den industrielle Anaerobe Clostridium acetobutylicum bruker polyketider for å regulere celledifferensiering

Bakteriestammer og media

c. acetobutylicum ATCC 824 ble dyrket i et anaerobt kammer (Coy Laboratorieprodukter) som inneholder en atmosfære av 97% nitrogen og 3% hydrogen. 2xYTG medium67 inneholdt 16 g / L trypton, 10 g/L gjærekstrakt, 5 g / L nacl og 10 g/l glukose (med mindre annet er angitt) med pH justert til 5.2 for flytende medier og 5,8 for faste medier (inneholder også 15 g / L agar). Clostridial vekstmedium (CGM)68 inneholdt 30 g/L glukose (med mindre annet er angitt), 6,25 g/L gjærekstrakt, 2,5 g/L ammoniumsulfat, 1,25 g/L nacl, 2,5 g/L asparagin, 0,95 g/L monobasisk kaliumfosfat, 0,95 g/L dibasisk kaliumfosfat, 0,5 g/L magnesiumsulfatheptahydrat, 13 mg/L mangansulfatheptahydrat og 13 mg/L jernsulfatheptahydrat med ph justert til 6,4. P2 medium69 inneholdt 80 g / L glukose( med mindre annet er angitt), 1 g/L gjærekstrakt, 2,2 g/L ammoniumacetat, 0.5 g / L kaliumfosfat monobasisk, 0,5 g / L kaliumsulfatdibasisk, 0,2 g / L magnesiumsulfatheptahydrat, 1 mg / L para-aminobenzoesyre, 1 mg/L tiaminhydroklorid, 10 µ/l biotin, 10 mg/L mangansulfatheptahydrat, 10 mg/L jernsulfatheptahydrat og 10 mg/L NaCl med pH justert til 6,4. Clostridial basal medium (CBM)70 inneholdt 10 g / L glukose, 0,5 g/L monobasisk kaliumfosfat, 0,5 g / L dibasisk kaliumfosfat, 4 g / L trypton, 0.2 g / L magnesiumsulfatheptahydrat, 10 mg/L mangansulfatheptahydrat, 10 mg/L jernsulfatheptahydrat, 1 mg/L para-aminobenzoesyre, 1 mg/L tiaminhydroklorid og 2 µ/l biotin med pH justert til 6,9. For faste cgm-plater ble 15 g/L agar tilsatt. CBM-S (brukt til flytende sporulasjonsanalyser) var identisk MED CBM, bortsett fra at 50 g/L glukose ble brukt, og 5 g / L CaCO3 ble tilsatt like før inokulering av kulturer. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) ble dyrket I Luria-Bertani (LB) medium på 37 °C. For Passende Clostridium-stammer ble kulturmedier supplert med erytromycin (Ery; 40 µ / mL for faste medier, 80 µ / mL for flytende medier) og/eller tiamfenikol (Th; 5 µ / mL for faste og flytende medier). Kanamycin (Kan; 60 hryvnias/mL) eller kloramfenikol (Cm; 25 hryvnias / mL) ble tilsatt E. coli kulturmedier som indikert. Clostridium-og e. coli-stammer ble opprettholdt som 20% v / v glyserollagre lagret ved -80 °C.

