ClpP protease aktivering resultater fra omorganisering av elektrostatiske interaksjonsnettverk ved inngangen porene

Binding modus AV ACP1 Til EcClpP

å belyse strukturelle grunnlaget For clpp aktivering AV ACP128, strukturer Av NmClpP Og EcClpP (Fig. 1a) i kompleks MED ACP1-analoger ble søkt. Mens En Struktur Av NmClpP med bundet ACP1 ikke ble oppnådd til tross for gjentatte forsøk, ble en struktur av EcClpP+ACP1-06-komplekset bestemt til 1,9 Å oppløsning(Fig. 1b, C, Tabell 1), som inneholder en tetradekamer i den asymmetriske enheten (Kjeder A-N). Elektrontetthet For N-terminale rester som danner Ecclpps aksiale løkker er uklart i alle, men en underenhet (Kjede B). I tidligere publiserte strukturer er disse aksiale løkkene svært fleksible og er vanligvis uordnet i krystallet i fravær av aktivatorer eller gjennom utelukkelse av krystallpakning23. Entydig elektrontetthet ble observert for et ENKELT acp1-06 molekyl i en lomme dannet Av underenheter D og E, som viser to forskjellige konfigurasjoner av forbindelsen (Fig. 2a, b). Begge konfigurasjonene ble modellert i elektrondensiteten, hvor den første konfigurasjonen posisjonerer trifluormetylpyridin-delen av forbindelsen i en hydrofob lomme (nedkonfigurasjon), mens den andre posisjonerer den ut av den hydrofobe lommen utsatt for løsningsmiddel (oppkonfigurasjon) (Fig. 2a). De resterende 13 hydrofobe lommene viser tvetydig elektrontetthet FOR ACP1-06. Vi modellert og raffinert alle 14 ACP1-06 molekyler i både opp og ned konfigurasjoner på belegg på 0,5, noe som resulterer i forbedret elektrontetthet for hver ligand.

bindingsmodusene TIL ACP1-06 (Fig. 2b-d) omtrentlig De Av ADEPs observert i krystallstrukturer av forskjellige bakterielle ClpPs (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Merk at forbindelser syntetisert av vår gruppe er nummerert SOM ACP1-YY og ADEP-YY, mens forbindelser fra studier av andre grupper er navngitt som i de respektive publiserte papirene. Alle proteinkontakter MED ACP1-06 er ikke-polare i naturen, bortsett fra to bemerkelsesverdige elektrostatiske bindinger som oppstår mellom (1) den fenoliske hydroksylsidekjeden Av Y76 og amidoksygenet AV ACP1-06, og (2) guanidinylsidekjeden Av R206 (den nest siste Arg I EcClpP) og et sulfonyloksygen AV ACP1-06 (Fig. 2b). De to sistnevnte interaksjonene er tilstede i BEGGE konfigurasjonene AV ACP1-06. I tillegg stabiliseres R206 (Kjede E) ved ionisk binding Med E65 av en tilstøtende underenhet (Kjede D) (Fig. 3a, b).

I ned-konfigurasjonen opptar trifluormetylpyridindelen AV ACP1-06 et hydrofobt hulrom dannet Av L62, T93 og F96 (Kjede D) Og Y74, Y76, I104, L203 og L128 (Kjede E) (Fig. 2b og 3b). Dette er det samme hulrom okkupert av ringen av den eksocykliske Phe-resten av DE FORSKJELLIGE adep-analogene som er kokrystallisert Med ClpP, som i Vår NmClpP+ADEP-0419 (Fig . 2e, f) Eller EcClpP + ADEP1 strukturer40 (Fig. 2c, d). I motsetning til dette roteres trifluormetylpyridindelen rundt C – s-bindingen og er løsningsmiddel eksponert mens van Der Waals kontakter Med Y74, i104, F126 og L203 (Kjede E) (Fig. 2b og 3b). Gemdimetyldelen stabler mot den flate ringen Av Y74 (Kjede E), mens den utvidede alifatiske kjeden avslutter med en orto-klor-substituert fenylring, sitter i et ikke-polart spor mellom to helikser fra tilstøtende underenheter (Fig . 3b). Denne bindende spalten dannes Av L62 (Kjede D), F63 (Kjede D), A66 (Kjede D), L37 (Kjede E), V42 (Kjede E) og den ikke-polare delen Av E40 (Kjede E) (Fig. 2b og 3b).

