Enkeltmutasjon I et høyt konservert område av kloramfenikol acetyltransferase muliggjør isobutylacetatproduksjon direkte fra cellulose av Clostridium thermocellum ved forhøyede temperaturer

Bakteriestammer og plasmider

Bakteriestammer og plasmider som brukes i denne studien er oppført i tabell 2. Clostridium thermocellum DSM1313 ∆hpt (M1354) stamme ble brukt som vert for esterproduksjonen ved forhøyede temperaturer. Det skal bemerkes at sletting av hypoksantinfosforibosyltransferasegenet (Hpt, Clo1313_2927) I villtype DSM1313 tillater genteknologi ved 8-azahypoxanthin (8-AZH) tellervalg; denne slettingen har ingen kjent negativ effekt på cellevekst og metabolisme . Plasmidet pNW33N, som inneholder CATSa, er termostabilt og ble brukt til å uttrykke forskjellige Katter I c. thermocellum. PET-plasmidene ble brukt til molekylær kloning og enzymuttrykk i E. coli.

Kjemikalier og reagenser

alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (MO, USA) og/eller Thermo Fisher Scientific (MA, USA), med mindre annet er spesifisert. For molekylær kloning ble restriksjonsenzymer og T4 ligase oppnådd Fra New England Biolabs (MA, USA). Phusion Hot Start II DNA polymerase ble brukt til polymerasekjedereaksjon (PCR).

Media og dyrking

For molekylær kloning og proteinuttrykk ble e. coli-stammer dyrket i lysogenibuljong (LB) som inneholdt passende antibiotika, med mindre annet er angitt. For in vivo karakterisering Av CATSa I E. coli ble m9 hybridmedium med 20 g/L glukose brukt. FOR c. thermocellum kultur, mtc minimal medium Eller CTFuD-NY medium ble brukt som angitt i forsøkene. Optisk tetthet (OD) ble målt ved et spektrofotometer ved 600 nm bølgelengde (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Analyse Av flere sekvensjusteringer

Analyse av Flere sekvensjusteringer (Msa) ble utført VED HJELP AV MEGA7 . Proteinsekvenser ble justert Av ClustalW og visualisert Av ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr). Nøkkelfunksjonene I proteinstrukturer AV 3U9F , 4cla og 2XAT ble ekstrahert FRA HENHOLDSVIS CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX og CAT4_PSEAE.

Molekylær modellering og docking simuleringer

Tredimensjonale (3d) strukturer

3d-strukturen Av CATSa og alkoholer av interesse ble først generert Ved Hjelp Av Swiss-Modell og ‘Builder’ verktøy AV MOE (Molecular Operating Environment software, versjon 2019.01), henholdsvis. 3d-strukturen til Det doble Substratbegrensede CATSa-komplekset (dvs. acetyl–CoA–isobutanol-CATSa) ble oppnådd ved å ekstrahere en isobutanol fra isobutanol-CATSa-komplekset og deretter legge det til acetyl-CoA-CATSa-komplekset. Alle strukturene ble utarbeidet av ‘QuickPrep’ – verktøyet TIL MOE med standardparametere og ytterligere optimalisert ved energiminimering med Amber10:EHT-kraftfeltet.

Dokkingsimulering

for å utføre dokkingsimuleringer ble den potensielle bindingslommen søkt ved HJELP AV ‘Site Finder’ – verktøyet TIL MOE. Den best scoret området, i samsvar med de rapporterte katalytiske områder, ble valgt for videre studier. Dokkingsimuleringer ble utført som tidligere beskrevet . Kort sagt ble acetyl-CoA og hver alkohol forankret ved hjelp av induced fit-protokollen med Triangle Matcher-plasseringsmetoden og London Δ scoring-funksjonen. Etter dokkingsimuleringene ble den best scoret bindingen, som viste den avgjørende interaksjonen mellom rest og substrat ved ROT-middel-kvadrat-avvik (RMSD) < 2 Å, valgt. Som et eksempel, for acetyl-CoA-docking, ble bindingsposen som viste hydrogenbindingen mellom hydroksylet Av Ser-148 og N71 Av CoA valgt . For alkohol docking ble bindingen som viser hydrogenbindingen Mellom N3 Av His-189 og hydroksyl av alkohol valgt .

i silico mutageneseanalyse

i silico mutageneseanalyse av acetyl-CoA–isobutanol–CATSa-komplekset ble utført som tidligere beskrevet . Spesielt, den’ alanine scan ‘og’ rester scan ‘ verktøy AV MOE ble brukt til å identifisere potensielle rester kandidater for mutagenese.

