Kimærer

Hva Du Vil Gi Del i

• et kontonummer.
• en mykoplasmafri ES-cellelinje med 40 kromosomer.

Hva Vi Skal Gjøre

• vi vil injisere omtrent 50 blastocysts per ES-cellelinje. Dette bør resultere i 10 mus født. Tre av musene forventes å være sterke mannlige kimærer. Vi har en bevist rekord av suksess.
• vi vil huse musene til avvenning (tre uker etter fødselen).

Hva Du Vil Gi Del II

• du vil huse de avvente musene.

Koster

• $3300 per 129 cellelinje og kostnaden for donorhunner; $ 4950 per cellelinje og kostnaden for donorhunner for annen genetisk bakgrunn.
• Lokale, ikke-CWRU-ordrer vil bli belastet ytterligere $ 200 for pakking og transport av mus. Ikke-lokale bestillinger vil bli belastet $200 og kostnadene ved transport.

Forskriftssamsvar

• Etterforskere trenger en iacuc-protokoll fra sin institusjon for å motta mus fra kjernen. Cwru iacuc protokoller må spesifisere bruk Av Saken Transgen Kjerne. Undersøkere trenger ikke EN IBC-protokoll, normalt: gjennomgangen for rekombinant DNA hos dyr vil bli utført på informasjonen som sendes inn via online bestilling for transgen kjerne, og vil bli lagt til kjernens IBC-protokoll som en endring hvis godkjent. DU kan bli kontaktet AV IBC for ytterligere informasjon som en del av rDNA gjennomgang etter innlevering av bestillingen. IBC-godkjenning er nødvendig før oppstart av injeksjoner.

Anerkjennelser

• vi ber om at Du bekrefter Saken Transgen Og Målretting Anlegget i seminarer og publikasjoner.

Tidslinje

• fra injeksjonsdatoen for celler vil det være minimum 6 uker før vi vil kunne levere mus til deg(nesten 3 uker for svangerskap, og minst 3 uker med postnatal vekst før avvenning). Det vil være ytterligere 6 uker før de mannlige kimærene vil være gamle nok til å avle, og minst 6 uker før du har spist avkom til genotype for å teste for kimlinjeoverføring-totalt 4.5 måneder fra injeksjon til testing for overføring av kimlinje.
• den nåværende (3/25/21) forventede tiden mellom ordreplassering og ES-celleinjeksjon er 8 uker. I løpet av de 8 ukene før injeksjon, blir chimera-forespørselen gjennomgått AV rDNA-komiteen TIL IBC, ES-cellene tines og dyrkes, og mus blir bestilt og mottatt.

Suksessrate I Å Generere Kimære Mus

kjernen genererer et gjennomsnitt på ca 5 kimærer per cellelinje.

Komme I Gang
sannsynligheten For kimlineoverføring av en målrettet mutasjon økes med antall uavhengige ES-cellelinjer tilgjengelig. I gjennomsnitt vil om lag to tredjedeler til tre fjerdedeler AV ES-cellelinjer på den 129 genetiske bakgrunnen gå kimlinje. FOR ES-cellelinjer på C57-bakgrunnen, vil et gjennomsnitt på bare en halv til to tredjedeler av linjene gå kimlinje. Hvis du kjøper målrettede ES-cellelinjer fra et offentlig depot, anbefaler vi derfor at du kjøper 3 eller flere korrekt målrettede linjer på 129-bakgrunnen og 4 eller flere linjer På C57-bakgrunnen. På samme måte bestiller du 2 eller flere injeksjoner for 129 linjer, og 3 eller flere For C57 linjer. For generering av vevsspesifikke knockouts med betingede alleler I ES-celler fra EUCOMM, se vår primer.