Plasmid-konstruksjon

Oligonukleotider ble levert Ved Integrert DNA-Teknologi (Supplerende Tabell 5). Phusion polymerase (NEB) ble brukt for ALLE PCR-reaksjoner. For isolering av genomisk DNA Fra c. acetobutylicum ATCC 824 ble en alkalisk lysemetode brukt71. C. acetobutylicum ble dyrket over natten i 2xytg medium til stasjonær fase (OD600 > 2,0), hvor 10 mL kultur ble sentrifugert ved 3500×g i 15 min (romtemperatur). Supernatanten ble kassert og cellepellet resuspendert i 5 mL INNSTILT buffer (75 mM NACL, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Lysozym ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2 mg / mL, og oppløsningen ble forsiktig blandet. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i 60 min med mild blanding utført hvert 15. minutt. Etter inkubasjonsperioden ble det tilsatt 660 µ lysisbuffer (1 M NaOH, 10% w/v SDS), og oppløsningen ble grundig blandet. Proteinase K ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg / mL, og oppløsningen ble inkubert ved 55 °C i 1 time. Etter denne inkubasjonsperioden ble et like volum fenol:kloroform (1:1) tilsatt, og oppløsningen ble blandet ved inversjon i 5 min. Oppløsningen ble deretter sentrifugert ved 3500×g i 15 min( romtemperatur), og den øvre vandige fasen ble kassert ved pipettering. Til den organiske fasen ble 3 m natriumacetat tilsatt (10% v/v i endelig oppløsning). For å utfelle genomisk DNA ble 2 volumer etanol tilsatt og løsningen ble blandet. Utfelt genomisk DNA ble samlet ved hjelp av en glasskrok og vasket med 70% etanol. Det vasket DNA ble deretter tørket over nitrogengass i 15 min, resuspendert i lav te buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), og oppløst ved inkubasjon ved 50 °C.

for å konstruere plasmid pKO_mazF_mod (som senere skulle fungere som en mal for pKO_pks), primere pKON_Fo og pKON_Ro ble brukt TIL PCR forsterke en 5.0 kb region fra pko_mazf mal15. Dette trinnet var nødvendig for å fjerne en 677 bp-region fra pko_mazf-ryggraden, som vi ikke kunne forsterke VIA PCR. 5.0 kb PCR produktet ble gel renset, fordøyd på 5′ og 3 ‘ ender ved Hjelp Av PshAI, ligert for å danne pKO_mazF_mod, og transformert Til E. coli TOP10. Transformantkloner ble screenet ved renset plasmid test fordøyelse, Og Sanger sekvensering ble brukt til å bekrefte sekvensen av den endelige pKO_mazF_mod klonen. For å konstruere plasmid pKO_pks (for sletting av pks-genet Fra c. acetobutylicum) ble en 3.8 kb-region som inneholdt colE1, repL, bgar og mazF PCR forsterket FRA pKO_mazF_mod ved hjelp av primere Pko_f og pKO_R. I Tillegg ble primere UHR_Fo og UHR_Ro, Og DHR_Fo og DHR_Ro brukt TIL Å PCR forsterke 1 kb-regioner som representerer oppstrøms og nedstrøms homologe regioner (uhr og dhr) flankerer pks-genet (ca_c3355) fra a c. acetobutylicum ATCC 824 genomisk DNA mal. Kloramfenikol / tiamfenikolresistensgen og konstitutiv promoter (P ptb Fra c. acetobutylicum) BLE PCR forsterket fra pKO_mazF_mod ved bruk AV primere CMR_F og CMR_R (1.1 kb region). DISSE FIRE PCR-produktene ble ligert via Gibson-montering og omdannet Til E. coli TOP10. Transformantkloner ble screenet ved renset plasmid test fordøyelse, Og Sanger sekvensering ble brukt til å bekrefte sekvensen av den endelige pKO_pks klonen. For konstruksjon av plasmid pAN315 (nødvendig for metylering av pKO_pks og pko_pks før transformasjon Til C. acetobutylicum), en 6,4 kb region fra plasmid pAN172 ble forsterket ved hjelp av primere pAN1_F og pAN1_R, og en 1,0 kb region som inneholder kanamycin resistens genet fra vektor pCOLA_Duet ble forsterket ved hjelp av primere kan_fo og kan_ro. GELEN ekstrahert PCR produkter ble ligert via Gibson montering og forvandlet Til E. coli TOP10. Transformant kloner ble screenet ved renset plasmid test fordøyelse, Og Sanger sekvensering ble brukt til å bekrefte sekvensen av den endelige pAN3 klon. For konstruksjon av plasmid pCKO_pks (for ekspresjon av pks-genet under den konstitutive crotonase-promotor Fra C. acetobutylicum), primere CPKS_Fo Og CPKS_Ro ble brukt TIL PCR forsterke 5.4 kb c. acetobutylicum ATCC 824 pks genet (CA_C3355) med passende overheng For Gibson montering. Pwis_empty vector71-ryggraden (som inneholder den konstitutive crt-promotoren oppstrøms for multiple kloningsstedet) BLE PCR forsterket ved hjelp av primere pWIS_F og pWIS_R som ga et 5,0 kb produkt. DE to gelrensede PCR-produktene ble ligert via Gibson-montering og omdannet Til E. coli TOP10. Transformant kloner ble screenet ved renset plasmid test fordøyelse, Og Sanger sekvensering ble brukt til å bekrefte sekvensen av den endelige pCKO_pks klone.