Molekylær kloning

Plasmid konstruksjon

Plasmider ble konstruert av standard molekylær kloning teknikk av ligase avhengig metode og / Eller Gibson montering ved hjelp av primere oppført I Tilleggsfil 1: Tabell S1. De konstruerte plasmidene ble introdusert I E. coli TOP10 ved varmesjokktransformasjon. Kolonier isolert på en selektiv plate BLE PCR screenet og plasmid renset. De rensede plasmidene ble verifisert via Sanger-sekvensering før de ble omdannet Til E. coli BL21 (DE3). Stedsrettet mutagenese ble utført ved Bruk Av QuickChange™ stedsrettet mutageneseprotokoll med redusert overlapp lengde eller Gibson monteringsmetode . For c. thermocellum engineering ble plasmid pHS005 konstruert først og deretter modifisert til pHS0024. pHS0024 har ingen hpt ved nedstrøms av operonen, mens andre sekvenser av plasmidet er identiske med pHS005.

Transformasjon

de konvensjonelle kjemiske transformasjons-og elektroporasjonsmetodene ble brukt til transformasjon av Henholdsvis e. coli og c. thermocellum. For C. termokellum, metoden ble imidlertid litt modifisert som beskrevet her. Først Ble c. thermocellum M1354 (Tabell 2)dyrket i 50 mL CTFuD-NY medium ved 50 °C inne i et anaerobt kammer (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., ELLER, USA). Cellekulturen MED OD i et område på 0,8–1,0 ble avkjølt ved romtemperatur i 20 min. Utover dette punktet ble alle trinn utført utenfor kammeret. De avkjølte cellene ble høstet ved 6500×g og 4 °C i 20 min. Cellepelletene ble vasket to ganger med iskjølt Milli-Q vann og resuspendert i 200 µ av transformasjonsbufferen bestående av 250 mM sukrose og 10% (v/v) glyserol. Flere 30 µ av de elektrokompetente cellene ble umiddelbart lagret på-80 °C for videre bruk. For elektroporering ble de elektrokompetente cellene tint på is og inkubert med 500-1000 ng metylerte plasmider i 10 min. Deretter, cellene ble overført til en is-kjølt 1 mm gap electroporation kyvette (BTX Harvard Apparatus, MA, USA) etterfulgt av to påfølgende eksponentielle forfall pulser med 1.8 kV, 350 Ω og 25 µ Pulsene resulterte vanligvis i en 7,0 – 8,0 ms tidskonstant. Cellene ble umiddelbart resuspendert i forvarmet Fersk CTFuD-NY og gjenfunnet ved 50 °C under anaerob tilstand (90% N2, 5% H2 og 5% CO2) inne i Et Gummikortet Balch-rør. Etter 0-12 timer med restitusjon ble cellene blandet med smeltet CTFuD-NY agarmedium supplert med 15 µ / mL tiamfenikol. Til slutt ble mediumcelleblandingen hellet på en petriskål og størknet inne i det anaerobe kammeret. Platen ble inkubert ved 50 °C opp til 1 uke til kolonier dukket opp. Transformasjonseffektiviteten var 2-100 kolonidannende enheter per µ plasmid (CFU/µ plasmid).

in vivo karakterisering Av CATSa og dens varianter I E. coli

for in vivo karakterisering Av CATSa og dens varianter I E. coli ble høycelletetthetskulturer utført som tidligere beskrevet med tilsetning av 2 g / L forskjellige alkoholer. For in situ ekstraksjon av estere, ble hvert rør kledde med 25% (v/v) heksadekan. For å bekrefte Proteinuttrykket Til CATSa og dets varianter ble 1% (v/v) av stamceller dyrket over natten ved 37 °C og 200 rpm i 15 mL kulturrør inneholdende 5 mL LB medium og antibiotika. Deretter ble 4% (v/v) av de over natten kulturer overført til 1 mL LB medium inneholdende antibiotika i en 24-brønns mikroplate. Kulturene ble dyrket ved 37 °C og 350 o / min ved bruk av en inkuberende mikroplate shaker (Fisher Scientific, PA, USA) til OD nådde til 0,4-0,6 og deretter indusert av 0.1 mM isopropyl β-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i 4 timer Med En Puste-Lett Tetningsmembran for å forhindre fordampning og krysskontaminering (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). Proteinprøvene ble oppnådd ved BRUK AV b-per complete reagens (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA), i henhold til produsentens instruksjon og analysert AV SDS-PAGE.

