Antistoffer
Rabbit IgG (Sigma) konjugert Til Dynabeads ble brukt mot TAP-taggede stammer der TAP-taggen som inneholdt Protein A var målet. Millipore 07-729 antistoff ble brukt mot k562 prøver rettet MOT CTCF.
tn5 rensing
en tilpasset konstruksjon Av Tn5 E54K E110K P242A L372P14 i en pet-45b( + ) vektor ble bestilt (GenScript) for å uttrykke hyperaktiv Tn5 med En N-terminal His6-tag. Plasmidet er tilgjengelig På Addgene (Addgene ID: 112112). BL21 (DE3) Kompetente E. coli-celler (New England Biolabs) ble transformert og en enkelt koloni ble dyrket ved 37 °C til EN OD600 PÅ 0,4 I 500 ml LB + 50 µ/ml ampicillin + 30 µ/ml kloramfenikol. Cellene ble overført til en 25 °c-inkubator og indusert med 0,5 mM isopropyl-β-d-galaktopyranosid i 4 timer. cellene ble samlet inn ved sentrifugering, vasket en GANG MED ST-Buffer, og cellepellet ble flashfrosset i flytende nitrogen.
Tn5 ble renset som tidligere beskrevet 10, med få modifikasjoner. Kort tid ble cellene resuspendert i 10 volumer (ml/g) TEGX100 Buffer (20 Mm Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glyserol, 0,1% Triton-x 100) som inneholdt KPI og 100 µ fenylmetylsulfonylfluorid og lysert ved inkubasjon med lysozym (Sigma; 1 mg / 1 g cellepellet) ved romtemperatur i 30 min. Lysatet ble sentrifugert ved 20 000 hryvnias g i 20 minutter ved 4 °C, og supernatanten ble utfelt med 0,25% polyetylenimin (Sigma) og sentrifugert ved 10 000 hryvnias g i 15 minutter. Supernatanten ble deretter utfelt med 47% metning ammoniumsulfat (0.28 g/ml) over en 30 min inkubasjon, og deretter sentrifugert ved 20.000 × g i 15 min.
pelleten ble deretter resuspendert i 50 ml Nikkelaffinitetsbelastningsbuffer (50 mm kaliumfosfat, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glyserol) og lastet på En HisTrap HP-kolonne (GE Healthcare; 5 ml) ved 1,5 ml/min likevekt med samme buffer. Kolonnen ble sekvensielt vasket Med Vaskebuffer I (50 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidazol, 20% glyserol), Vaskebuffer II (50 mM kaliumfosfat, pH 7.4500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glyserol) og Deretter ble Tn5 eluert Med Nikkelaffinitetselueringsbuffer (50 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 500 mM KCl, 500 mM imidazol, 20% glyserol) ved 2 ml / min. Eluatet ble fortynnet til 300 mM KCl Med Fortynningsbuffer (50 mm kaliumfosfat, pH 7,4, 20% glyserol), og sluttvolumet ble justert til 50 ml MED TEGX300 Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glyserol, 0,1% Triton-x 100).
deretter ble prøven lastet på En HiTrap HEPARIN HP-kolonne (GE Healthcare; 1 ml) equilibrated MED TEGX300 ved 1 ml / min. Etter vask med 5 kolonnevolumer buffer ble en 10 ml lineær (300 mM til 1,2 M) nacl-gradient kjørt for å eluere. Tn5 eluert fra kolonnen på ca 600 mM NaCl. Fraksjoner som inneholdt hoved elusjonstoppen ble kombinert (3,5 ml) og dialysert over natten mot TEGX300 Buffer inneholdende 30% glyserol, og deretter lagret ved -80 °C.