for konstruksjon av plasmid pET24b_pks ble 5.4 kb c. acetobutylicum ATCC 824 pks-genet (CA_C3355) forsterket fra c. acetobutylicum genomisk DNA ved hjelp av primere PKS_Fo Og PKS_Ro. Dobbelt fordøyd vektor pET24b (EcoRI/XhoI fordøyd) ble ligert med dobbelt fordøyd PKS PCR produkt( EcoRI / XhoI fordøyd), og ligering produktet ble transformert Til E. coli TOP10. Transformantkloner ble screenet ved renset plasmid test fordøyelse, Og Sanger sekvensering ble brukt til å bekrefte sekvensen av den endelige pET24b_pks klonen.

Elektro-transformasjon Av c. acetobutylicum

før transformasjon Til c. acetobutylicum ble vektor pKO_pks co-transformert med pAN3 til E. coli TOP10 via elektroporasjon. Denne prosedyren tillot metylering av pKO_pks nødvendig for å overvinne det innfødte restriksjonsmodifiseringssystemet som er aktivt I c. acetobutylicum 72. Plasmid rensing Av E. coli pko_pks / pAN3 flytende kultur ble utført, og den resulterende plasmid blandingen ble brukt for elektroporasjoner Av c. acetobutylicum ved hjelp av tidligere publisert metode72 som vi detalj her. For å forberede elektrokompetente celler ble en enkelt koloni Av c. acetobutylicum fra en 2xytg plate (mer enn 1 uke gammel) varmesjokket ved 80 °C i 10 min, og brukes til å inokulere 10 mL CGM. Etter inkubering over natten ved 37 °C og nå midteksponentiell fase (OD600 0,4-0,9–ble 6 mL kultur brukt til å inokulere 54 mL fersk 2xytg. Denne subkulturen ble inkubert ved 37 °C til DEN nådde OD600 1.2 (~5 t), hvor subkulturen ble sentrifugert ved 3500×g for 20 min(4 °C). Etter fjerning av supernatanten ble cellepellet resuspendert i 20 mL iskald elektroporasjonsbuffer (EPB; 270 mM sukrose, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4). De resuspenderte cellene ble sentrifugert ved 3500×g i 10 min (4 °C), supernatanten ble kassert, og cellepellet ble resuspendert i 20 mL iskald EPB. Etter en endelig pelletering ved sentrifugering ved 3500×g i 10 min (4 °C) ble supernatanten kassert, og pelleten ble resuspendert i 2,3 mL iskald EPB. Denne siste resuspensjonen ble brukt som lager av elektrokompetente celler. Elektrotransformasjoner ble utført ved første blanding (over is) 500 µ kompetente celler og ~20 µ av plasmid DNA-oppløsning (1-5 µ totalt) som skulle transformeres. Blandingen ble overført til en 0,4 cm elektroporasjonskvette, og fikk lov til å inkubere på is i 15 min. Elektroporasjoner ble utført med følgende parametere: spenning, 2000 V; kapasitans, 25 µ; motstand, uendelig Ω. Etter elektroporering ble prøvene resuspendert i 1 mL 2xYTG og overført til et rør inneholdende 9 mL 2xytg. Etter blanding ved inversjon fikk kulturene gjenvunnet ved 37 °C i 4 timer. gjenvinningskulturene ble sentrifugert ved 3500 hryvnias g i 15 minutter( romtemperatur), og supernatanten ble kassert. Cellepellet ble resuspendert i 500 µ 2xYTG, og 100 µ ble belagt på faste 2xytg-plater supplert med egnet antibiotikum. Platen ble inkubert ved 37 °C i 2-3 dager, og transformerende kolonier ble utsatt FOR PCR – basert verifisering.