Enzymkarakterisering

His-tag rensing

for enzymuttrykk ble en overnattingskultur inokulert med en 1:50 ratio i fersk LB medium inneholdende 1 mM IPTG og antibiotika, etterfulgt av 18 °c inkubasjon over natten (opptil 20 timer) i en ristende inkubator ved 200 rpm. De induserte cellene ble høstet ved sentrifugering ved 4 °C og 4700×g i 10 min. Cellepellet ble deretter vasket en Gang Med Milliporevann og resuspendert I b-per komplett reagens. Etter 30 min inkubasjon ved romtemperatur ble blandingen sentrifugert ved 17 000×g i 2 min. Supernatanten ble samlet og betegnet som rå ekstrakt. For Hans-tag rensing ble det rå ekstraktet inkubert Med HisPur Ni-NTA superflow agarose i en batch som produsenten anbefaler. Deretter ble harpiksen vasket med minst tre volumer vaskebuffer, bestående av 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol og 0,1 mM EDTA. De harpiksbundne proteinene ble eluert med 300 µ elueringsbuffer inneholdende 50 Mm Tris–HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 300 mM imidazol og 0,1 mM EDTA. Den eluerte prøven ble deretter desaltet og konsentrert via En Amicon filterkolonne med 10 kDa molekylvekt cut-off. Til slutt ble proteinprøven suspendert i 200 µ På 20 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0). Proteinkonsentrasjonen ble målt Ved Bradford-analysen med bovint serumalbumin (BSA) som referanseprotein.

Termisk skiftanalyse

for å måle proteinsmeltetemperatur (Tm) ble en termofluoranalyse anvendt MED SYPRO Orange . Omtrent 10-250 µ av Hans-tag renset protein ble blandet med 5× SYPRO Oransje i et 50 µ sluttvolum i en 96-brønns qpcr plate. Platen ble forseglet MED PCR caps før du kjører analysen. StepOne real-time PCR-maskinen (Applied Biosystems, CA, USA) ble brukt til å kjøre analysen med følgende parametere: ROX reporter, 1 °c økning per syklus, 1 min hold i hver syklus og temperaturområde fra 20 til 98 °C. dataene ble samlet inn, eksportert og behandlet for å beregne Tm.

5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoesyre) (DTNB) – analyse

Reaksjonshastigheten for HVER KATT ble bestemt AV EN dtnb-analyse i en 384-brønnplate. Totalt reaksjonsvolum var 50 µ med reaksjonsbuffer bestående av 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Konsentrasjoner av acetyl-CoA (CoALA Biosciences, TX, USA) og alkoholer ble variert som angitt i hvert eksperiment. Endelige enzymkonsentrasjoner på 0,05 hryvnias / mL og 10 hryvnias/mL ble brukt for reaksjonene mot henholdsvis kloramfenikol og alkoholer. Reaksjonskinetikk ble samlet inn ved å måle absorbans ved 412 nm hvert minutt i 1 time ved 50 °C i en mikroplateleser (Synergy HTX mikroplateleser, BioTek). Reaksjonshastigheten ble beregnet ved hjelp av utryddelseskoeffisienten fra en standardkurve av fritt koenzym A (MP Biomedicals, OH, USA) under samme tilstand. Det skal bemerkes at siden den maksimale driftstemperaturen som anbefales for plateleseren er 50 °C, ble høy gjennomstrømmingsenzymanalysen for CAT ved forhøyede temperaturer bare utført for å bestemme enzymkinetikkparametere.