I BÅDE ACP1-06 – og ADEP1-bundne strukturer Av EcClpP er den intrasubunit saltbroen mellom R36 Og E40 funnet, hvor den nærliggende alifatiske halen AV ADEP1 eller den klor-substituerte fenylringen AV ACP1-06 danner en hydrofob interaksjon Med sidekjeden Av E40 (Fig . 3b, c). De to aktivatorene stabiliseres ytterligere i det hydrofobe stedet ved to forskjellige hydrogenbindingsmønstre. MENS ACP1-06 er sikret gjennom en løsemiddeleksponert ionisk interaksjon mellom sulfonylgruppen og den C-terminale r206-resten (Fig. 3B), ADEP1 holdes på plass av to hydrogenbindinger med hydroksylgruppen Y76 bortgjemt i det hydrofobe stedet (Fig. 3c). En løsemiddelmediert hydrogenbinding Mellom E65 og karbonylgruppen Av n-acyl Phe sidekjeden AV ADEP1 styrker ytterligere samspillet Med EcClpP (Fig . 3c). Denne ekstra hydrogenbindingen, så vel som den større størrelsen på den sykliske depsipeptidringen, som har mer overflateareal for å danne van Der Waals-interaksjoner sammenlignet med DEN mindre TRIFLUORMETYLPYRIDINGRUPPEN AV ACP1, kan utgjøre den generelt strammere bindingen observert For ADEPs enn ACP1s28.

I EcClpP+ACP1-06-strukturen fant vi en uforklarlig elektrontetthet i alle 14 underenheter som strekker seg fra den nukleofile resten S111 Av den katalytiske triaden, noe som tyder på en kovalent modifikasjon (Supplerende Fig. 1a, b). Tettheten strekker seg omtrent rett vinkel i motsatt retning bort Fra sidekjedene S111. Til tross for omfattende innsats kunne det ikke overbevisende være utstyrt med peptider, acylketonprodukter eller forskjellige kjente serinproteasehemmermolekyler.

Bindingsmodus AV ADEP Til NmClpP

NmClpP har en kortere pro-sekvens Ved n-terminus, mens den har fire ekstra rester Ved C-terminus sammenlignet Med EcClpP (Fig . 1a). Selv Om NmClpP ble uttrykt som en full-lengde protein bærer En N-terminal His6-tag, vi gjentatte ganger observert mangel på binding Til Ni-nitrilotrieddiksyre harpiks. N-terminal sekvensering av det rensede proteinet viste at den modne NmClpP starter ved rest Y6 (Fig. 1a), som indikerer autoproteolyse for å frigjøre Sin N-terminale pro-sekvens (1MSFDN5).

tidligere hadde vi bestemt Strukturen Til NmClpP MED ADEP-0419. I denne studien bestemte vi strukturen til apo-NmClpP til 2,0 Å og NmClpP med bundet ADEP-14 til 2,7 Å(Fig . 1b, c, Supplerende Fig. 1c, Tabell 1). Strukturen til apo-NmClpP inneholder en tetradekamer i den asymmetriske enheten og viser ingen klar tetthet for noen av de 14 N-terminale aksiale løkkene. Svak elektrontetthet er observert For løkkene dannet Av rester G133-G137 i tråd β 8 i håndtaket (Fig . 1a). Den asymmetriske enheten For NmClpP + ADEP – 14 krystall inneholder to tetradekameraer (Supplerende Fig. 1d). Ingen elektrontetthet ble observert for rester 1-22 av alle 28 underenheter på grunn av krystallpakning (Fig. 1c, Supplerende Fig. 1d). I tillegg er den β 8-strengen (rester 130-137; Fig. 1a) er bare delvis synlig i alle underenheter. ADEP-14 er bundet Til NmClpP i en lignende konfigurasjon SOM ADEP-04 (Figs. 2e, f og 3e, f). Kort sagt har difluorfenyldelen AV ADEP-14 en hydrofob lomme dannet Av Y67, L95, L97 og L119 av en underenhet, Og V49, L53, T84 og F87 av en tilstøtende underenhet (Fig. 3e). Den seksledede ringen i rørkolsyredelen er løsningsmiddel eksponert og stabiliseres av fenylringen I F117 og de hydrofobe sidekjedene I L97, L119 Og L196 (Fig. 3e). Den ekstra metylsubstitusjonen på allo-treoninresten av depsipeptidringen (Fig. 1b) er løsemiddel eksponert. SOM ADEP-04 er ADEP-14 sikret i den svært komplementære hydrofobe lommen ved to hydrogenbindingsinteraksjoner Mellom den fenoliske hydroksylgruppen Y67, aminogruppen av difluorfenylalaninresten og alaninkarbonylgruppen i depsipeptidringen og en løsningsmiddelmediert hydrogenbinding Med E56(Fig . 3e, f). Den oktadienoiske syre sidekjeden AV ADEP-14 ligger i den smale hydrofobe kanalen dannet Av L53, F54 og S57 av en underenhet, Og R27, L28, E31, I33, F35 Og Y67 av den nærliggende underenheten (Fig . 3e).