Sletting av pks-gen og genetisk komplementering

Målrettet KO av pks-genet (ca_c3355) I C. acetobutylicum ATCC 824 ble oppnådd ved hjelp av den tidligere publiserte metoden15. I detalj ble 5 µ metylert pko_pks/pAN3 plasmid-blanding omdannet Til c. acetobutylicum ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor. Etter gjenvinning i flytende 2xytg medium i 4 timer ble cellepellets oppsamlet ved sentrifugering (3500×g, 15 min, romtemperatur), resuspendert i 0,5 mL fersk væske 2xYTG, og 100 µ av den resuspenderte cellekulturen ble belagt på faste 2xytg + 5 µ/mL th + 40 mM β-laktoseplater. Under disse plating forhold, bare celler som har gjennomgått den ønskede dobbel crossover homolog rekombinasjon hendelsen forventes å overleve. Counterselection av vektor ryggraden er gitt av laktose-inducible promoter (P bgaL), som driver toksin genet mazF på pko_pks vektor ryggraden. Etter denne platingsprosedyren ble det observert omtrent 10 kolonier på 2xytg + 5 µ/mL th + 40 mM β-laktoseplater. Av disse 10 kolonier, fire ble to ganger restreaked og utsatt for koloni PCR verifisering. Fire sett med primere ble brukt som grunnlag for koloni PCR verifisering, som beskrevet I Supplerende Fig. 2.

for generering av pks genetiske komplementeringsstamme ble elektroporering av ∆pks C. acetobutylicum med en pCKO_pks/pAN3 plasmid blanding utført som beskrevet ovenfor. Etter elektroporering og gjenvinning ble kulturer belagt på solid 2xytg + 5 µ/mL Th + 40 µ/mL Ery media. Etter to ganger restreaking på solid 2xytg + 5 µ / mL th + 40 µ / mL ery media, ble potensielle kolonier som hadde pCKO_pks screenet via colony PCR ved hjelp av primere pCKO_F og pCKO_R.

lc-HRMS metabolomisk analyse

for ikke-målrettede metabolomiske sammenligninger av villtype Og ∆pks C. acetobutylicum var enkeltkolonier av hver stamme varmesjokket ved 80 °C i 10 min og ble brukt til å inokulere 10 mL flytende CGM (30 g/l glukose). Etter inkubasjon over natten (stillestående) til DE nådde OD600 ~1.0, ble disse kulturer brukt til å inokulere 10 mL flytende cgm (80 g/L glukose) med et 10% inokulum for subkultur. Etter ~5 h (OD600 ~1.0) av stillestående vekst ble subkulturene brukt til å inokulere firedoble flaskefermentasjoner (70 mL CGM, 80 g/L glukose + 5 µ Antifoam 204, 3% inokulum) omrørt via magnetiske rørestenger. Kalsiumkarbonat (6 g / L) ble supplert til fermenteringsmediet for pH-buffering. All kultivering ble utført ved 37 hryvnias C. Ca. 5 µ / mL Ble inkludert i alle kulturer av hryvnias pks med unntak av den endelige fermenteringskulturen, da visse antibiotika er kjent for å forstyrre ABE-fermenteringsfasene. Prøver av gjæringsbuljong (1 mL) fra hver replikat ble tatt under tidlig stasjonær fase og ekstrahert med 3 mL 2: 1 kloroformmetanol. Blandingene ble virvlet, separert via sentrifugering (2700×g, 10 min), og det nederste kloroformrike laget ble overført til et hetteglass. Disse organiske ekstraktene ble tørket med nitrogengass, resuspendert i 100 µ metanol, og 10 µ ble injisert på Et Agilent Technologies 6520 QTOF LC-MS-instrument med Nøyaktig Masse utstyrt Med En Agilent Eclipse Plus c18-kolonne (4,6 × 100 mm). En lineær gradient på 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min i H2O med 0,1% maursyre (vol/ vol) ved en strømningshastighet på 0,5 mL/min ble brukt. Den metabolomiske analyseplattformen XCMS16 (Scripps Research Institute) ble brukt til å sammenligne metabolomer av villtype og ∆pks-stammer basert på firedoble LC-HRMS-data. MS-topper som er unike for ∆pks (Fig. 1a) ble identifisert ved hjelp av følgende parametere: p-verdi < 0,01, brettendring > 10,0, toppintensitet > 5000.