gjærkromatinpreparat
Tap-merkede Saccharomyces cerevisiae-stammer (Åpne Biosystemer) ble dyrket i 500 ml gjærpeptondeksrosemedier til EN OD600 = 0,8 ved 25 °C. Celler ble tverrbundet med formaldehyd ved en endelig konsentrasjon på 1% i 15 min ved romtemperatur, og slukket med en endelig konsentrasjon på 125 mM glycin i 5 min. Cellene ble oppsamlet ved sentrifugering og vasket i 1 ml ST-Buffer (10 Mm Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) ved 4 °C og delt i to alikvoter. Cellene ble pelletert igjen, supernatanten ble fjernet, og pelleten ble flashfrosset.
en 250 ml kultur aliquot ble lysert i 750 µ AV FA Lysisbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% natriumdeoksykolat og KPI) og 1 ml volum på 0,5 mm zirkonium / silikaperler ved bead juling i En Mini-Beadbeater-96 maskin (Biospec) i tre sykluser med 3 min på/5 min av sykluser (Prøver ble holdt på is under av syklusen). Lysatet ble overført til et nytt rør og mikrosentrifugert ved maksimal hastighet i 3 min ved 4 °C for å pellet kromatinet. Supernatanten ble kassert, og pelleten ble resuspendert i 750 µ AV FA Lysisbuffer supplert med 0,1% SDS og overført til et 15 ml polystyren konisk rør. Prøven ble deretter sonikert I En Bioruptor (Diagenode) i 15 sykluser med 30 s på/av intervaller for Å oppnå DNA-fragmenter 100 til 500 bp i størrelse. En ChIP-exo-analyse behandlet tilsvarende 50 ml cellekultur (~6 × 108 celler). Dette representerer et praktisk beløp i stedet for et minimumsbeløp som trengs.
k562 kromatinpreparat
Humane kroniske myelogene leukemiceller (K562, ATCC) ble opprettholdt mellom 1 × 105 og 1 × 106 celle/ml i DMEM-medier supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 °C med 5% CO2. Cellene ble vasket MED PBS (8 Mm Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl og 2,7 mM KCl), deretter kryssbundet med formaldehyd ved en endelig konsentrasjon på 1% i 10 min ved romtemperatur, og slukket med en endelig konsentrasjon på 125 mM glycin i 5 min. Supernatanten ble fjernet, og cellene ble resuspendert i 1 ml PBS for å vaske. Celler ble aliquoted for å inneholde 100 millioner celler, sentrifugert, supernatanten ble fjernet, og pelleten ble flashfrosset.
En 100 millioner celle aliquot (til bruk i flere ChIPs) ble lysert i 500 µ (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40, og komplett proteasehemmer (CPI, Roche)) ved inkubering på is i 10 min. Lysatet ble mikrocentrifugert ved 2500 rpm i 5 min ved 4 °C. supernatanten ble fjernet, pelleten resuspendert i 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS OG KPI), og inkubert på is i 10 min for å lyse kjernene. Prøven ble fortynnet med 600 µ immunopresipitasjonsfortynningsbuffer (Ip-Fortynningsbuffer: 20 Mm Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 og KPI) til en endelig konsentrasjon på (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-x 100, 0.2% SDS og KPI), og sonikert Med En Bioruptor (Diagenode) i 10 sykluser med 30 s på/av intervaller for Å oppnå DNA-fragmenter 100 til 500 bp i størrelse.
Mus vev forberedelse
16 uker gamle voksne mannlige mus hjerne, lunge, lever og nyre vev ble sjenerøst levert Av Dr. Yanming Wang Mus vev ble behandlet på 100 mg og kromatin ble generert som tidligere beskrevet21 med mindre modifikasjoner. Kort sagt ble 100 mg musvev hakket i stykker på is, festet med 1% formaldehyd i 10 min, og deretter slukket med en endelig konsentrasjon på 125 mM glycin i 5 min. Cellene ble spunnet, vasket MED PBS og deretter resuspendert i 1 mL Kald Farnham cellelysebuffer (20 Mm Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 og KPI). Celler ble deretter inkubert på en rototorque i 20 min ved 4 C. Isolerte kjerner ble isolert ved spunnet ned og resuspendert I RIPA nukleær lysisbuffer (1 × pbs, 1% NP-40, 0,5% Nadeoksykolat, 0,5% SDS og KPI). Kjerner ble deretter sonikert Med En Bioruptor (Diagenode) i 10 sykluser med 30 s på/av intervaller for å generere DNA i 100-500 bp-størrelsesområdet. Levercelletall ble estimert som tidligere beskrevet22, ved bruk av en konverteringsfaktor på 1 mg vevsvektvekt tilsvarer ~250 000 celler.