Ofte Stilte Spørsmål

Hva er kimærer?
vanligvis er kimærer konstruert for å generere mus fra genmålrettede ELLER genfange ES-cellelinjer. ES-celler injisert i vertsembryoer gir opphav til mosaikkmus kjent som kimærer.
Mannlige ES-celler injiseres i unsexed blastocysts. Hvis vertsembryoen er kvinne og de mannlige ES-cellene lager kimceller, vil kimæren ofte være en fruktbar mann. Vertsembryoer fra en stamme som ikke vil konkurrere for sterkt med ES-cellene, brukes, og de to komponentene (ES og vertsembryo) er genetisk merket med frakkfargegener, slik at ES-cellens bidrag til dyret enkelt kan bestemmes. Hvis andelen AV ES – celle etterkommere i kappen av dyret er høy, er sannsynligheten FOR AT ES-celler er representert i gameter også høy, siden ES-celler blandes grundig med vertsceller tidlig i embryogenesen. Frakkfargemerkingssystemet gjør det også mulig å bestemme, med passende kryss, om avkom av kimærene er FRA ES-cellekomponenten eller vertsembryokomponenten.
129 ES-celler gir opphav til brun frakkfarge fordi DE Er a/A (villtype Agouti), OG c57bl/6j-vertsembryoene gir opphav til svart frakkfarge fordi de er a/a (recessiv nonagouti). ES-cellene er fra 129-stammen av mus; vertsembryoene er FRA c57bl / 6J-stammen av mus. Hvis disse kimærene er avlet til a / a ikke-agouti-mus (FOR EKSEMPEL C57BL/6J, må alle brune avkom (A/a) ha oppstått FRA ES-celleavledede gameter, og 50% av de brune avkomene forventes å bære knockout-allelet. Alternativt kan overføringen av mutasjonen analyseres direkte VED PCR eller Southern blot-analyser av vev fra avkom.
HVIS ES-cellene er fra c57bl/6J-stammen (a/a, Tyr/tyr og svart), vil vertsembryoen være albino C57BL/6j (A/a, Tyrc-2j/Tyrc2-j og hvit). Avl av slike kimærer til albino C57BL/6J kan generere svarte avkom (a/a, Tyr/Tyrc-2j) FRA ES-cellekomponenten, hvorav 50% skal bære mutasjonen og hvite avkom (A/a, Tyrc-2J/Tyrc-2J) fra vertsembryokomponenten.

de mannlige kimærene som sannsynligvis vil overføre den målrettede mutasjonen, kan identifiseres ved kopulatorisk pluggenotyping.

Kimærer for andre bruksområder
vi gjør også aggregering kimærer og diploidtetraploid kimærer. To preimplantasjonsembryoer fra to forskjellige stammer av mus kombineres for å danne en aggregeringskimera. Denne teknologien kan brukes til å generere genetiske mosaikkembryoer for analyse av autonomi og ikke-autonomi av genhandling og andre eksperimentelle mål. I diploidtetraploide kimærer gir den tetraploide komponenten i stor grad opphav til mye av den embryoderiverte placenta og den diploide komponenten til embryoet. Denne typen chimera kan brukes til å avgjøre om et gen er nødvendig i placenta eller embryo.

Hvorfor er mine mus morsomme farger?
NOEN ES-cellelinjer er heterozygote for pelsfargealleler som bare avslører seg i etterfølgende generasjoner. R1 129 ES-cellene vi bruker er heterozygote på albino locus, bærer en kopi av chinchilla allel av albino (cch, også betegnet Tyrc-ch) og er heterozygote på pink-eyed fortynning locus (p). Avl avkom nedstammet Fra r1 ES celler til hverandre kan gi opphav til mus som er svart, ulike nyanser av grått, ulike nyanser av brunt, eller gul, avhengig av utvalg av pels farge alleler.

Hva kan gjøres for å sikre germline overføring?
Germline overføring er maksimert MED ES-celler som har brukt et minimum av tid i kultur, som har et normalt komplement av kromosomer, og som er fri for gjær, bakterier og mykoplasma. Målrett mot en cellelinje som du vet overføres under dine betingelser ved institusjonen din. Bruk en foreldrecellelinje som er på laveste passeringsnummer tilgjengelig (helst mindre enn passeringsnummer 16). Minimer tiden som den målrettede linjen er dyrket. Kontroller at målrettede cellelinjer har det normale antall kromosomer. Test din cellelinje for mycoplasma. Noen cellelinjer vil ikke overføre selv når alle disse parametrene er til din fordel. Selv under optimale forhold vil bare to tredjedeler av målrettede ES-cellelinjer overføres gjennom kimlinjen. Start derfor med minst tre uavhengige målrettede cellelinjer for å sikre overføring.

jeg har svake kimærer / kvinnelige kimærer. Vil de overføre knockout?
både svake kimærer og kvinnelige kimærer kan overføre mutante alleler, men sjelden. Mannlige kimærer som sannsynligvis vil overføre den målrettede mutasjonen, kan identifiseres ved kopulatorisk pluggenotyping. Bare ca 10% av kvinnelige kimærer overfører ES-cellegenomet, når de gjør DET, er det bare i de første kullene, og mange av deres mannlige avkom har sexkromosomaneuploidier som gjør dem ufruktbare (Bronson et al.( 1995 PNAS 92, 3120).

hvorfor døde mine sterkeste kimærer?
Dødeligheten kan øke med andelen av dyret som kommer FRA ES-celler, selv for de beste cellelinjene. Denne dødeligheten skyldes i stor grad epigenetiske avvik som oppsto i kulturen. De epigenetiske avvikene antas å bli korrigert ved etterfølgende avl av overlevende mus, og vil segregere tilfeldig bort fra målrettet locus, selv om de ikke var det.