bioreaktorfermenteringer

For å sammenligne abe-fermenteringsprofiler av villtype Og ∆pks C. acetobutylicum, bioreaktor fermenteringer ble utført I DASGIP Bioreaktorer (4 × GPI 100 Fartøy, DASGIP Bioblock System) med 500 mL arbeidsvolumer. Overnattingskulturer (10 mL CGM, 30 g/L glukose, stillestående, 34 °C) inokulert med varmesjokkede individuelle kolonier Av c. acetobutylicum ble dyrket til DE nådde OD600 ~1. Et 10% inokulum ble deretter brukt til å starte en subkultur (30 mL p2 media, 80 g / L glukose, stillestående, 34 °C), og subkulturen ble inkubert til den nådde OD600 ~1. De 30 mL subkulturene ble så aseptisk overført til individuelle DASGIP-Bioreaktorer forhåndsbelastet med 500 mL P2 medium (80 g / L glukose, 100 µ Antifoam 204, 34 °C). Fermenteringene fikk lov til å fortsette i 54 timer med periodisk prøvetaking for optiske tetthetsmålinger, fermenteringsproduktanalyse og kvantifisering av forbindelser 1, 2 og 3. Temperaturen ble opprettholdt ved 34 hryvnias C gjennom fermenteringen, omrøring ble gitt ved omrøring ved 200 rpm, og pH ble opprettholdt over 5,0 via automatisk tilsetning av 3 M NH4OH. For å opprettholde anaerobe forhold ble oksygenfri nitrogengass sparget med en hastighet på 2 sL / h i løpet av gjæringen. For kvantifisering av forbindelser 1, 2 og 3 ble 1 mL fermenteringsbuljong blandet med 3 mL etylacetat, vortexert, separert via sentrifugering (2700×g, 10 min, romtemperatur) og det øvre organiske laget isolert. Det organiske laget ble tørket ved roterende fordampning, resuspendert i 200 µ metanol, og 20 µ ble injisert på Et Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (med DAD) instrument utstyrt med En Agilent Eclipse Plus c18 kolonne (4,6 × 100 mm). En lineær gradient på 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min i H2O med 0,1% maursyre (vol/ vol) ved en strømningshastighet på 0,5 mL/min ble brukt. Forbindelser 1, 2 og 3 ble identifisert VED UV-absorpsjon (240 nm) som vist I Fig. 1b, og ble kvantifisert av det integrerte toppområdet (absorbans ved 240 nm).

Fermenteringsanalytiske prosedyrer

et spektrofotometer ble brukt til å bestemme celletettheter ved å måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD600). Et Shimadzu Prominence UFLC-system utstyrt Med En Biorad Aminex HPX – 87h kolonne (300 mm × 7.8 mm) ble brukt til å analysere C. acetobutylicum fermenteringsbuljong for konsentrasjon av glukose og gjæringsprodukter (acetat, butyrat, laktat, aceton, butanol og etanol). Prøver av gjæringsbuljong (1 mL) ble først pelletert ved sentrifugering ved 10 000×g i 3 min, etterfulgt av filtrering av supernatanten ved bruk av ET 0,22 mikron PVDF sprøytefilter. Prøver av filtrert supernatant (20 µ) ble injisert på UFLC-systemet med 0,01 N svovelsyre mobilfase som strømmer ved 0,7 mL / min, kolonnetemperatur på 35 °C og ble kromatografert i 35 min. Analytter ble detektert ved bruk av en brytningsindeksdetektor (brukt til å kvantifisere konsentrasjoner av glukose, acetat, laktat, butanol og etanol) og en diode array detektor (brukt til å kvantifisere konsentrasjoner av butyrat (208 nm) og aceton (265 nm)).

