Mikroskopi som standard er en teknikk som tillater oss å observere, snarere enn å måle, biologiske hendelser og gjøre konklusjoner basert på det vi ser, snarere enn basert på noen beregninger. Emnet i denne artikkelen kan derfor virke litt overraskende siden det omhandler målinger av kolokalisering. Mens det er situasjoner hvor du kan bestemme proteinkolokalisering visuelt, vil det ofte være nødvendig med en mer nøyaktig bekreftelse på en gjensidig fordeling av to prober.
Hvorfor Er En Visuell Bestemmelse Av Kolokalisering Utilstrekkelig?
Bare hvis du har samlet bilder etter en kontrollert protokoll for kolokaliseringsanalyse (tilstrekkelig signal i hver kanal, ingen autofluorescens eller signalblødning), er det trygt å si at de to sondene kolokaliserer utelukkende basert på observasjon. I dette tilfellet, hvis det grønne signalet kolokaliserer med det røde signalet og bildet er for det meste gult, er det ikke nødvendig med statistisk måling. Men hvis du ikke ser en overlapping, betyr det ikke at det ikke er der! Det kan være at intensiteten til de to kanalene ikke er den samme. Nemlig kan mellomfargen som vi ser bare vises hvis begge prober er av samme intensitet. Derfor kan konklusjoner basert på visuell bestemmelse ofte føre til falske negative resultater.
Hvilke Metoder For Overlappingsmåling Finnes?
Mens det ikke er noen standard tilnærming til denne saken, er det to metoder som er mye brukt og generelt akseptert. Disse involverer Enten Pearsons korrelasjonskoeffisient (PCC) eller Manders kolokaliseringskoeffisient (MCC).
disse to metodene relaterer seg til to forskjellige aspekter av kolokalisering – korrelasjon og samtidig forekomst. Pearsons koeffisient er relatert til korrelasjonen av pikselintensiteter i de to kanalene. Det måler forholdet mellom signaler – om signalverdiene i en kanal stiger samtidig med den andre, eller ett signal faller når det andre stiger. Korrelasjon er forskjellig fra co-forekomst, som er matematisk uttrykt Gjennom Manders koeffisient. Dette representerer dekning av ett signal over det andre, noe som avslører i hvilken grad to prober opptar samme sted. La oss utforske dette litt lenger.
Pearsons Korrelasjonskoeffisient (PCC)
DEFINISJON: PCC reflekterer det lineære forholdet mellom signalintensiteter. Verdiene kan variere mellom 1 (perfekt positiv korrelasjon) og -1 (perfekt negativ korrelasjon), mens 0 betyr at det ikke er noen korrelasjon. DET er mulig å utforske PCC visuelt gjennom et scattergram hvor koordinatene på plottet representerer pikselverdier (signal) i begge kanaler. Jo flere punkter som klynger seg rundt en rett linje, desto bedre er korrelasjonen mellom de to signalene
Krav: PCC skal måles i INTERESSEOMRÅDET (ROI)for å unngå falske positive eller negative. Hvis måle PCC over hele bildet, piksler av bakgrunnen vil korrelere perfekt og blåse OPP PCC. Derimot, hvis målingen utføres i en region uten interesse der det er en heterogen fordeling av begge kanalene, VIL PCC bli deprimert.
DU kan velge ROI for hånd eller ved terskel for å utelukke bakgrunn. Uansett hvordan du gjør det, vær forsiktig, spesielt når terskel. VALGET AV ROI må inkludere alle relevante områder av cellen (e), dvs. hvert sted hvor en sonde kan forventes å distribuere. Hvis du bruker en intensitetsbasert METODE for Å velge ROI( terskelverdi), kan du utilsiktet utelukke relevante resultater. Hvordan kan dette skje? Du kan ha en region med gjensidig utelukkelse, hvor ingen etikett vises, og dette kan være et biologisk relevant resultat (begge molekylene uttrykkes ikke på det stedet i cellen). Thresholoding vil imidlertid ikke inkludere denne regionen I AVKASTNINGEN, noe som setter deg i fare for å miste relevante resultater.
Anbefalt FOR: PCC bør brukes på bilder der det er et lineært forhold mellom intensiteter. Hvis dataene passer til en mer kompleks modell, VIL PCC ikke fungere bra. En annen metode bør også velges hvis det er en ujevn overlapping, hvor prober samfordeler, men i forskjellige proporsjoner. Dette kan oppstå når GFP brukes som en sonde. Dens uttrykksnivå kan variere mellom celler, og potensielt forårsake depresjon AV PCC på grunn av høy intercellevariabilitet.