Hvilken stamme av mus avler jeg mutantene mine til?
for å minimere genetisk variabilitet så raskt som mulig avle kimærene til samme bakgrunn som ES-cellene. HVIS ES-cellene var 129, avle kimærene til 129 mus og mutasjonen din vil være helt på 129 innavlet bakgrunn i ett trinn. DEN vanligste innavlede bakgrunnen for genetiske studier er c57bl / 6-stammen. HVIS ES-cellene DINE ER C57BL / 6, kryss kimærene dine TIL c57bl / 6j-mus. Hvis du ønsker å endre bakgrunnen, er standarden å gjøre 9 serielle kryss til den innavlede stammen av valg (ca 2,5 år). Begrunnelsen for 9 generasjoner er forklart her Av Lee Silver. Alternativt, omtrent halvparten av antall generasjoner er nødvendig av markør-assistert backcross, eller hastighet congenics.For maksimal reproduksjon, kryss musene dine på EN utavlet stamme som CD1. CD1-mus ble avledet fra Sveitsiske mus, har en høy grad av genetisk variasjon og ble valgt for robust reproduksjon.

ES-Celler Med Betingede Alleler fra EUCOMM
hver cellelinje fra EUCOMM vil kreve at Du fullfører En Materialoverføringsavtale. Start denne prosessen så tidlig som mulig.
generasjonstiden til mus og antall kryss som er nødvendige for å generere de eksperimentelle musene, kombineres til en lengre tid som er overraskende for de som ikke er vant til musgenetikk, så planlegg fremover. Generasjonstiden for mus (tiden fra seksuelt moden voksen til seksuelt moden avkom) er ca 3 måneder.
EUCOMM betingede alleler har vanligvis en Frt-flankert kassett(en» Frt-ed » kassett). Kassetten har en spleiseacceptor som avleder nesten all spleising i kassetten, noe som gjør allelet til en tap-av-funksjon mutasjon i denne konfigurasjonen. For å generere den betingede allelen må Den Frt-flankerte kassetten fjernes ved å krysse Til Flpe-uttrykkende mus. Flpe / Frt-systemet er sammenlignbart, men forskjellig fra Cre/LoxP-systemet.
VI vil injisere ES-cellene i vertsembryoer for å lage kimære mus. Derfra vil du avle musene for å generere mus som bærer mutasjonen (germline-overføring). Denne grunnleggeren generasjon av mus kan krysses til mus som uttrykker Flpe å fjerne Frt-ed kassett, genererer betinget allel. Deretter må du gjøre flere kryss for å generere eksperimentelle mus.

1. FRA ES-celleinjeksjon til voksne seksuelt modne kimærer er generasjonstiden for mus (3 måneder).
2. kimærene blir avlet til villtype mus for å etablere mutanten i kimlinjen (3 måneder).
3. de heterozygote frtd-betingede musene krysses til Flpe som uttrykker homozygoter. Dette genererer Flpe / o, frtd betinget/ + avkom. (3 måneder)
4. Flpe/o, frtd betinget/+ mus er krysset til vill type for å etablere utskåret allel i germline og avle Bort Flpe, og excision er verifisert molekylært i disse betinget / + mus (3 måneder).
5. de betingede/+ musene avlet deretter til hverandre for å lage homozygote betingede allelmus (3 måneder).
6. de betingede / betingede musene blir avlet til vevsspesifikke-Cre/vevsspesifikke-Cre, null / + mus for å lage eksperimentelt vevsspesifikke-Cre / o, betingede / nullmus og kontrollvevsspesifikke-Cre / o, betingede / + mus.

I tillegg Må Fple -, null -, Cre-musene oppnås, de vevsspesifikke-Cre/vevsspesifikke-Cre, null/ + mus må avles.
også den betingede allelen skal analyseres for å avgjøre om den er vill type i funksjon før excision med Cre, og null etter excision med Cre. For å avgjøre om det betingede allelet er villtype i funksjon før excision, bør betingede/betingede og betingede/null mutanter undersøkes for å avgjøre om deres fenotype er den samme som henholdsvis +/+ og null/+ musene. For å avgjøre om Cre-excised betinget er et nullallel, krysses betingelsen til en germline Cre-mus og de utskårne betingelsene krysses for å teste om fenotypen av utskåret betinget / utskåret betinget er den samme som null/null og / eller at ingen protein er laget av det utskårne betingede allelet.
en reporter Av Cre-aktivitet Som RosaReporter, eller mer ideelt, viser direkte at proteinet av interesse er fraværende fra målcellene ved immunfluorescens, er en viktig kontroll. RosaReporter genererer permanent beta-galaktosidase uttrykk i alle celler som ble utsatt For Cre.
Overdreven Cre-uttrykk kan føre til kromosombrudd som kan forårsake fenotyper som ikke er relatert til funksjonen til det betingede allelet. Derfor er søskenmus som uttrykker Cre, men beholder noen genfunksjon (for eksempel betinget/+) en viktig kontroll.