ACP1 – og ADEP-binding resulterer i distinkte allosteriske effekter på ClpP fat

ved hjelp av strukturer av apo – og sammensatte-bundet former Av EcClpP Og NmClpP (Fig . 1c), undersøkte vi allosteriske effekter som oppstår ved aktivatorbinding. Som vist I Supplerende Fig. 2, aktivatorbinding virker som en kil som forårsaker lateral forskyvning av to tilstøtende underenheter. Omfanget av global konformasjonsendring forårsaket AV acp1-06-binding (rmsd = 0,84 Å i forhold til apo-EcClpP) er lik DEN FOR ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å i forhold til apo-NmClpP), men mindre enn DET FOR ADEP-14 (rmsd = 2.47 Å i forhold til apo-NmClpP). Interessant er forskyvningsretningen forskjellig mellom de to klassene av aktivatorer(Supplerende Fig. 2 Og Supplerende Filmer 1-4). MELLOM De To ADEPs forårsaker ADEP-14 en større samlet strukturell forstyrrelse Til NmClpP-sylinderen(sammenlign Tilleggsfilmer 3 vs 4). ADEP-binding resulterer i en utvidelse av den apikale overflaten Av NmClpP ledsaget av innsnevring ved ekvatorialområdet. Pivoten for denne bevegelsen er i håndtaket som består av helix aE og strand β 8. Dette fenomenet er observert i alle ADEP-bundet ClpP-strukturer kjent til dags dato, med varierende grad av komprimering Av ClpP-sylinderen15,18,19,23,40. I KONTRAST forårsaker acp1-06 binding Til EcClpP en innadgående bevegelse av alle underenheter som resulterer i stramming Av clpp-sylinderen (Supplerende Film 1). Dermed viser strukturene At ACP1s og ADEPs aktiverer ClpP ved å indusere forskjellige allosteriske effekter.

i aktivator-bundet EcClpP og NmClpP strukturer, ring-ring grensesnitt elektrostatiske bindinger som stabiliserer tetradecamer forbli bevart til tross for konformasjons endringer (Supplerende Fig. 3). Videre, til tross for den globale strukturelle endringen ved aktivatorbinding, Opprettholder Ser-His-Asp katalytiske triader Av EcClpP og NmClpP katalytisk kompetente geometrier, da bare mindre Ca-ryggradsskift forekommer nær det aktive stedet (Supplerende Fig. 1a-c). Analyse av alle EKSISTERENDE ACP1-og ADEP-bundne strukturer Av ClpP viser at sammensatt binding også resulterer i sammentrekning av ekvatorialområdet (Supplerende Fig. 4).

vi kvantifiserte komprimeringen Av clpp-sylinderen ved acp1-eller ADEP-binding ved å måle volumene til de respektive katalytiske kamrene (Supplerende Fig. 4). Acp1-06-binding forårsaker en ~5% reduksjon i katalytisk kammervolum i forhold til apo-EcClpP. ADEP1-binding til EcClpP resulterer i en tilsvarende reduksjon i katalytisk kammervolum. Dette observeres også for andre aktivatorbundne ClpP-strukturer som ADEP-14-bundet NmClpP, ADEP-bundet BsClpP og DET ADEP-bundet MtClpP1P2 heteroligomere komplekset (Supplerende Fig. 4).

