kromatin Immunoprecipitation (ChIP) analyse er en viktig metode for transkripsjonell regulering overvåking med avdekket kunnskap om interaksjoner mellom spesifikke proteiner og en genomisk DNA-region. GITT DET faktum AT DNA-bindende proteiner (inkludert transkripsjonsfaktorer og histoner) i levende celler kan kryssbindes TIL DNA som de er bindende, Brukes ChIP til å immunoprecipitere protein-DNA-komplekset ut av cellulære lysater med et passende antistoff. De immunoprecipiterte kompleksene samles ved sentrifugering, og proteiner elueres for videre analyse som western blot og LC / MS. Nukleinsyreanalyse oppnås GJENNOM PCR, RT-PCR, cDNA-sekvensering og mikroarray. Denne protokollen gir en detaljert prosedyre for å oppnå vellykket Chipanalyse på en rask og effektiv måte.
Reagenser:
- 37% formaldehyd
- 1 m glysin
- Cellelysebuffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, med 1× proteasehemmer cocktail.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Legg til 27 µ 37% formaldehyd per 1 mL kulturmedium for å oppnå en endelig konsentrasjon ved 1%, inkuber cellene i 10 min ved romtemperatur mens du sakte rister på en rocking eller risting enhet.
2. Slukk krysskoblingen ved å tilsette 141 µ 1 m glysin per 1 mL kulturmedium for å oppnå en endelig konsentrasjon ved 125 mM, inkuber cellene i 5 min ved romtemperatur.
3. For flytende celler: kollettceller i et 15 mL konisk rør, sentrifuge ved 2000 × g ved 4°C i 5 min. Kast supernatanten, og vask cellene to ganger med kaldt PBS.
Gå Til trinn 5.
4. For limceller: fjern mediet, vask cellene to ganger med kaldt PBS. Skrap cellene inn I PBS i et 15 mL konisk rør, sentrifuge ved 2000 × g ved 4°C i 5 min.
Lysis og sonikering
5. Kast supernatanten, tilsett 1 mL kaldcellelysebuffer per 1 × 107 celler. Resuspend pellet ved pipettering opp og ned for flere ganger, og ruge på is i 10 minutter.
6. Sonikat for å skjære kromatinet i 0,5~1 kb fragment. Unngå skum og hold prøven på is.
Notater:
- Sonikeringsforholdene bør optimaliseres avhengig av prøven og sonikatormodellen. Vanligvis har seks 15-sek pulser etterfulgt av 45-sek hvileperioder ved utgang 6.0 vist seg å fungere. For analyse av fragmentstørrelsen, trekk ut et lite volum totalt DNA fra en aliquot av skjæret kromatin, og analyser deretter på en agarosegel (1~2%).
- volumene foreslås å være ≤ 1 mL for å opprettholde sonikering effektivitet.
7. Sentrifuge ved 12 000 × g ved 4°C i 10 min, og behold supernatanten.
8. Overfør 0,5 mL supernatant til en frisk 1.5 mL rør FOR DNA-fragmentanalyse.
Immunopresipitasjon
9. Legg relevante antistoffer eller normalt IgG til prøven og inkuber i 15 min i et ultralyd vannbad ved romtemperatur.
Notater:
- Velg IgG fra samme art hvor antistoffene ble produsert.
- inkubasjonstiden bør optimaliseres avhengig av antistoff og antigen. For antigener med lavt uttrykksnivå kan inkubasjonen utføres ved 4°C over natten på en roterende plattform .
10. Forbered Protein a-agarose perler: vask perlene tre ganger med 1 mL lysisbuffer (uten proteasehemmer), sentrifuge ved 2000 × g i noen sekunder ved 4°C og kast deretter supernatanten.
11. Fortynn perler 1:1 med lysisbuffer og legg til 50 µ til prøven.
12. Inkuber ved 4°C i 30~45 min i en roterende plattform.
13. Sentrifuge ved 2000 × g i 1 min ved 4°C og kast deretter supernatanten.
14. Vask perlene i fire ganger med 1 mL lysisbuffer (uten proteasehemmer), kast supernatanten.
DNA rensing og analyse
15. Resuspend de vasket perlene med 100 µ 10% Chelex 100.
16. Pipette opp og ned i flere sekunder, og kok deretter prøven i 10 minutter.
17. Sentrifuger ved 12 000 × g i 1 min ved romtemperatur, og overfør supernatanten til et nytt 1,5 mL rør.
18. Rens DNA ved HJELP AV ET DNA rensesett eller ved standard fenol: kloroform ekstraksjonsprotokoll.
19. Oppløs DNA med 50 µ ddH2O, og bruk 2~10 µ AV DNA-prøven (25% av reaksjonsvolumet) i PCR-reaksjonene
Lær om Prinsippet Om ChIP
Nå Til Vår ChIP servise
hvis du har spørsmål, vennligst kontakt oss på: