Kromosom 20 delesjoner Ved myeloide maligniteter: reduksjon av den felles slettede regionen, generering av en PAC/BAC-kontig og identifisering av kandidatgener

kromosombånd og-maling

Benmargkromosompreparater av 107 tilfeller med myeloide lidelser ble analysert Av G banding for å vurdere størrelsen på sletting av den lange armen av kromosom 20. Som tidligere beskrevet (Nacheva et al., 1995b) ble to kategorier av 20q – sletting identifisert-store slettinger (59 tilfeller), noe som resulterte i tap av Både Giemsa mørke bånd fra 20q (Figur 1a, topp) og små slettinger (48 tilfeller) der ett Giemsa mørkt bånd forblir (Figur 1a, bunn). Vi fokuserte deretter på den siste pasientgruppen (oppsummert I Tabell 1).

FISKEANALYSE ved hjelp av kromosom 20-maling ble utført på de 48 prøvene med en liten 20q-sletting. I seks tilfeller,’ 20q sletting ‘ ble avslørt for å være på grunn av kryptiske omarrangementer. I ett tilfelle identifiserte samtidig bruk av maling for kromosomer 15 og 20 en markør avledet fra kromosom 15, men to normale kromosom 20-homologer (Figur 1b). I de resterende fem tilfellene viste kromosommaleri tilstedeværelsen av en ubalansert translokasjon med et tilbakevendende brytepunkt ved 20q11. 2 og variable kromosompartnere (Figur 1c). I alle fem tilfeller var der(20) markøren det eneste translokasjonsproduktet som ble beholdt i genomet. VIDERE VISTE FISKEKARTLEGGING at brytepunktet på kromosom 20 hadde skjedd i en region proksimal TIL D20S107 og bekreftet tap av resten av den lange armen av kromosom 20 (data ikke vist). Disse resultatene vil bli rapportert i detalj andre steder.

i de resterende 42 tilfellene var kromosommalingen i samsvar med en liten interstitiell delesjon på 20q (Figur 1d). Flertallet (33 tilfeller) hadde en 20q sletting som den eneste karyotypiske abnormiteten. I de resterende ni tilfellene ble 20q-slettingen ledsaget av ulike ekstra kromosomavvik (Tabell 1). Alle 42 tilfeller med en liten 20q sletting ble utsatt for ytterligere FISKEKARTLEGGING med locusspesifikke sonder.

Delesjonskartleggingsanalyse

de 42 pasientene med små 20q slettinger ble analysert AV FISH ved hjelp AV en sentromerisk PAC (CEP20), en pac hybridisering til en distal region på 20q (LSI 20Q13) og EN PAC hybridisering i CDR (LSI D20S108). Hos hver pasient ble det observert signaler FRA BÅDE LSI 20Q13 OG CEP20, men ikke LSI D20S108, på det slettede kromosomet 20 som bekreftet tilstedeværelsen av en interstitiell delesjon (oppsummert i Figur 3). Metafaser fra hver pasient ble deretter hybridisert Med PACs kartlegging ved grensene til den kjente MPD Og MDS / AML CDRs-D20S107 som ligger ved den proksimale grensen Til CDRs og D20S176 som ligger telomere av Den distale grensen Til CDRs (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).

hos 37 pasienter (25 MED MDS eller AML, 12 MED MPD) klarte begge sondene ikke å gi et signal på det slettede kromosomet 20 som demonstrerte tilstedeværelsen av omfattende slettinger som ikke ville bidra til å avgrense Cdr-Ene. Slike prøver ble ikke undersøkt videre. Hos fire pasienter med MDS (DB53, MH40, DB122 og DB214) og en med MPD (JH41) ga imidlertid en av de to sondene et signal på det slettede kromosomet 20, og disse prøvene ble analysert mer detaljert.

i tillegg til de 42 pasientene med små 20q slettinger som BLE analysert AV FISK ved hjelp av lokusspesifikke sonder, ble ytterligere seks pasienter med 20q delesjon (fire med MDS, to MED MPD), hvorav benmargsmetafaser ikke var tilgjengelige, analysert ved hjelp av mikrosatellitt PCR. DNA fra rensede granulocytter og T-celler ble analysert ved hjelp av et stort panel av polymorfe markører som spredte MPD Og MDS/AML Cdr (Tabell 2). Alle FIRE MDS-pasientene hadde slettinger som strekker seg utover grensene for den publiserte CDR. I en AV de to mpd-pasientene (RB42) reduserte den sentromere grensen for slettingen betydelig MPD CDR (Figur 2, Tabell 2).

Reduksjon av felles slettet region hos MDS/AML-pasienter

Foreløpig FISKEANALYSE identifiserte fire mds-pasienter med slettinger som gikk inn på MDS/AML CDR. I hvert tilfelle, 20q sletting var til stede i alle metafaser undersøkt. I tre tilfeller (DB53, DB214 og MH40) var 20q-slettingen til stede som en eneste abnormitet. I pasient DB122 var 20q delesjon den opprinnelige eneste abnormiteten med to subkloner som inneholdt trisomi 21 eller trisomi 8 og trisomi 21 i tillegg til 20q delesjon også til stede. Disse fire tilfellene ble studert ved hjelp av flere locus spesifikke sonder for å fastslå slettegrensene.

den proksimale grensen TIL MDS / AML CDR ble raffinert av pasientene DB53, MH40 og DB122. Den proksimale grensen for slettingen i DB53 lå MELLOM D20S107 OG WI-11538 (Figur 3), en avstand på omtrent 400 kb. FOR PASIENT MH40 ga en PAC som inneholdt WI-11538 (dJ357E14) konsekvent opphav til et redusert signal i samsvar med tilstedeværelsen av det proksimale slettepunktet innenfor DENNE PAC (Figur 3). Videre lå den proksimale grensen for sletting i pasient DB122 mellom sts-R52161 og stSG25449 (Figur 1e,f), en avstand på mindre enn 200 kb(Figur 3 og 4). Dette representerer en stor forfining av den proksimale grensen TIL MDS / AML CDR.

Pasient DB214 tillot betydelig forbedring av den distale grensen TIL MDS / AML CDR. Den distale grensen for denne slettingen lå MELLOM WI-12515 og stSG40369 (Figur 1g,h), en avstand på mindre enn 100 kb (Figur 3 og 4).

disse dataene reduserer derfor MDS/AML CDR betydelig til en region som ligger mellom pac dJ620E11, som inneholder sts-R52161, OG PAC dJ196H17 som inneholder WI-12515 (Figur 3 og 4). Den bakterielle klonkontig som presenteres nedenfor, viser den fysiske størrelsen på denne regionen til å være omtrent 2,6 Mb.

Reduksjon av den felles slettede regionen hos mpd-pasienter

i pasient JH41 (diagnose PV) var den proksimale grensen for slettingen tidligere bestemt av mikrosatellitt PCR til å ligge MELLOM D20S438 OG D20S107 (Bench et al .( 1998a). PAC dJ155H19, som inneholder D20S107 (Figur 4), ga konsekvent opphav til et redusert signal i samsvar med tilstedeværelsen av det proksimale slettepunktet i DENNE PAC (Figur 3).

Granulocytter og T-celler fra ytterligere to pasienter ble undersøkt ved bruk av mikrosatellitt PCR (Tabell 2). En pasient med PV (RB42) viste retensjon av heterozygositet VED D20S108, men tap VED D20S858(Figur 2, Tabell 2). Det proksimale brytepunktet for slettingen i denne pasienten lå MELLOM D20S108 OG D20S858, en avstand på mindre enn 200 kb (Figur 3 og 4).