clpp-aktivering resulterer i omorganisering av det elektrostatiske bindingsnettet ved de aksiale porene

i strukturen av apo-NmClpP stabiliserer to elektrostatiske bindinger nær den aksiale pore grensesnittet til to tilstøtende underenheter (Fig. 3d, Supplerende Fig. 5). For det første danner den negativt ladede e58-karboksylatgruppen av en underenhet et ionpar med den positivt ladede r27 guanidiniumgruppen av den tilstøtende underenheten. For Det andre danner S57-hydroksyl-og e31-karboksylatgruppene av to tilstøtende underenheter en hydrogenbinding. VED ADEP-binding brytes disse to ikke-kovalente bindingene, mens den ioniske bindingen mellom R27 Og E31 av samme underenhet forkortes, dvs. styrkes (Fig. 3e, f). I apo-EcClpP knytter bare En ionisk binding Mellom E67 Og R36 to tilstøtende underenheter, siden den ekvivalente rest Til S57 Av NmClpP er en Alanin i EcClpP og dermed ikke kan danne en hydrogenbinding Med E40(Fig. 3a). Som I NmClpP eliminerer binding AV ACP1 ELLER ADEP1 Til EcClpP intersubunit E67-R36 ionisk binding og gir opphav til en sterkere intrasubunit ionisk binding Mellom R36 og E40(Fig. 3b, c, Supplerende Fig. 5).

for ytterligere å verifisere disse observasjonene, designet Vi NmClpP og EcClpP punkt mutanter som fører til tap av de ovennevnte intersubunit elektrostatiske bindinger. Som vist I Fig. 4a, MENS WT NmClpP ikke var i stand til å nedbryte proteinkasein, Ble NmClpP e58a-mutanten funnet å nedbryte kasein med en høyere hastighet enn e31a-mutanten. Det er viktig at den doble mutanten E31A + E58A hadde en enda høyere aktivitet enn de enkelte mutantene. Graden Av aktivering av dobbeltmutant NmClpP er lik den som er observert ved tilstedeværelse av 1 µ ADEPs eller 10 µ ACP1s(Fig . 4a). Lignende oppførsel ble observert For EcClpP med lignende mutasjoner (E40A OG E67A; Fig. 4b). Den respektive EcClpP double mutant er ikke løselig og kunne ikke testes.

Deretter bestemte Vi røntgenstrukturer Av NmClpP E58A og NmClpP E31A + E58A mutanter (Tabell 1). De katalytiske stedene i begge mutantene er ikke forstyrret (Supplerende Fig. 1e). I NmClpP e58a single mutant, mutasjonen opphever intersubunit E58-R27 ionisk binding og gir opphav til en sterkere intrasubunit R27-E31 interaksjon, mens hydrogenbindingen Mellom s57 Og E31 forblir (Fig. 4c). En lignende «kileeffekt» observeres således i strukturen, som vist ved den subtile globale konformasjonsendringen I NmClpP-mutantens Ca-ryggrad (rmsd = 0,33 Å i forhold TIL WT NmClpP) (Supplerende Film 5). Mutasjon av Både E31 og E58 til alanin for å generere den doble mutanten NmClpP E31A + E58A (rmsd = 0,29 Å i forhold TIL WT NmClpP) opphever de to stabiliserende intersubunit elektrostatiske interaksjonene, samt den intrasubunit R27-E31 ioniske bindingen som er tilstede i NmClpP E58A enkeltmutanten (Fig . 4d Og Supplerende Film 6) og I ADEP-bundet NmClpP (Fig. 3e, f). Dermed Er NmClpP e31a + E58A dobbeltmutant i motsetning TIL ADEP-bundet NmClpP med den eliminerte intrasubunit ioniske bindingen, men er likevel et aktivert protein med egen proteolytisk aktivitet som er sammenlignbar med den for Småmolekylaktiverte ClpP(Fig . 4a). Som ADEP-bundet NmClpP har Både NmClpP enkelt-og dobbeltmutanter redusert katalytisk kammervolum på Grunn Av clpp-tønnekomprimering (Supplerende Fig. 4).