Beregning av kinetiske parametere for reaksjonshastigheter

parametrene For Michaelis–Menten rate law (Eq . 1) ble beregnet for hvert enzym som følger. For det første ble lineær regresjon utført på data samlet fra en mikroplateleser for å identifisere innledende reaksjonshastigheter, \(y_{i}\), ved forskjellige innledende substratkonsentrasjoner, \(s_{i}\), hvor i = {1,2,…, n} er antall datapunkter samlet. Deretter ble disse initielle reaksjonsratene og tilhørende initiale substratkonsentrasjoner for alle replikater samtidig tilpasset Michaelis–Menten-modellen (Eq. 1) ved hjelp av robust ikke-lineær regresjon (Eq. 2) med en myk-L1-tap estimator (Eq. 3) som implementert I scipy numerisk databehandling bibliotek v1. 2. 0 :

minste kvadraters problem bestemmer parametrene \(K_ {\text{M}}\) og \(v_ {\text{max} }\) ved å minimere forskjellen mellom modellens forventede reaksjonshastigheter \(v_{i}\) og målte reaksjonshastigheter \(y_{i}\) (Eq. 2). En utjevningsfunksjon \(\rho \left( z \right)\) brukes til å gjøre det minste firkantede problemet motstandsdyktig mot uteliggere (Eq. 3). På grunn av den objektive motstanden mot utliggere og unngåelse av feil som følge av konvensjonelle lineariseringsmetoder, gir robust ikke-lineær regresjon det mest presise parameterestimatet for Michaelis–Menten-modellen .

Isobutylacetatproduksjon I C. termokellum

Cellobiose-fermentering

Isobutylacetatproduksjon fra cellobiose I C. termokellumstammer ble utført av to-trinns biokonversjonskonfigurasjonen. Celler ble først dyrket I mtc minimal medium inneholdende 5 g / L cellobiose i en gummi avkortet Balch rør TIL OD nådd 0.8-1.0. Cellene ble avkjølt ved romtemperatur i 20 minutter og sentrifugert ved 4700×g og 4 °C i 20 minutter. Etter fjerning av supernatanten ble cellene resuspendert i samme volum av fersk mtc minimalt medium inneholdende 2 g/L isobutanol i et anaerobt kammer. Cellesuspensjonen ble deretter delt inn i 800 µ i et mikrosentrifugerør på 2,0 mL skrukork med et 200 µ heksadekanoverlegg. Cellene ble inkubert ved 55 °C i 24 timer etterfulgt av analyse av gasskromatografi kombinert med et massespektrometer (GC/MS) for å kvantifisere mengden isobutylacetat som ble produsert.

Cellulosefermentering

for cellulosefermentering ble modifisert MTC medium (C-MTC medium) brukt. 20 g / L AVICEL PH-101 ble brukt som en eneste karbonkilde i stedet for cellobiose, og 10 g / L MOPPER ble tilsatt for å øke bufferkapasiteten. Innledende pH ble justert til 7,5 med 5 M KOH og autoklavert. I et anaerobt kammer ble 0,8 mL cellekultur over natten inokulert i 15,2 mL C-MTC medium (1:20 inokuleringsforhold) med 4 mL overlagt heksadekan. Hvert rør inneholdt en liten magnetisk rørestang for å homogenisere cellulose. Det gummikappede Balchrøret ble inkubert i et vannbad forbundet med en temperaturregulator satt til 55 °C og et magnetisk omrøringssystem. Etter pH-justering med 70 ④l av 5 M KOH injeksjon ble det samplet 800 µ cellekultur og 200 µ heksadekanlag hver 12. time. Kultur pH ble opprettholdt innenfor et område på 6,4-7,8 under fermenteringen.

Cellevekst ble overvåket ved å måle pelletsprotein. Cellulose-pelleten fra 800 µ prøvetakingsvolumer ble vasket to ganger med Milli-Q vann og suspendert av 200 µ lysisbuffer (0 .2 M NaOH, 1% SDS) etterfulgt av en time inkubasjon ved romtemperatur. Deretter ble oppløsningen nøytralisert med 50 µ 0,8 M HCl og fortynnet med 550 µ vann. Blandingen ble sentrifugert ved 17 000×g i 3 minutter. Proteinkonsentrasjon fra supernatanten ble analysert ved den vaskemiddelkompatible Bradford-analysen(Thermo Scientific, WA, USA). Restpellet ble kokt i en 98 °C-ovn i en time før kvantifisering av restcellulose.