Kromatinimmunopresipitasjon
en 50 ml kultur-ekvivalent av gjær eller 10 millioner celle-ekvivalent Av k562 kromatin ble fortynnet til 200 µ med IP-Fortynningsbuffer og inkubert over natten ved 4 °C med passende antistoff. Et 10 µ sengevolum IgG-Dynabeads ble tilsatt til gjærprøvene; og 3 µ ANTI-CTCF-antistoff med en 10 µ slurry-ekvivalent Av Protein A Mag Sepharose (GE Healthcare) ble tilsatt til k562-prøvene.
ChIP-exo 1.1
ChIP-exo 1.1 ble utført som tidligere beskrevet7, 8, 23. Kort sagt ble følgende enzymatiske trinn utført med immunoprecipitert kromatin fortsatt på harpiksen med flere saltvasker mellom hvert trinn: T4 DNA polymerase slutten polering, t4 polynukleotid kinase, Klenow fragment a-tailing, T4 DNA ligase-mediert Read_2 adapter ligation, phi29 DNA polymerase fill-in, andre T4 polynukleotid kinase, lambda eksonuklease fordøyelse, Og RecJf eksonuklease fordøyelse. Etter omvendt tverrbinding og Proteinase K-behandling over natten ble følgende trinn utført i oppløsning: phi29 primerforlengelse, andre Klenow-fragment A-tailing, T4 DNA-ligase-mediert Read_1 adapter ligering Og PCR.
ChIP-exo 3.0 og 3.1 (tagmenteringsbasert versjon)
etter immunoprecipitasjon ble følgende trinn utført på harpiksen. For å montere Transposasen ble Tn5 inkubert i en 10 × Transposase-Blanding som inneholder følgende komponenter og inkubert i 30 min ved romtemperatur: 12.5 µ tn5, 50% glyserol og 7.5 µ adapter (NexA2/ME comp). Se Supplerende Tabell 1 for oligonukleotidsekvenser brukt i denne studien.
ChIP materialet på harpiks ble vasket sekvensielt MED FA Lysis Buffer, NaCl Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-x 100, 0.1% natriumdeoksykolat), LiCl-Buffer (100 Mm Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksykolat) og 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ved 4 °C.
tagmenteringsreaksjonen (30 µ) som inneholder: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% dimetylformamid og 1 × tagmenteringsblanding fra trinn 1 (Endelig Konsentrasjon: 1,25 µ tn5, 5% glyserol, 750 nm adapter) Ble Inkubert i 30 MIN VED 37 °c. etter inkubering ble harpiksen vasket to ganger med guanidinhydrokloridbuffer (50 mm tris-hcl, ph 7,5, 500 Mm Guanidinhydroklorid, 2 Mm edta, 1% triton-x 100, 0.1% natrium deoxycholate) i 5 min ved 37 °C, deretter en gang med LiCl Buffer og 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C.
fill-i-reaksjon (30 µl) inneholder: 10 U phi29 polymerase (NEB), 1 × phi29 reaksjon buffer (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA, og 165 µM dntp ble inkubert i 20 min på 30 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. kinase reaksjon (30 µl) inneholder: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 DNA Ligase Buffer (NEB), og 2 × BSA ble inkubert i 15 min ved 37 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. λ exonuclease fordøyelsen (100 µl) som inneholder: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reaksjon buffer (NEB), 0.1% Triton X 100, og 5% DMSO ble inkubert i 30 min ved 37 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. RecJf exonuclease fordøyelsen (100 µl) inneholder: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton X 100, og 5% DMSO ble inkubert i 30 min ved 37 °C; deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C.