en slik omorganisering av bindingsnettet observeres for alle aktiverte ClpP-strukturer som er tilgjengelige I PDB, enten i nærvær av småmolekylære aktivatorer eller på grunn av spesifikke mutasjoner (Supplerende Fig. 6). For eksempel, små-molekyl aktivator binding Til b. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), m. tuberculosis ClpP (MtClpP), Og Homo sapiens clpp (HsClpP) opphever en eller To intersubunit elektrostatiske bindinger nær den aksiale pore, og gir opphav til en sterkere, intrasubunit ionisk interaksjon (Supplerende Fig. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. I MtClpP2 eksisterer ikke intersubunit ionisk binding som tilsvarer e58-R27-interaksjonen I Nmclpp18. Tilsvarende rest For E58 Av NmClpP Er L66 I MtClpP2 og er ikke i stand til å delta i en ionisk interaksjon Med K35 Av MtClpP2 (tilsvarende R27 Av NmClpP). I stedet stabiliserer en intersubunit hydrogenbinding Mellom s65 Og E39 grensesnittet (Supplerende Fig. 6g, h). ADEP-binding til MtClpP2 bryter S65 – e39 hydrogenbinding og styrker intrasubunit ionisk binding Mellom K35 Og E3918.

Interessant, selv den aktiverte SaClpP Y63A variant41, med den aktiverende mutasjonen funnet i midten av det hydrofobe stedet, og derfor ikke ekvivalent med de aktiverende mutasjonene Av NmClpP presentert her, støtter vår foreslåtte modell for omorganisering av hydrogenbindingsnettverket rundt den aksiale pore ved clpp-aktivering(Supplerende Fig. 6f). I Strukturen Til SaClpP Y63A-mutanten økes avstanden mellom intersubunitionparet (Q54–R23), mens intrasubunit saltbroen (R23–D27) styrkes (Supplerende Fig. 6d, f). VI genererte også den tilsvarende y63a-mutasjonen i Både EcClpP og NmClpP. NmClpP Y67A-mutanten var uoppløselig, Mens EcClpP Y76A hadde en aktivitet litt høyere ENN e40a-mutanten, men lavere enn E67A-mutanten (Fig. 4b).

clpp-aktivering resulterer i reduksjon i strukturell heterogenitet av De n-terminale aksiale sløyfer

som diskutert ovenfor, i den bestilte aksiale sløyfen Til NmClpP+ADEP-04-komplekset som danner hårnålssvinget for hårnål, frigjør ADEP-binding R27 Fra en intersubunit ionisk binding Med E58 og styrker intrasubunit ionisk binding Med e31 av helix aA(Fig . 5a). Følgelig danner R27 en ionisk binding Med D23 av tråd β 1 av aksialsløyfen. Denne stabiliserende interaksjonen observeres i Alle aktivatorbundne strukturer Av ClpP hvor de aksiale sløyfer er bestilt (Fig. 5a-e).

For EcClpP + ACP1-06-strukturen er de aksiale løkkene (rester 14-31) delvis bestilt i krystallet, med bare 1 av 14 aksiale løkker som danner den β 1-β 2 hårnålssvingen (Fig. 1c-komplett bestilling synes å være delvis forhindret av krystallpakningseffekter). I den bestilte aksiale sløyfen til underenhet A tillater frigjøring Av R36 fra intersubunit ionisk binding Med E67 det å danne en sterkere intrasubunit ionisk binding Med e40 av helix aA(Fig . 5f). Det er imidlertid ingen stabiliserende ionisk interaksjon Mellom e22 av strand β 1 og r36 av helix aA, sannsynligvis på grunn av delvis bestilling (Fig. 5f). En ekstra hydrogenbinding Mellom d32 av strand β 2 og S21 av helix aA forankrer aksialsløyfen til EcClpP-kjernedomenet (Fig. 5f). På samme måte er de aksiale løkkene I Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4-strukturen bare delvis bestilt21. Den konserverte hydrogenbindingen mellom arg-rest av helix aA og en negativt ladet rest av strand β1 ses ikke i De delvis bestilte EfClpP-aksiale sløyfene, Selv Om EfClpP har potensielle hydrogenbindingsdannende rester på strand β1 (T6) og på sløyfen som forbinder strenger β1 og β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