Restcellulose ble kvantifisert ved fenol-svovelsyremetoden med noen modifikasjoner. Den kokte prøven ble vasket to ganger med Milli-Q vann og suspendert i 800 µ vann for å gi tilsvarende volum til originalen. Prøven ble homogenisert ved pipettering og vortexing i 10 sekunder, og 20 µ av den homogeniserte prøven ble overført til et nytt 2,0 mL mikrosentrifugerør eller en 96-brønnplate og tørket over natten i en 55 °C-ovn. Den tørkede pelleten ble suspendert i 200 µ av 95% svovelsyre og inkubert i en time ved romtemperatur. Etter at pelleten ble oppløst fullstendig, ble 20 µ av 5% fenol tilsatt og blandet med svovelsyreoppløsningen. Etter 30 min inkubasjon ved romtemperatur ble 100 µ av prøven overført til en ny 96-brønnplate, og absorbansen ved 490 nm ble målt. Absorbansen ble omdannet til cellulosekonsentrasjon ved standardkurven TIL Avicel PH-101 behandlet ved samme prosedyre.

Analysemetoder

væskekromatografi med høy ytelse (hplc)

Ekstracellulære metabolitter ble kvantifisert ved bruk av et system med høy ytelse væskekromatografi (Hplc) (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 µ av kulturprøver ble sentrifugert til 17 000×g i 3 min. deretter ble supernatantene filtrert gjennom 0.2 µ filtre og kjørt med 10 mN H2SO4 mobil fase ved 0.6 mL/min På En Aminex HPX-87H (Biorad Inc. Kolonne ved 50 °C. Brytningsindeksdetektor (RID) og ultraviolettdetektor (UVD) ved 220 nm ble brukt til å overvåke konsentrasjoner av sukker, organiske syrer og alkoholer.

gasskromatografi kombinert med massespektroskopi (GC/MS)

Estere ble målt VED GC (HP 6890, Agilent, CA, USA) utstyrt MED EN MS (HP 5973, Agilent, CA, USA). For GC-systemet ble zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) kapillærkolonne (30 m × 0.25 mm × 0.25 µ) brukt til å skille analytter, og helium ble brukt som transportør med en strømningshastighet på 0.5 mL/min. Ovnen temperatur programmet ble angitt som følger: 50 °C første temperatur, 1 °C/min rampe opp til 58 °C-25 °C/min rampe opp til 235 °C-50 °C/min rampe opp til 300 °C, og 2-min bake-out på 300 °C. 1 µL av samplet hexadecane laget ble injisert i kolonnen i splitless-modus med en injektor temperatur på 280 °C. FOR MS-systemet ble valgt ionmodus (SIM) brukt til å oppdage og kvantifisere estere med følgende parametere: (i) etylacetat, m/z 45,00 og 61,00 fra 4,2 til 4,6 min retensjonstid (RT), (ii) isopropylacetat, m/z 45 og 102 fra 4,7 til 5,0 MIN RT, (iii) propylacetat, m/z 59 og 73 fra 5,2 til 5,8 MIN RT, (iv) etylisobutyrat, m/z 73 og 116 FRA 6,1 til 6,6 min rt, (v) isobutylacetat, m/z 61 og 101 fra 6,6 til 7,6 min rt, (vi) butylacetat, m/Z 61 og 116 fra 7,7 til 9,2 min rt, (vii) isobutylisobutyrat, m/z 89 og 129 fra 10,1 til 12.5 MIN RT, (viii) benzylacetat, m/z 108 og 150 fra 13,1 til 13,8 MIN RT, og (ix) 2-fenetylacetat, m/z 104 og 121 Fra 13,8 til 15,5 MIN RT. Isoamylalkohol og isoamylacetat ble brukt som interne standardanalytter. Esterne ble identifisert VED RT og kvantifisert ved toppområder og standardkurver. Standardkurver ble bestemt ved bruk av rene estere fortynnet til heksadekan ved konsentrasjoner på 0,01 g/ L, 0,05 g/ L, 0,1 g/ l, 0,5 g / L og 1 g / L.