disse dataene sterkt redusere MPD CDR whicih er nå flankert AV D20S108 (denne studien) OG D20S481 (Wang et al., 1998). Den estimerte fysiske størrelsen på denne regionen er 2.7 Mb, ved hjelp av data fra bakteriell klon contig presentert nedenfor. Overlappingsområdet mellom de nye MDS/AML-Og MPD-Cdr-ene definerte en kombinert myeloid CDR på 1,7 Mb (Figur 3).

en bakteriell klonkontig som spenner OVER MPD og mds/AML vanlige slettede regioner

Vi hadde tidligere konstruert en 11 Mb YAC contig av denne regionen av kromosom 20 (Bench et al .( 1998a). For å produsere et mer detaljert fysisk kart har vi nå konstruert et sammenhengende pac-og BAC-basert kart. PAC og bac kloner ble identifisert ved hybridisering Av STSs til genomiske biblioteker (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Kloner ble overlappet ved hjelp av begrensning fingeravtrykk (Gregory et al.( 1997) og STS innholdskartlegging slik at kloner kan grupperes i contigs. Å bygge bro contigs, nye STSs OG DNA-sonder, utviklet fra endene av contigs, ble brukt for videre bibliotek screening. Nye PACs og BACs ble deretter slått sammen til contigs på samme måte til en sammenhengende kart ble produsert.

den bakterielle klonen contig inneholder totalt 456 bakterielle kloner, hvorav 376 Er PACs og 80 Er BACs. Den strekker SEG fra D20S607 TIL SEMG1 og inkluderer 202 DNA-markører, hvorav 185 Er STSs og 17 ER DNA-prober. Størrelsen på contig var basert på et gjennomsnitt på 3,5 kb per HindIII fingeravtrykksbånd (P Deloukas (2000), upubliserte resultater). Den estimerte størrelsen på contig ble beregnet som 5 Mb ved å multiplisere det totale antall forskjellige fingeravtrykksbånd i contig med 3,5. En representasjon av kartet som illustrerer minimal flislegging banen og Pac som ble brukt FOR FISKEFORSØK er vist i Figur 4. En fullversjon av kartet finner du på http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name = Chr_-20ctg125 & class = Map.

Identifikasjon av uttrykte sekvenser

førtitre unike Est ble plassert mellom d20s607 og stSG34035 inklusivt. Av disse ble 34 Est kartlagt ved hybridisering til en ‘polygrid’ Av PACs og BACs eller ved koloni PCR av bakteriekolonier som inneholdt PACs eller BACs (Figur 4). Ytterligere ni ESTs, tidligere kartlagt i denne regionen av kromosom 20 (Bench et al ., 1998a; Deloukas et al., 1998) ble plassert på contig AV BLAST justering AV EST sekvens med den tilgjengelige pac eller bac genomisk sekvens.

for å identifisere antatte nye uttrykte sekvenser ble 23 PAC-kloner fra den minimale flisebanen delvis eller fullstendig sekvensert. Den genomiske sekvensen av disse klonene ble analysert ved HJELP AV Nix-programmet (Williams Et al., 1998) som tillater samtidig observasjon av en rekke genidentifikasjonsverktøy, inkludert GRAIL, GENSCAN og BLAST. Åtte Tidligere ikke kartlagte ESTs og gener ble identifisert (Tabell 3). Seks av DISSE lå innenfor MPD CDR og syv lå innenfor MDS CDR. Bevis ble oppnådd at seks av disse åtte antatte uttrykte sekvensene representerte bona fide transkriberte gener, i stedet for behandlede pseudogener eller genomiske DNA-forurensninger i EST-databasen. KCNS1 er et gen som koder for en kaliumspenningsstyrt kanalunderenhet. ESTs AA053206 / AA053121 ble senere funnet å være avledet FRA sgk2 genet (Kobayashi et al., 1999). Justering av cDNA-sekvens til genomisk sekvens demonstrerte en exon/intron-struktur for tre av de resterende seks Estene (AI312497, AA568401 og AA910031) med splice site consensus-sekvensen tilstede ved alle exon/intron grenser. I alle tre av disse tilfellene ble tilstedeværelsen av hver exon bekreftet av exon prediksjonsprogrammer som GRAIL. Eksistensen av en exon ble også spådd AV GRAIL, GENSCAN og Genefinder innenfor regionen PAC dJ1108D11 som justert TIL EST AA993161, noe som innebar at DETTE EST også representerte et transkribert gen.

