp tilnivå av leverdivertikulumet (Fig.8F-H’) Reduksjon i konsentrasjonen Av Tbx1 mrnavar også tydelig i mesoderm, inkludert hode, splanchnic (pilspisser) ogsomatisk mesoderm(piler) i peripharyngeal regionen (Fig.8F’,G’, H’). I Tillegg Var Tbx1uttrykk Ved E9 i mesodermal kjerne av den første pharyngeal arch diffuse, som strekker seg til det meste av buen, og Tbx1-transkripsjoner varfraværende fra otisk vesikkel (Fig.8D-D’).

Fgf8 er en utskilt vekstfaktor uttrykt i en rekke vev, inkludert pharyngeal endoderm og nabo mesoderm(Crossley Og Martin, 1995; MacArthur et al., 1995).Under tidlig utvikling er Fgf8 nødvendig for gastrulasjon (Sun et al., 1999) og etablering av venstre / høyre symmetriakse (Meyers Og Martin, 1999). Atlater stadier Av Fgf8 er nødvendig for lem(Lewandoski et al., 2000; Månen og Capecchi, 2000) ogkraniofacial (Trumpp et al.(1999) utvikling. Nylige eksperimenter har vist at mus medredusert fgf8-aktivitet presenterer et spekter av kardiovaskulære ogfaryngeale defekter som tett etterligner DiGeorge syndrom(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002). I tillegg er fgf8-uttrykk avskaffet i pharyngeal endoderm ofTbx1-/- mutanter, og begge gener interagerer genetisk underdifferensiering av pharyngeal arch arteries (Vitelli Et al.( 2002b). AtE9, Fgf8-uttrykk i Chrd-mutanter er normalt i mid-hindbrain isthmus, frontonasal prominence og hale. Men i pharyngealendoderm reduseres Fgf8-transkripsjonsnivåene drastisk (Fig. 8E’). Reduksjonen Av Tbx1-og Fgf8-uttrykk i Chrd – / – embryoer antydet at begge gener virker nedstrøms For Chrd i sameregulatorisk vei. Disse forsøkene bestemmer ikke Om Chrder nødvendig for vedlikehold eller for induksjon Av Tbx1 ogfgf8 i svelget og nærliggende vev.

for å teste om Chrd kan indusere Tbx1 og Fgf8,injiserte Vi Chrd mRNA (50 pg) i den ventrale regionen avxenopus-embryoer i firecelletrinnet. Ventral marginal sone (VMZ)explants ble dissekert ved tidlig gastrula, dyrket til søsken embryosreached tidlig neurula stadium, og analysert AV RTPCR. Tbx1 ogfgf8 mrna ble uttrykt ved høye nivåer i hele embryoer og DORSALMARGINAL sone (DMZ) explants på dette stadiet, og ved lave nivåer I VMZ explants(Fig. 8I, baner 1-3). Uponmicroinjection, Chrd mRNA økte nivåene Av Tbx1 ogfgf8 I VMZ (Fig. 8i, lane 4). In situ hybridisering av mikroinjiserte Xenopus-embryoer bekreftet At tbx1-transkripsjonene indusert Av Chrd mrnable lokalisert i pharyngeal endoderm (data ikke vist). Vi konkluderer med atchrd, En bmp-antagonist, kan indusere Tbx1 og Fgf8-Uttrykk i Xenopus-embryoer, og er nødvendig for fullt uttrykk for disse genene i faryngeale regionen av musembryoen.