rna-isolering og rna-Seq-analyse

Prøver (10 mL) fermenteringsbuljong ble tatt i biologisk triplikat fra bioreaktorfermentasjoner av villtype Og ∆pks C. acetobutylicum 26 timer etter inokulering. Prøvene ble sentrifugert (4000×g, 10 min, 4 °C) og pelletsene ble resuspendert og lagret I Rnaprotect Cell Reagent (Qiagen). Totalt RNA ble ekstrahert ved hjelp Av Et Rneasy Mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. En on-kolonne DNase behandling ble utført Ved Bruk Av DNase i (RNase-fri) (NEB). RNA kvalitetskontroll, bibliotek konstruksjon, og bibliotek sekvensering ble utført Av University Of California-Berkeley QB3 Funksjonell Genomics Laboratory Og Vincent J. Coates Genomisk Sekvensering Laboratorium. RNA kvalitet og konsentrasjon ble vurdert ved hjelp av en nanochip På En Agilent 2100 Bioanalyzer. Bakteriell 16s og 23s rRNA ble fjernet ved Hjelp Av Et RiboZero-Sett (Illumina). Den resulterende messenger RNA (mRNA) ble konvertert til ET RNA-Seq bibliotek ved hjelp av en mRNA-Seq bibliotek konstruksjon kit (Illumina). Rna bibliotek sekvensering ble utført På En Illumina HiSeq4000 med 50 bp enkelt end leser. Sekvensering leser (50 bp) ble behandlet og kartlagt Til c. acetobutylicum ATCC 824 genom (NCBI tiltredelse NC_003030. 1 OG NC_001988. 2 ) VED HJELP AV CLC Genomics Workbench 9.0 med standardparametere. Leser som ikke unikt tilpasset genomet ble kassert. Forskjeller i genuttrykk mellom villtype Og ∆pks C. acetobutylicum ble beregnet ved bruk av samme programvare. Gener ble vurdert differensielt uttrykt med p-verdi < 0,003 (basert på en uparet t-test, n = 3) og |normalisert foldeendring / > 2,0. Falske funnratekorrigeringer til p-verdier ble beregnet I CLC Genomics Workbench 9.0 ved hjelp av en publisert metode73. Resultatene av rna-Seq-analysen er presentert i Tilleggsdata 1. STRENG analyse30 ble utført for å bestemme antatte protein-protein interaksjoner mellom differensielt uttrykte gener avslørt AV RNA-Seq analyse.

Fenotype sammenligningsanalyser

Flytende sporulasjonsanalyser ble utført med mindre modifikasjoner74. Prøver ble tatt fra biologiske triplikatvæskekulturer etter 5 dagers inkubasjon (30 mL CBM-S, 37 °C). De 20 µ prøvene var varmesjokkede (80 °C, 10 min), fortynninger (101-106) ble oppdaget på 2xytg-plater, og kolonier ble oppregnet etter 30 t inkubasjon (37 °C) for å beregne antall varmebestandige kolonidannende enheter (cfu/mL). For kjemisk komplementering av hryvnias pks i væskesporuleringsanalysen ble renset clostridienose (endelig konsentrasjon 3,5 µ) supplert i CBM-s kulturer av hryvnias pks C. acetobutylicum ved inokuleringstidspunktet. Siden forbindelse 3 ble tilsatt som en konsentrert oppløsning i metanol, ble tilsvarende volum av metanol (60 µ) tilsatt til alle andre flytende sporulasjonsanalysekulturer (villtype og ikke-komplementerte ∆pks) for å kontrollere denne effekten.