Manders Kolokaliseringskoeffisienter
Definisjon: MCC er en metrisk som beskriver samtidig forekomst-fraksjonen av ett protein som kolokaliserer med det andre. MCC vil gi deg et godt mål for kolokalisering når du merker ett protein i en vesikkel og vil se hvordan det kolokaliserer med en viss struktur i en celle, si en mikrotubule. Hvis vi antar at alle vesikler kolokaliserer med mikrotubuli, men bare en andel mikrotubuli kolokaliserer med vesiklet, kan DU beregne MCC for hver kanal og få en metrisk som kvantitativt beskriver denne brøkdelte overlappingen.
Krav: fangsten MED MCC er at den krever eliminering av bakgrunnen. Den vanskeligste delen her er å sette et cutoff punkt for intensitet som vil aktivere bakgrunn subtraksjon. MCC måler fullstendig fluorescens av en sonde i hver over-null piksel. Imidlertid er over null piksler ekstremt sjeldne, på grunn av faktorer som: autofluorescens, lys lekkasje, ikke-spesifikk merking, eller fluorescens fra ut av fokus bilde plains. Måling AV MCC krever derfor et nøye utvalg av terskelen (cutoff).
den første måten å gjøre dette på er global terskel, hvor du trekker en terskelverdi fra hver piksel, slik at hvert nivå under den valgte cutoff vil være bakgrunn og hver piksel over vil falle inn i en region av interesse. Selv om dette er veldig intuitivt, er global terskel ganske rå og kan føre til uønskede situasjoner som utelukkelse av lavverdipikslene som er nær bakgrunnen, men faktisk er positive.
Et mer automatisk og mindre subjektivt alternativ Er Costes-metoden der terskelen estimeres ved å beregne PCC flere ganger. Dette tjener til å definere rekkevidden av pikselverdier som er positive og derfor ikke bør utelukkes. PCC beregnes for ulike grupper av piksler, og pikselverdiene SOM PCC er lik eller nær null, tas som terskelverdiene. Likevel bør det også kontrolleres visuelt, siden det i bilder med lavere signal-til-støyforhold kan identifisere et svært lavt terskelnivå slik at det ikke skiller merkede strukturer fra bakgrunnen.
Anbefales For: når det biologiske spørsmålet om eksperimentet ditt gjelder i hvilken grad protein/strukturer overlapper, BØR MCC være mål for valg. Disse koeffisientene tolkes mer intuitivt ENN PCC, og er uavhengige av signalproporsjonalitet (forskjellene i antall strukturer merket av hver sonde).
Før Du Begynner Analysen
Uansett hvilket valg for måling av kolokalisering du velger, er det svært viktig at bildesamlingen utføres på riktig måte. Prøv å kontrollere så mange faktorer som mulig, og lag et sett med kontrollprøver som lar deg overvåke så mange variabler som mulig.
Husk at visuell kolokaliseringsbestemmelse påvirkes av mange faktorer, blant annet observatørens subjektivitet, det faktum at hver persons hjerner kan se farger annerledes, en mulig fargeblindhet for observatøren og den romlige oppløsningen som bestemmer pikselstørrelsen, blant andre. Pass på å behandle bildene du skal analysere på en jevn måte, og husk at ukontrollert manipulasjon kan føre til at du mister relevant informasjon.
Og Sist Men Ikke Minst
disse beregningene er implementert i de fleste bildeanalyseprogramvarepakker, For eksempel ImageJ og Volocity. Men gitt at måling av kolokalisering fortsatt er et noe forvirrende felt, er det nødvendig med forbedringer, så hold styr på de nye versjonene og pakkene for programvaren.
hvordan måler du kolokalisering? Gi oss beskjed ved å skrive i kommentarfeltet!
Litteratur:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. En praktisk veiledning for å evaluere kolokalisering i biologisk mikroskopi. American Journal Of Physiology – Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Kolokaliseringsanalyse I Fluorescensmikroskopi. I: Taatjes, Douglas J., Roth, Jü (red.), Cell Imaging Teknikker: Metoder Og Protokoller, New York: Humana Press, 2012,s. 97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Statistiske tester for tiltak av kolokalisering i biologisk mikroskopi. Journal of microscopy (engelsk). 2013; 252(3): 295-302
har dette hjulpet deg? Vennligst del med nettverket ditt.