DNA ble eluted fra harpiks, og omvendt cross-linking og Proteinase K behandlingen ble utført (40 µl) inneholder: 30 µg Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl og 0,5% SDS inkubert i 16 h ved 65 °C. supernatanten ble deretter overført til et nytt rør og renset med Agencourt AMPure magnetiske perler (Beckman Coulter) etter produsentens instruksjoner og ved bruk Av 1,8 × volum Ampur slurry tilsatt TIL DNA-volumet (72 µl).Prøven ble eluert fra Ampurperlene i 10 µ vann, og følgende enzymatiske trinn ble utført i oppløsning.
Adapterligering (versjon 3.0): for grunningsforlengelsesreaksjonen (totalt reaksjonsvolum 20 µ); til resuspendert prøven var lagt til 1 × phi29 reaksjon buffer, 2 × BSA, 100 µM dntp, og 0,5 µM MEG sekvens oligonukleotid (totalt 9 µl) og inkubert i 5 min ved 95 °C, deretter 10 min ved 45 °C for å tillate oligo tid til å bindes spesifikt. Prøven ble flyttet til 30 °C før du legger til 10 U phi29 polymerase (1 µl) og inkubert i 20 min på 30 °C, deretter i 10 min ved 65 °C til inactivate, og flyttet til 37 °C.
For En-tailing reaksjon (total reaksjon volum 30 µl); til primer extension reaksjon var lagt til 10 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (totalt 10 µl) og inkubert i 30 min ved 37 °C, deretter i 20 min ved 75 °C til inactivate, og flyttet til 25 °C. For det andre adapteren ligation reaksjon (total reaksjon volum 40 µl); til A-tailing reaksjon var lagt til 2,000 U T4 DNA ligase (enzymatics), 1 × NEBNext Rask Ligation-Buffer (NEB), 375 nM-adapter (ExA1-58/13) og inkubert for 1 t ved 25 °C.
Skinne ligation (versjon 3.1): for kort ligation (40 µl); til resuspendert DNA ble det tilsatt 1200 U T4 DNA-ligase, 1 × t4 DNA-Ligasebuffer, 375 nM-adapter (ExA1-58/ExA1-Ssl_n5) og inkubert i 1 time ved 25 °C.
både versjon 3.0 og 3.1: ligeringsreaksjonen ble deretter renset Med Ampurperler og resuspendert i 15 µ vann. Prøven ble deretter forsterket VIA PCR. FOR PCR-forsterkning (totalt reaksjonsvolum 40 µ); til resuspendert DNA ble det tilsatt 2 U-Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µ dntps, 500 nM hver primer (P1.3 Og NexA2-iNN) og forsterket i 18 sykluser (20 s ved 98 °c denature, 1 min ved 52 °c gløding og 1 min ved 72 °c forlengelse). En fjerdedel av reaksjonen ble forsterket i ytterligere seks sykluser (24 totalt) og tilstedeværelsen av biblioteker ble bestemt ved elektroforese på en 2% agarosegel.
Størrelsesvalg: 200-500 bp PCR-produkter ble gelrenset fra en 2% agarosegel ved Bruk Av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
ChIP-exo 4.0 og 4.1 (single-strand DNA ligation versjoner)
etter immunoprecipitation ble følgende trinn utført på harpiksen. ChIP materiale på harpiks ble vasket i serie med FA Lyse Buffer, NaCl Buffer, LiCl Buffer, og 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. slutten reparasjon reaksjon (50 µl) inneholder: 7.5 U T4 DNA-polymerase (NEB), 2.5 U DNA-Polymerase jeg (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, og 390 µM dntp ble inkubert i 30 min på 12 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. λ exonuclease fordøyelsen (100 µl)inneholder: 20 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reaksjon buffer, 0.1% Triton X 100, og 5% DMSO ble inkubert i 30 min ved 37 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 av 4 °C. RecJf exonuclease fordøyelsen (100 µl)inneholder: 75 U RecJf exonuclease, 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton X 100, og 5% DMSO swas inkubert i 30 min ved 37 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C.