for faste sporulasjonsanalyser ble en tidligere beskrevet metode75 anvendt med noen modifikasjoner. I detalj ble varmesjokkede (80 °C, 10 min) individuelle kolonier dyrket i flytende medier (10 mL CGM, 37 °C) i 24 timer. Kulturer ble fortynnet med en faktor på 106 og belagt på fast CBM. Prøvetaking ble utført 1, 2, 3, 4, og 6 dager etter innledende plating. For prøvetaking ble tre individuelle kolonier kombinert og grundig resuspendert i 60 µ flytende CGM. 20 µ av den resuspenderte koloniblandingen ble deretter varmesjokket (80 °C, 10 min), fortynninger (101-106) ble oppdaget på 2xytg-plater, og kolonier ble nummerert etter 30 t inkubasjon (37 °C) for å beregne antall varmebestandige kolonidannende enheter (cfu/koloni). Alle prøvene ble utført som biologiske triplikater.

Granuloseakkumuleringsanalyser ble utført via jodfarging53. Mid-log fase (OD600 ~0.6) flytende kulturer (P2, 37 °C) ble belagt på fast 2xytg medium med forhøyede glukosenivåer (50 g/L) for å muliggjøre granuloseproduksjon. Platene ble inkubert ved 30 °C i 4 dager, og da ble de farget ved eksponering for en seng av jodkrystaller i 10 minutter. Platene ble deretter tillatt å destain for 10 min før avbildning. For kjemisk komplementering av ∆pks i granuloseakkumuleringsanalysen ble renset clostridienose (endelig platekonsentrasjon 4,0 µ) innebygd i faste 2xytg-plater før plating av ∆pks-kultur. Siden clostrienose ble tilsatt til 2xytg-plater som en konsentrert oppløsning i metanol (blandet inn i smeltet medium før størkning), ble tilsvarende volum av metanol (6 µ) tilsatt til alle andre 2xytg-plater brukt i granuloseakkumuleringsanalysene for å kontrollere denne effekten.

Individuelle kolonier Av c. acetobutylicum dyrket PÅ CBM plater for 48 h (37 °C) ble sett og avbildet ved hjelp Av En Leica MZ16 F dissekere mikroskop utstyrt Med En Leica DFC300 fx kamera.

oljespredningsanalyser ble utført som tidligere beskrevet76, 77, 78. I detalj ble Et 400 mL glassbeger (7,5 cm indre diameter) fylt med 300 mL vann, og en 10 µ dråpe parafinlampeolje ble tilsatt og tillatt å spre seg i en tynn film på vannoverflaten over en 5 min periode (~25 mm i diameter). Løsninger av surfaktin, renset clostrienose og en kaliumfosfatbufferkontroll ble fremstilt ved den angitte pH og konsentrasjon (fremstilt i 10 mM kaliumfosfatbuffer). Omtrent 10 µ av prøven ble nøye tilsatt til midten av oljefilmen, og effekten på oljefilmen ble observert. Prøver med overflateaktivt aktivitet forventes å danne stabile sirkulære clearing soner i oljefilmen, med mer potent overflateaktivt aktivitet som tilsvarer større clearing soner(eller fullstendig dispersjon av oljefilmen for svært høy overflateaktivt aktivitet). Drop collapse analysene ble utført77, 79, 80. Sirkulære mikrobrønner (8 mm indre diameter) i polystyrenlokket på en 96-mikrobrønnplate (12,7 × 8,5 cm) ble belagt med et tynt lag parafinlampeolje ved å tilsette 2,0 µ parafinlampeolje til hver brønn, og la dråpen spre seg jevnt over mikrobrønnen over en periode på 1 time. Prøver av surfaktin, renset clostrienose og kaliumfosfatkontroll ble fremstilt som for oljespredningsanalysene. Om 5 µ av prøven ble nøye lagt til midten av microwell. Etter 5 min ble formen og graden av spredning av dråpen observert. Mens bufferkontroller forventes å danne stabile perler på microwell-overflaten, forventes prøver som inneholder overflateaktivt middel å kollapse og spre seg over microwell-overflaten, med mer potent overflateaktivt aktivitet som tilsvarer en høyere grad av dråpespredning.

