Clemizol Og modulatorer av serotoninsignal undertrykke anfall i Dravet syndrom

Abstract

Dravet syndrom Er en katastrofal barndomsepilepsi med tidlige anfall, forsinket språk-og motorisk utvikling, søvnforstyrrelser, angstlignende oppførsel, alvorlig kognitiv svikt og økt risiko for dødsfall. Det er primært forårsaket av de novo-mutasjoner AV SCN1A-genet som koder for en nevronspenningsaktivert natriumkanal. Sebrafisk med en mutasjon I scn1a-homologen rekapitulerer spontan anfallsaktivitet og etterligner de konvulsive atferdsbevegelsene observert i Dravet syndrom. Her viser vi at fenotypisk screening av narkotikabiblioteker i sebrafisk scn1 mutanter raskt og vellykket identifiserer nye terapier. Vi viser at clemizol binder seg til serotoninreseptorer, og dets antiepileptiske aktivitet kan etterlignes av legemidler som virker på serotoninsignalveier, f. eks. trazodon og lorcaserin. Samtidig med disse sebrafiskfunnene behandlet vi fem pasienter med Dravet syndrom med klinisk godkjent serotoninreseptoragonist (lorcaserin, Belviq®) og observerte noen lovende resultater med hensyn til reduksjon i anfallsfrekvens og/eller alvorlighetsgrad. Våre funn viser en rask vei fra preklinisk funn i sebrafisk, gjennom målidentifikasjon, til potensielle kliniske behandlinger for Dravet syndrom.

Innledning

Barndomsepilepsi klassifisert som katastrofal er ofte forbundet med en genetisk mutasjon. Blant Disse Har Dravet syndrom vært knyttet til mer enn 600 de novo mutasjoner I et enkelt gen, SCN1A (Catterall et al., 2010; Jørgen et al., 2010). Barn som lider Av Dravet syndrom har anfall som starter så tidlig som 6 måneders alder, forsinket språk-og motorutvikling, søvnforstyrrelser, angstlignende oppførsel og alvorlig kognitiv svikt (Dravet, 2011). Symptomer på autismespektrumforstyrrelse har også blitt rapportert (Li et al., 2011) og risikoen for plutselig uforklarlig død med epilepsi (SUDEP) i denne populasjonen er anslått til 15 ganger høyere enn andre barndomsepilepsi (Kearney, 2013). Tilgjengelige antiepileptika gir ikke tilstrekkelig anfallskontroll, og resektive nevrokirurgiske prosedyrer er vanligvis ikke et alternativ. Nye behandlinger for Dravet syndrom forblir et viktig udekket behov til tross for en viss grad av effekt i begrensede kliniske studier for cannabidiol (Epidiolex®) og stiripentol (Diacomit®), som kan knyttes til henholdsvis kognitive eller appetitt sikkerhetsproblemer (Perez et al ., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Jørgen et al., 2016).

Mutasjoner I SCN1A, et gen som koder for den poreformende α-subenheten til en spenningsstyrt natriumkanal (Nav1.1), er identifisert hos nesten 85% av pasientene Med Dravet syndrom (Dravet, 2011). Nav1. 1 kanaler bidra til rask depolarisering av nevronmembraner sett under aksjonspotensial generasjon (Hodgkin et al., 1952). Mus heterozygote for tap av funksjon mutasjon I Nav1.1 utvikler spontane og temperaturfølsomme anfall tidlig i livet, og dør for tidlig rundt postnatal Dag 25 (Yu et al., 2006; Odd et al., 2009; Jørgen et al., 2012). Akutte elektrofysiologistudier i disse Og relaterte Scn1a-mangelfulle mus antyder en reduksjon i natriumstrømstetthet og en tilhørende reduksjon i avfyringsaktiviteten for en subpopulasjon AV GABA-uttrykkende hemmende nevroner (men ikke eksitatoriske hovedceller) som kulminerer i redusert synaptisk inhibering og nettverkshypereksitabilitet (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Denne ‘interneuronopathy’ hypotesen er i samsvar med andre former for katastrofale barndomsepilepsi og ble bekreftet hos mus Hvor Scn1a ble selektivt slettet fra parvalbumin-eller somatostatin-uttrykker interneuron subpopulasjoner (Dutton et al., 2013; Jørgen et al., 2014). Autistisk-lignende atferd ble også rapportert hos disse musene (Han Et al., 2012). Interessant, innledende studier på humane eksitatoriske og hemmende nevroner avledet ved hjelp av indusert pluripotent stamcelleteknologi fra to pasienter med Dravet syndrom rapporterte underskudd i spenningsaktivert natriumstrøm for begge celletyper, noe som tyder på enten homeostatisk kompensasjon for tidlig tap av funksjon av en kritisk hjernespesifikk natriumkanal, eller tilleggsmekanismer som bidrar til den epileptiske fenotypen observert hos disse pasientene (Jiao et al ., 2013; Liu et al., 2013).

selv om mus og humane induserte pluripotente stamcelleavledede nevroner bidrar til vår forståelse av den underliggende patofysiologien Til Dravet syndrom, er disse systemene ikke godt egnet for rask identifisering av nye terapier på grunn av variabiliteten av disse modellene og reproduserbarheten av kvantitative målinger. Som sebrafisk er en ideell virveldyr modell system for å utføre små molekyl fenotype-baserte skjermer (MacRae et al., 2015), og er mottagelig for genetiske manipulasjoner, fokuserte vi vår innsats på en sebrafisk natriumkanalmutant. Sebrafisk mutanter husing en tap-av-funksjon missense mutasjon I SCN1A orthologue, scn1Lab, ble identifisert i en mutagenese skjerm (Schoonheim et al., 2010). På grunn av en forfedrenes helgenom duplisering, sebrafisk scn1Lab mutanter er haploinsufficient For Nav1.1 og analog Med Scn1a+/− mus eller pasienter Med Dravet syndrom. Konvulsiv oppførsel og episoder av kort interictal og langvarig polyspike ictal-lignende elektrografisk utslipp observeres hos mutantlarver så tidlig som 3 dager etter befruktning (dpf) med progresjon til mer robuste anfallsfenotyper mellom 4 og 7 dpf(Baraban et al ., 2013; Hong et al., 2016). Mutant larver dør for tidlig, utviser metabolske underskudd (Kumar Et al., 2016), og er resistente mot mange antiepileptika (AEDs) (Dinday et al., 2015). I likhet med den kliniske styringen Av Dravet syndrom, kan noe demping av anfallsaktivitet oppnås med valproat, benzodiazepiner, bromider, stiripentol, samt et ketogent diett (Baraban et al., 2013). Ved hjelp av scn1lab mutant sebrafisk larver og en totrinns fenotypebasert screeningstrategi har vi nå screenet mer enn 2300 forbindelser. Clemizol, en førstegenerasjons histaminreseptor (H1) antagonist, ble identifisert som en potent hemmer av atferdsmessig og elektrografisk anfallsaktivitet (Baraban et al., 2013). Antihistaminer er imidlertid kontraindisert hos pediatriske epilepsipopulasjoner (Miyata et al., 2011) og H1-reseptoranalogen i sebrafisk viser mindre enn 50% likhet med mennesker (Peitsaro et al., 2007). Her bruker vi prekliniske sebrafiskmodeller for å demonstrere at clemizol, men ikke antihistaminer, utøver antiepileptisk aktivitet. På grunnlag av ligandbinding og ytterligere målrettet legemiddel screening i scn1 mutant sebrafisk, identifiserte vi flere serotonin (5-HT) modulatorer som effektive for å undertrykke anfall, inkludert TO (trazodon og lorcaserin) FDA-godkjente forbindelser. Lorcaserin (Belviq®) ble forskrevet under et compassionate use program til barn med Dravet syndrom og resulterte i redusert anfallsaktivitet hos noen pasienter. Vi foreslår at modulering av 5-HT signalering representerer en ny terapeutisk intervensjon for denne katastrofale barndommen epilepsi.

Materialer og metoder

Sebrafiskvedlikehold

Anfallsovervåking

ved 5 dpf ble individuelle sebrafisklarver plassert i en enkelt brønn med en klar flatbunnet 96-brønns mikroplate som inneholdt embryomedier. Larver ble valgt tilfeldig da kjønnsbestemmelse ikke er mulig på dette stadiet. Mikroplater ble plassert inne I DanioVision bevegelsessporingsenhet og akklimatisert i 20 min ved romtemperatur. Locomotion plott ble oppnådd for hver brønn under et opptak epoke av 10 min ved Hjelp Av En DanioVision system kjører EthoVision XT programvare (DanioVision, Noldus Information Technology); terskelregistreringsinnstillinger for å identifisere objekter som er mørkere enn bakgrunnen, ble optimalisert for hvert eksperiment. Beslag scoring ble utført ved hjelp av følgende tre-trinns skala etablert for pentylenetetrazol-induserte anfall (Baraban et al., 2005): Stage 0, no or very little swim activity; Stage I, increased, brief bouts of swim activity; Stage II, rapid ‘whirlpool-like’ circling swim behaviour; Og Stage III, paroksysmal helkropps klonus-lignende kramper, og et kort tap av holdning. Wild-type fisk er normalt scoret På Scenen 0 Eller I. Plottene ble analysert for distanse (i millimeter) og gjennomsnittshastighet (i millimeter per sekund). Som rapportert tidligere (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013) var hastighetsendringer den mest sensitive analysen av anfallsadferd.