Sekvensanalyse Av PACs fra den minimale fliserbanen tillot oss også å etablere den genomiske strukturen av kjente og nye gener i denne regionen. Justering Av rptprho cDNA Til PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 og dJ269M15 viste at dette genet spenner over minst 1,2 Mb. Pac dJ138B7 inneholdt to gener (h-l(3)mbt OG SGK2) samt 5 ‘ -delen AV genet som tilsvarer SHGC-36858. Spesielt inneholder theh-l (3)mbt-genet 20 eksoner med to antatte alternative endelige eksoner. Analyse av dJ644L1 viste at det humane MafB-genet består av en enkelt ekson. Analyse av ferdig sekvens ble også utført Av Sanger-Senteret (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) og dette kan ses på http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20 & klasse=GenomeSequence.

disse dataene etablerer tilstedeværelsen av seks gener og ytterligere 14 unqiue ESTs i den nye MDS / AML CDR og totalt 14 gener med 23 unike ESTs i den nye MPD CDR (Tabell 3). Seks gener og 10 unike ESTs er tilstede i overlappingsområdet mellom De to Cdr-Ene.

Uttrykksprofilering

myeloproliferative lidelser, myelodysplastiske syndromer og akutt myeloid leukemi antas å være et resultat av transformasjon av en multipotent celle i det hematopoetiske stamcellekammeret (Bonnet and Dick, 1997; Kralovics and Prchal, 1998). Videre har det tidligere blitt vist at 20q-deletjonen kan oppstå i en stamcelle som er i stand til å gi opphav til både myeloide celler og B-celler (White et al., 1994). Disse hensynene antyder at genet eller genene på kromosom 20q som er inaktivert ved disse sykdommene sannsynligvis vil bli uttrykt i normale hematopoetiske stamceller. Vi bestemte derfor hvilken av de transkriberte sekvensene som ble uttrykt i benmarg og rensede CD34-positive celler.

Revers transkripsjon pcr (RT–PCR) forsterkning ble utført med primere som representerer hver av de 51 transkribert sekvens (Figur 5). Minst to uavhengige RT-PCR-forsterkninger ble utført for hver transkribert sekvens. Primere som svarer TIL EN EST (WI-7685) avledet fra 3′ UTR AV CD34-genet ble brukt som en positiv kontroll (Figur 5). Der to Eller flere Est samsvarer med den samme transkriberte sekvensen, ble det samme resultatet oppnådd for HVER EST.

dataene er presentert I Figur 5, Tabell 3 og 4. Av de 37 uttrykte sekvensene I MPD CDR ble 20 uttrykt i benmargsmononukleære celler. Av disse ble 16 også uttrykt I CD34 positive celler. INNENFOR MDS / AML CDR ble 11 av 20 transkriberte sekvenser uttrykt i benmargsmononukleære celler. Av disse ble åtte også uttrykt I CD34 positive celler. Av de 16 transkriberte sekvensene som ligger innenfor overlappingsområdet MELLOM Mpd Og MDS/AML Cdr, ble åtte uttrykt i benmargsceller hvorav fem også ble uttrykt I CD34 positive celler. Disse fem transkriberte sekvensene representerer derfor primære kandidatgener siden de ligger innenfor BÅDE MPD Og MDS / AML Cdr og uttrykkes i det hematopoietiske stamcellekammeret. De inkluderer to ukjente gener som svarer Til ESTs SHGC – 36858 OG WI-12515, samt tre gener, SFRS6, h-l (3) mbt OG MYBL2.