HVORDAN UTFØRE DNA-Ekstraksjon Fra Tørkede Blodflekker Ved Hjelp Chelex Harpiks

Hver bio – forsker som ønsker å analysere DNA vet at prosessen begynner med utvinning AV DNA fra celler av interesse. Disse cellene kan være Rbc, parasitter eller bakterier for å nevne noen. Videre er det ulike DNA-ekstraksjonsmetoder1 å velge mellom, avhengig av prøvetype, nedstrømsanalyse og så videre. Mange forskere starter med tørket blod flekker (dbs) og så hvordan å trekke UT DNA fra slike prøver er av spesiell interesse. EN DBS fremstilles vanligvis ved å samle blod på Et Whatman FTA card2 Eller Whatman kromatografisk 3 mm filterpapir, og la det tørke i en periode (~4 timer) før behandling. Denne metoden for bio-prøvetaking har blitt brukt i flere tiår.

en nyttig metode for å isolere DNA fra slike prøver ved BRUK AV Bt Chelex 100 Resin3 er beskrevet nedenfor.

Trinn Ett: Erytrocytlysis

• Klipp ut et tørt blodpunkt og legg det i et mikrosentrifugerør (1,5 ml) ved hjelp av en hullpuncher. Ikke glem å merke røret, spesielt når du arbeider med flere prøver. For kvalitetskontroll formål, også inkludere en positiv kontroll blod flekk.
• Tilsett 1 ml 0,5% saponin i mikrosentrifugerøret som inneholder blodpunktet. Lukk, vortex og inkuber ved 4 0C i minst 4 timer, eller enda bedre, over natten. I dette trinnet saponinkomplekser med kolesterol i erytrocytmembranen som fører til dannelse av porer i membranen og dermed hemolyse.4 Saponin Er et vanlig lysisreagensmiddel for å frigjøre parasitter (for eksempel malariaparasitter) fra røde blodlegemer.
• Spinn I noen sekunder ved 4000 o / min, for å fjerne dråper fra det indre lokket, og aspirere saponinen fra røret ved hjelp av en ikke-barriere pipettespiss festet til en pasteur pipette på en vakuummonteringsmaskin. En plast pasteur pipette kan også brukes. La stedet stå i mikrocentrifugerøret.

Trinn To: Vask

• Tilsett 1 ml fosfatbufret saltvann i mikrosentrifugen, lukk, vortex og inkuber ved 4 0C i 20-30 minutter. Inkubering over natten vil ikke forårsake skade. Dette trinnet sikrer at saponin fjernes fra røret.
• Spinn i noen sekunder ved 4000 rpm, og fjern DERETTER PBS, på samme måte som du fjernet saponinen. La stedet stå i mikrocentrifugerøret.

Trinn tre: DNA-Ekstraksjon Med Chelex Harpiks

Prinsipp: Chelex harpiks virker ved å hindre DNA-nedbrytning fra nedbrytende enzymer (Dnaser) og fra potensielle forurensninger som kan hemme nedstrøms analyser. Generelt vil Chelex-harpiksen fange slike forurensninger, og etterlate DNA i oppløsning. Chelex harpiks arresterer kationer som Mg2+, en viktig co-faktor For DNase handling, dermed beskytte DNA fra nedbrytning.5,6

• Pipette Og tilsett 150µ av 6,7% Chelex harpiksløsning i mikrosentrifugerøret som inneholder flekken. Lukk røret. En viktig påminnelse: når du forbereder 6,7% Chelex-løsningen, bruk vann som er fri For Dnaser ,nukleaser (eller noe som kan skade OG forringe DNA).
• Inkuber ved 95 0C i 10 minutter ved hjelp av en varmeblokk / shaker. Det er viktig å åpne røret to ganger, hvert 2. minutt, for å frigjøre trykk, og deretter riste i noen sekunder etterpå. DETTE frigjør DNA til løsning.

Trinn Fire: Unngå Chelex Harpiks Perler I Siste Ekstrakt

• Spinn i 5 minutter ved 4000 rpm
• Pipette så mye ekstrakt som mulig inn i et mindre mikrosentrifugerør (0,6 ml)ved hjelp av en aerosolbarrierespiss mens du unngår overføring Av Chelex perler.
• Sentrifuge 0,6 ml mikrocentrifuge ved 4000 rpm i 10 minutter. Ideen om det andre spinnet er å fjerne eventuelle gjenværende Chelexperler som kan bære over i det endelige ekstraktet. Hvorfor er dette viktig? To hovedårsaker: 1) Chelex binder seg til magnesiumioner (viktig ko-faktor For Taq polymerase brukt I PCR) og 2) Chelex fluoresces. Hvis fluorescens er din måte å visualisere et resultat, kan dette skape en falsk positiv.
• Pipette ca. 100 µ og overfør det endelige ekstraktet til et nytt mikrosentrifuge. Merk og oppbevar i kjøleskap.

Noen Tips Mens DU GJØR DNA-Ekstraksjoner

• Arbeid i et rent miljø uten forurensninger
• Bruk pipettespisser som er fri for nukleaser
• Håndter alle prøver med hansker
• igjen, unngå Chelex perler i ditt siste ekstrakt

konklusjon

Chelex Resin7, Gir En Enkel Og Rask Dna-Ekstraksjonsmetode Fra Dbs, For Bruk I Ulike Molekylære Analytiske Applikasjoner. Denne metoden krever ikke dyrt utstyr og er pålitelig når den testes mot andre metoder.

1. GE Healthcare (2010). Pålitelig Utvinning AV DNA Fra Whatman FTA-Kort. Søknad Notat 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, STORBRITANNIA: GE Healthcare.
2. Whatman (n.d.). Forbereder EN FTA-Plate FOR DNA-Analyse. Whatman FTA Protokoll BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex® 100 Og Chelex 20 Chelaterende Ionebytterharpiks Bruksanvisning. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad Laboratories.
4. Baumann, E., Stoya, G., Vö, A., Richter, W., Lemke, C. og Linss, W. (2000). Hemolyse av humane erytrocytter med saponin påvirker membranstrukturen. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Ekstraksjonsprotokoll: Chelex. IBRC nettsted. Hentet fra http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J., Og Staton, P. (n.d.). Utvikling Og Intern Validering Av En Chelex ® DNA Ekstraksjonsprotokoll for Referanse Oral Swabs.
7. Walsh, PS, Metzger, Da, Og Higuchi,R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 som Et Medium For Enkel Ekstraksjon AV DNA FOR PCR – Basert Typing fra Rettsmedisinske Materiale. Bioteknologi, 54(3), 134-139.