for elektrofysiologiske studier ble sebrafisklarver kort paralysert med α-bungarotoksin (1 mg / ml)og immobilisert i 1,2% agarose; lokale feltpotensialopptak ble oppnådd fra forstrukturer ved hjelp av en enkeltelektrod teknikk, som tidligere beskrevet (Baraban et al ., 2005; Hong et al., 2016). Agarose-embedded lokale feltet potensielle opptaksøkter på 10 til 30 min ble oppnådd for hver fisk på 1 kHz. IZAP-systemet (Hong Et al., 2016) ble brukt til langsiktig ikke-invasiv overvåking av sebrafisk i fravær av et lammende middel. Systemet fanger autonomt flere sebrafisk larver under flere integrerte overflateelektroder i mikrofluidkamrene. scn1lab larver ble kontinuerlig overvåket for 5 h. Elektrisk felt potensial ble registrert på 1 kHz kontinuerlig unntatt 2-til 3-min pauser for media endring for sammensatte behandling og vasking. De registrerte dataene ble analysert VED HJELP AV MATLAB for feltpotensialgrafer og frekvensanalyse.

Sammensatte bibliotek screening

Forbindelser for narkotika screening ble kjøpt Fra Selleck Chemicals og ble gitt som 10 mM DMSO løsninger. Sellecks Ion Channel Ligand Library (Katalog #L2700), Gpcr Compound Library (Katalog #L2200) og et tilpasset 5-HT modulerende bibliotek ble brukt til screening. Bibliotekforbindelser er oppført I Supplerende Tabell 1. I alle narkotika bibliotek skjermer, forbindelser ble kodet og eksperimenter ble utført av etterforskere som var blinde for innholdet av forbindelsen. Baseline opptak av bevegelsesadferd ble oppnådd fra mutanter i embryomedier, som beskrevet ovenfor; et andre lokomotivplot ble deretter oppnådd etter en løsningsendring til en testforbindelse og en likevektsperiode på 20 min. Forbindelser for lokomotivstudier ble oppløst i embryomedier og ble testet med en konsentrasjon på 250 µ, med en ENDELIG DMSO-konsentrasjon på 2,5%.

Kriterier for positiv treffbetegnelse var som følger: (i) en reduksjon i gjennomsnittlig hastighet på ≥40%; og (ii) en reduksjon Til Stadium 0 Eller Stadium I anfallsadferd i lokasjonsplottet for minst 50% av testfisken. Hver testforbindelse klassifisert som en ‘positiv hit’ i lokomotivanalysen ble vurdert for toksisitet ved direkte visualisering på et stereomikroskop etter en 90 min legemiddeleksponering. Toksisitet (eller dødelighet) ble definert som ingen synlig hjerterytme eller bevegelse som respons på ekstern stimulering hos minst 50% av testfisken. Hyperexcitability ble definert som en forbindelse som forårsaket en ≥40% økning i svømmehastighet og / ELLER fase III anfallsaktivitet hos minst 50% av testfisken. Positive treff identifisert i primær locomotion skjermen ble bekreftet ved hjelp av locomotion screening metoden i en andre analyse med en uavhengig clutch av sebrafisk. Forbindelser ble deretter kjøpt separat Fra Sigma-Aldrich og testet ved hjelp av locomotion screening-metoden for tredje gang på en uavhengig kobling av sebrafisk. Legemidler som reduserte gjennomsnittlig svømmehastighet over terskel og var giftfri i de tre uavhengige lokomotivanalysene ble videre analysert ved hjelp av elektrofysiologisk analyse. I elektrofysiologistudier ble legemidler først bekreftet med en konsentrasjon på 250 µ ved bruk av locomotion assay, og deretter ble samme sebrafisk evaluert ved bruk av en lokal feltpotensialregistrering. All screening ble gjort med kodede forbindelser og analysert av etterforskere blindet til sammensatt identitet.

Fylogenetisk analyse

Fylogenetisk analyse av humane HTR2-og sebrafisk htr2-proteinsekvenser ble utført med PhyML-programvaren under sh-lignende sannsynlighetsforhold testparametere (http://www.phylogeny.fr/) (dereeper et al ., 2008). Proteinsekvenser ble avledet fra Ensembl human HTR2A (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198), og sebrafisk htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ensdart00000104569), HTR2CL1 (ENSDART00000024191) SEKVENSER.