Første adapter ligation: ssDNA ligation (versjon 4.0, 40 µl): for adapterion ligation 1200 U T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, og 375 nM single-strand-adapter (ExA1-58-N5) ble inkubert for 1 t ved 25 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C.
Skinne ligation (versjon 4.1, 40 µl): 1200 U T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffer, og 375 nM-adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) ble inkubert for 1 t ved 25 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C.
Både versjon 4.0 og 4.1: DNA ble eluted fra harpiks, og omvendt cross-linking og Proteinase K behandlingen ble utført (40 µl) inneholder: 30 µg Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, og 0,5% SDS inkubert for 16 h ved 65 °C.
supernatanten ble deretter overført til et nytt rør og renset med Agencourt AMPure magnetiske perler (Beckman Coulter) etter produsentens instruksjoner(1,8 × volum). Prøven ble eluert fra Ampurperlene i 20 µ vann, og følgende enzymatiske trinn ble utført i oppløsning.
Andre adapterligasjon: ssDNA-ligering (versjon 4.0, totalt reaksjonsvolum 40 µ): til resuspendert DNA ble det tilsatt 1200 U T4 DNA-ligase, 1 × t4 DNA-Ligasebuffer, 375 nM-adapter (ExA2. 1-N5 / ExA2. 1-20) og ble inkubert i 1 time ved 25 °C.
Ligering Av Splintadapter (versjon 4.1, totalt reaksjonsvolum 40 µ): til resuspendert DNA ble det tilsatt 1200 U T4 DNA-ligase, 1 × t4 DNA-Ligasebuffer, 375 nM-adapter (ExA1-58/ExA1-Ssl_n5) og ble inkubert i 1 time ved 25 °C.
både versjon 4.0 og 4.1: ligeringsreaksjonen ble deretter renset med ampure perler (1,8 × volum) og Resuspendert i 15 µ med vann. Prøven ble deretter forsterket VIA PCR. FOR PCR-forsterkning (totalt reaksjonsvolum 40 µ); til resuspendert DNA ble det tilsatt 2 U Phusion Hot Start polymerase( Thermo scientific), 1 × phusion Hf Buffer( Thermo scientific), 200 µ dntp, 500 nM hver primer (P1.3 og NexA2-iNN) og forsterket i 18 sykluser (20 s ved 98 °c denatur, 1 min ved 52 °C gløding, 1 min ved 72 °C forlengelse). En fjerdedel av reaksjonen ble forsterket i ytterligere seks sykluser (24 totalt) og tilstedeværelsen av biblioteker ble bestemt ved elektroforese på en 2% agarosegel. Størrelsesvalg: 200 til 500 bp PCR-produkter ble gelrenset fra en 2% agarosegel ved Hjelp Av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Merk: ChIP-exo 4.0 / 4.1 innlemmet en universell Read_2 adapter, med strekkoden lagt til senere UNDER PCR med lange primere. Når lange PCR-primere ble brukt i en bibliotekskonstruksjon som involverte lambda-eksonuklease-fordøyelse, led bibliotekene av lavt utbytte og høye adapterdimere. Vi bruker nå bare full lengde adaptere og minimum lengde PCR primere.