i tillegg til konserverte elektrostatiske interaksjoner stabiliserer omfattende hydrofobe kontakter Med ClpP-hodedomenet de aksiale løkkene. I EcClpP + ACP1-06 deltar ikke-polare N-terminale rester av tråd β 1 og den foregående strukturerte spolen i hydrofobe interaksjoner med ikke-polare rester av helix aA av samme underenhet, og på de hydrofobe ansiktene til helikser aA ‘og aB’ av en nærliggende underenhet (Supplerende Fig. 7a). De ikke-polare rester på helikser aA, aB’, og β 3 ‘ utgjør en kontinuerlig hydrofob patch på omkretsen av den aksiale pore (Supplerende Fig. 7b) 15.

for å få et klarere bilde av den konformasjonelle heterogeniteten Til ClpP-aksiale sløyfer, ble metyl-TROSY NMR-eksperimenter deretter utført. I utgangspunktet ble en enkelt cysteinmutasjon introdusert I Nmclpps aksiale løkker (T10C). Jevnt deuterert protein ble produsert og deretter reagert MED 13C-metyl-metanetiosulfonat (MMTS). Dette resulterer i feste AV EN ENKELT NMR synlig 13ch3-s gruppe til cystein sidekjeden, som fører til dannelse Av En s-methylthio-cystein (MTC) residue42. Denne metoden gir en enkel måte å overvåke strukturen og dynamikken til store komplekser i løsning. Overvåking AV NMR-korrelasjonene til den vedlagte spin-sonden i frie, aktivatorbundne eller muterte former av enzymet gir en avlesning av løsningskonformasjonen av de aksiale porene.

i Utgangspunktet ble kontrolleksperimenter utført for å sikre at innføringen AV T10MTC-delen ikke forstyrrer Strukturen Til NmClpP. Kort sagt, 1h-13c heteronukleære multiple quantum coherence (HMQC) korrelasjoner AV WT Og T10MTC NmClpP merket 13CH3 på sidekjeden AV ILVM rester i en ellers fullt deuterated bakgrunn ble sammenlignet og funnet å være nesten identisk. Deretter ble 1H-13C HMQC korrelasjoner Av NmClpP T10MTC oppnådd i forskjellige tilstander(Fig. 6a). Apo-formen (blå konturer) har et stort antall korrelasjoner, som indikerer strukturelt heterogene aksiale sløyfer. Tilsetning av todelt molar overskudd AV ADEP-28 (aktivitet gitt I Fig. 4a) over monomer ClpP betydelig redusert antall korrelasjoner (røde konturer), som indikerer rigidification eller strukturell rekkefølge. I motsetning acp1-17 binding (to ganger molar overskudd over monomer ClpP; aktivitet gitt I Fig. 4a) resulterer i uoppdagbare endringer i de observerte korrelasjonene (grønne konturer), noe som betyr at de aksiale løkkene ikke påvirkes.

denne tilnærmingen ble også utnyttet for å overvåke effekten av aktiverende mutasjoner (Fig. 4a, b) på aksiale løkker. I disse forsøkene ble de aktiverende mutasjonene introdusert i bakgrunnen AV t10c (merking) mutasjonen. Som vist I Fig. 6a, korrelasjoner Av NmClpP T10MTC / E31A mutant (røde konturer) er litt mindre heterogene enn pseudo WT-formen, mens De Av NmClpP T10MTC / E58A mutant (oransje konturer) er nesten uendret. Den samtidige tilstedeværelsen av begge aktiverende mutasjoner (NmClpP T10MTC / E31A + E58A ) har en mye mer dramatisk effekt enn enkeltmutasjoner og fjerner et stort antall korrelasjoner som svarer til de aksiale sløyfer (svarte konturer). Dette er i samsvar med observasjonen at den doble mutanten er mer aktiv enn de enkle mutantene (Fig. 4a).

clpp-aktivering resulterer i reduksjon i konformasjonell heterogenitet i håndtaket