Rensing og in vitro analyse AV pks protein

for å rense His6-merket PKS protein for in vitro analyse, pET24b_pks ble transformert Til E. coli BAP1. En enkelt koloni ble inokulert i 10 mL LB + 50 hryvnias / mL kanamycin (Kan) for vekst over natten ved 37 °C. omtrent 7 mL kultur over natten ble brukt til å inokulere 700 mL LB + 50 µ/mL Kan, og kulturen ble rystet ved 240 o / min og 37 °C til DEN nådde OD600 på 0,5. Etter ising av kulturen i 10 minutter ble isopropyl thio-β-d-galaktosid (iptg) tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0.1 mM for å indusere proteinuttrykk, og kulturen ble inkubert ved 16 °C i 16 timer. cellene ble høstet ved sentrifugering (5500×g, 4 °C, 20 min), resuspendert i 25 mL lysisbuffer (25 mM HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol) og lysert ved homogenisering over is. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering (17 700×g, 4 °C, 60 min), Og Ni-NTA agaroseharpiks ble tilsatt supernatanten (2 mL/L kultur). Blandingen ble nutert ved 4 °C i 1 time, lastet på en tyngdekraftstrømskolonne, og pks-proteinet ble eluert med økende konsentrasjoner av imidazol I Buffer A (20 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Renset pks-protein ble konsentrert og buffer utvekslet til Buffer a + 10% glyserol ved bruk Av En Vivaspin-Sentrifugalkoncentrator. Alikvoter av renset pks protein ble alikvotert og flash frosset i flytende nitrogen. Det omtrentlige proteinutbyttet var 5 mg / L (203 kDa).

EN pks-belastningsanalyse med 14c-merket substrat inneholdt, i et totalvolum på 15 µ, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM CoA, 2-14c-malonsyre (0,1 µ), 10 µ MatB, 17 µ PK og 50 mM HEPES, pH 8,0. Etter 2 timers inkubasjon ved 25 °C ble prøvene slukket ved å tilsette et tilsvarende volum PÅ 1× sds-prøvebuffer. Etter SDS–SIDEANALYSE med En 4-15% tgx-gel (Kriterium) ble gelen tørket i 2 timer ved 50 °C og eksponert på en lagringsfosforskjerm (20 × 25 cm; Molekylær Dynamikk) i 5 dager. Radiomerket protein ble avbildet på En Typhoon 9400 fosforimager(Lagringsmodus, 50 µ oppløsning; Amersham Biosciences).

for in vitro-produktanalyser (50 µ) av pks-proteinet ble 8 µ AV pks inkubert med malonyl-CoA (2 mM) i fosfatbuffer (100 mM, pH 7,0) ved romtemperatur i 2 timer for å generere forbindelse 4, identifisert ved sammenligning med en kjemisk standard. NADPH (2 mM) ble tilsatt til analysen for å generere forbindelser 5 og 6, som begge ble identifisert i forhold til kjemiske standarder. Etter inkubasjon ble analyseblandingene ekstrahert to ganger med 100 µ av 99% etylacetat/1% eddiksyre (v / v). De organiske ekstraktene ble tørket og resuspendert i 100 µ metanol, og 10 µ ble injisert på Et Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (med DAD) instrument utstyrt med En Agilent Eclipse Plus c18-kolonne (4,6 × 100 mm). En lineær gradient på 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min i H2O med 0,1% maursyre (vol/ vol) ved en strømningshastighet på 0,5 mL/min ble brukt. Lc-HRMS analyse av assay ekstrakter ble utført På En Agilent Technologies 6520 Nøyaktig Masse QTOF LC-MS instrument utstyrt Med En Agilent Eclipse Plus C18 kolonne (4.6 × 100 mm) med samme gradient og strømningshastighet som beskrevet ovenfor.

Datatilgjengelighet

rna-seq-data generert i denne studien er deponert I ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) under tiltredelsesnummer E-MTAB-6019. Alle andre relevante data er tilgjengelige fra forfatterne på forespørsel.