ChIP-exo 5.0
etter immunoprecipitasjon ble følgende trinn utført på harpiksen. ChIP materiale på harpiks ble vasket i serie med FA Lyse Buffer, NaCl Buffer, LiCl Buffer, og 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. For A-tailing reaksjon (50 µl) inneholder: 15 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, og 100 µM dATP ble inkubert i 30 min ved 37 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. Den første adapter ligation og kinase reaksjoner (45 µl) inneholder: 1200 U T4 DNA ligase, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Rask Ligation-Buffer, og 375 nM-adapter (ExA2_iNN / ExA2B) ble inkubert for 1 t ved 25 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. Fill-i-reaksjon (40 µl) inneholder: 10 U phi29 polymerase, 1 × phi29 reaksjon buffer, 2 × BSA, og 180 µM dntp ble inkubert i 20 min på 30 °C, deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. λ exonuclease fordøyelsen (50 µl) inneholder: 10 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reaksjon buffer, 0.1% Triton X 100, og 5% DMSO ble inkubert i 30 min ved 37 °C; deretter vasket med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C.
DNA ble eluted fra harpiks, og omvendt cross-linking og Proteinase K behandlingen ble utført (40 µl) som inneholder: 30 µ Proteinase K, 25 Mm Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl og 0,5% SDS inkubert til 16 timer ved 65 °C. supernatanten ble deretter overført til et nytt rør og renset med Agencourt AMPure magnetiske perler (Beckman Coulter) etter produsentens instruksjoner (1,8 × volum).Prøven ble eluert fra Ampurperlene i 20 µ vann, og følgende enzymatiske trinn ble utført i oppløsning. For andre adapter ligering (totalt reaksjonsvolum 40 µ): til resuspendert DNA ble det tilsatt 1200 U T4 DNA-ligase, 1 × t4 DNA-Ligasebuffer, 375 nM-adapter (ExA1-58 / ExA1-Ssl_n5) og ble inkubert i 1 time ved 25 °c. ligeringsreaksjonen ble deretter renset med Ampurperler (1,8 × volum) og resuspendert i 15 µ vann.
prøven ble deretter forsterket VIA PCR. FOR PCR-forsterkning (totalt reaksjonsvolum 40 µ); til resuspendert DNA ble det tilsatt 2 U-Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µ dntps, 500 nM hver primer (P1.3 og P2.1) og forsterket i 18 sykluser(20 s ved 98 °c denature, 1 min ved 52 °c annealing, 1 min ved 72 °c forlengelse). En fjerdedel av reaksjonen ble forsterket i ytterligere seks sykluser (24 totalt) og tilstedeværelsen av biblioteker ble bestemt ved elektroforese på en 2% agarosegel. Størrelsesvalg: 200 til 500 bp PCR-produkter ble gelrenset fra en 2% agarosegel ved Hjelp Av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Merk: vi har funnet ut at bruk av en annen metode enn gelrensing på dette stadiet fører til et uakseptabelt høyt nivå av adapterdimere i den endelige prøven. Gelrensing kan effektivt skille adapterdimeren (150 bp-fragment) og mindre fragmenter Av ChIP-exo-biblioteket (200 bp-fragment = 150 bp-adaptere + 50 bp-innsats).
DNA-sekvensering
DNA-sekvensering Med Høy gjennomstrømming ble utført Med En NextSeq 500 i sammenkoblet endemodus som ga 2 × 40 bp-leser. Sekvenslesninger ble deretter justert til gjær (sacCer3) og menneskelige (hg19) genomer ved hjelp av bwa-mem (v0.7.9 a)24. Justert leser ble filtrert for å fjerne ikke-unike justeringer OG PCR duplikater. PCR-duplikater ble definert som sekvenslesninger som hadde identiske read_1-og Read_2-sekvenser.
datatilgjengelighet
alle sekvenseringsfiler og toppfiler fra denne studien er tilgjengelige VED NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under tiltredelsesnumrene GSE110681 og GSE114606. Koordinatfiler, skriptparametere og egendefinert kode som brukes til å generere tallene for dette papiret, kan lastes ned fra: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.
alle andre data er tilgjengelige fra forfatterne på rimelig forespørsel.