DEN SAMME NMR-baserte tilnærmingen ble brukt til å undersøke effekten av aktivatorbinding og mutasjoner på håndtaket. En i144mtc (helix aE) mutant Av NmClpP ble utarbeidet og studert AV NMR i apo-, ADEP-28-og ACP1-17-bundne former. Apo-formen (blå konturer, Fig. 6a) viser et par topper, noe som indikerer at håndtaket er forbundet med et par sameksisterende konformasjoner, som vist i vårt tidligere arbeid På EcClpP4. Interessant, tillegg AV ACP1 og ADEP fører til at en av toppene forsvinner. Gitt at aktivatorbindingsstedet er distalt FOR NMR-spinnproben, ser DET ut TIL AT ACP1 eller ADEP-binding allosterisk velger for en av konformasjonene i håndtakområdet. Alternativt kan aktivatorer være i stand til å binde begge former, men indusere en endring til en enkelt tilstand.

Magnetiseringsutvekslingseksperimenter med blandingsforsinkelsesperioder av 100, 200, 300, 400, 500, og 600 ms ved 40 hryvnias C var ikke i stand til å oppdage noen interkonvertering mellom konformatorene observert for håndtaksregionen FOR WT NmClpP. Dette indikerer at utvekslingsprosessen er for langsom for karakterisering AV NMR.

SAXS demonstrerer aktivator-indusert ClpP konformasjonsendringer i løsning

for ytterligere å undersøke den oligomere tilstand Og strukturelle endringer ved forbindelse binding, apo-NmClpP Og NmClpP+ADEP-04 prøvene ble karakterisert VED SAXS (Fig. 6b-g Og Supplerende Fig. 8). Endelige sammenslåtte kurver er vist I Fig. 6B, OG SAXS-profilene som ble oppnådd, lignet de av hule strukturer43. Ingen vesentlige endringer ble funnet i form av total folding (Supplerende Fig. 8), radius av gyrasjon (Rg) og oligomere tilstand når ADEP-04 ble lagt Til NmClpP (Supplerende Fig. 8c). FOR å analysere NmClpP SAXS-profilene ytterligere og generere solution ab initio-strukturer, BLE GNOM-programmet brukt til å konstruere paravstandsfordelingsfunksjoner, p (r). Apo-NmClpP p (r) avslørte en subtil høyre skift og større maksimal dimensjon (Dmax) i forhold TIL ADEP-04-bundet NmClpP (Fig. 6c Og Supplerende Fig. 8c). Deretter ble dummy atommodeller (Dammer) generert ved hjelp AV SAXS-data for å visuelt analysere NmClpP-løsningsstrukturer (Fig. 6d-g). Ti modeller ble generert for apo-NmClpP Og ADEP-04-bundet NmClpP, og de mest sannsynlige ble valgt. Disse modellene viste at de to NmClpP-løsningsstrukturene generelt er like (hule sylindere). Men når de ble overlappet med de tilsvarende krystallstrukturer, ble forskjeller som er enige med høyoppløselige strukturer lett observert (Fig. 6d, e). Et mål på aksialhøydene til alle ti Dammer for apo – og ADEP-04-bundet NmClpP resulterte i verdier av 93.0 ± 5.4 Å for apo-skjemaet og 103.5 ± 6.1 Å for ADEP-04-bundet skjema. For ytterligere å bekrefte denne observasjonen, gjennomsnittlig Dammer sannsynlighetskart og høyeste das belegg kart (Fig. 6f, g) ble analysert. De aksiale høydene viste en økning på omtrent 10 Å FOR ADEP-04-bundet NmClpP sammenlignet med apo-NmClpP. Videre viste ADEP-04-bundet NmClpP en større aksial poreomkrets enn apo-NmClpP(Fig. 6f, g). Således, til tross FOR DEN lave oppløsningen AV SAXS-teknikken, tyder resultatene på AT ADEP-04-binding Til NmClpP ikke påvirker den oligomere tilstanden Til NmClpP, men forårsaker en utvidelse av de aksiale porene og økt belegg på Topp-og bunndelene Av NmClpP + ADEP-04-DAMMEN(Fig . 6e, g) sammenlignet med apo-NmClpP. Dette gjenspeiler sannsynligvis konformasjonsendringer som fører til redusert heterogenitet av strukturen Til De n-terminale aksiale sløyfer Av NmClpP observert Av Røntgen OG NMR.