Kvantitativ sanntids mrna-uttrykksanalyse

ekspresjonsnivåene for sebrafisk htr2-gener ble undersøkt ved HJELP AV RNA samlet fra 25 hoder eller haler fra 5 dpf villtype eller scn1Lab homozygote mutantlarver, og dissekerte hjerner fra individuell villtype voksen mannlig sebrafisk. Totalt RNA ble ekstrahert Ved Bruk Av TRIzol® Reagens (Invitrogen), i henhold Til produsentens protokoll og behandlet Med DNase I (Invitrogen). Renset mRNA ble retrotranscribed til cDNA ved Bruk Av hevet skrivekurs iii Førstestrengsyntesesystem (Invitrogen) med en blanding av oligo (dT)20. Ekspresjonsnivåene for sebrafisk htr2-gener og husholdningsgenet eukaryotisk oversettelsesforlengelsesfaktor 1 alfa 1, som 1 (eef1a1l1) ble bestemt ved hjelp av En StepOne™ Real-Time PCR-maskin (Applied Biosystems). Reaksjonene ble utført i 20 µ volumer på plater med 96 brønner ved BRUK AV SYBR®Green Master Mix( Applied Biosystems), med 250 nM primer og 3 µ fra cDNA. Oligonukleotidsekvenser er oppført I Supplerende Tabell 2. Data ble analysert fra tre uavhengige eksperimenter. Data ble uttrykt Som Ct-verdier og brukt til å bestemme Hryvct-verdier.

Humane studier

etter vellykket identifisering av forbindelser i vår sebrafiskmodell og vurdering av farmakokinetikken, ble barn foreskrevet Belviq® (lorcaserin) under en compassionate use protocol Ved Children ‘ S Hospital Colorado (IND 125307). Barn kvalifisert for Bruk Av Belviq® hvis de hadde EN SCN1A-mutasjon eller en klinisk diagnose Av Dravet syndrom, og mislyktes minst to medisiner inkludert stiripentol i noen tilfeller og ekskludert natriumkanalblokkere. Barn ble pålagt å ha et elektrokardiogram og ekkokardiogram ved baseline og hver 6. måned under bruk av produktet. I tillegg ble de pålagt å ha oppfølgingsbesøk hver 3. måned for å sikre tilstrekkelig vekst, samt vurdere for ytterligere bivirkninger. Laboratorietesting var nødvendig hver 6. måned for å inkludere hematologisk testing, leverfunksjonstesting og nyrefunksjonstesting. Belviq® dose ble initiert med 2,5 mg ved sengetid og økte gradvis ukentlig etter behov til en maksimal dose på 10 mg to ganger daglig eller 0,3 mg / kg / dag-avhengig av hva som skjedde først.

Institutional review board godkjenning ble innhentet for retrospektiv datainnsamling inkludert en fraskrivelse av samtykke. Data ble hentet fra en retrospektiv gjennomgang av elektroniske pasientjournaler ved Children ‘ S Hospital Colorado, inkludert alder, anfallstyper og hyppighet før og etter bruk Av Belviq®, bivirkninger, dose Av Belviq® Og samtidig bruk av medisinering.

Statistisk analyse

Data presenteres som den gjennomsnittlige standardfeilen for gjennomsnittet (SEM), med mindre annet er oppgitt. Til sammenligning Mellom to grupper Ble Studentens t-test brukt. Når variansen ikke hadde en normalfordeling, ble Den ikke-parametriske Mann-Whitney u-testen brukt. Enveis ANOVA etter Enten dunnetts flere sammenligningstest for analyse mot en kontrollprøve eller Holm-Sidak parvis flere sammenligninger mellom midler. Forskjeller som anses statistisk signifikante er indikert med stjerner (*P < 0,05; * * P < 0,01).

Resultater

effekt av clemizol på anfallsadferd hos sebrafisk

vi behandlet scn1Lab mutantlarver (5 dpf) med clemizol i konsentrasjoner mellom 30 og 400 µ og overvåket deretter effekten på spontan anfallsadferd ved hjelp av automatisert lokaliseringssporingsprogramvare. Basert på 250 gjentatte lokomotivkontrollstudier med ubehandlede scn1Lab-mutanter, ble en reduksjon i gjennomsnittlig svømmehastighet ≥40% (>1,5 × SD) fra baseline satt som terskel for positiv suppresjon av anfallsadferd. Clemizole (Fig. 1A) viste antiepileptisk aktivitet ved 300 og 400 µ (30 min eksponering) og ved 100 µ (90 min eksponering) (Fig. 1b); forlenget eksponering var toksisk ved høyere konsentrasjoner. For å avgjøre om clemizol kan undertrykke spontan anfallsadferd i en annen sebrafisk scn1 mutant, screenet vi mutant scn1Laa larver (5 dpf) i locomotion tracking assay. Larver identifisert Som stadium III anfallsatferd (f.eks. fullkroppskramper, høyhastighets svømmeaktivitet og kort tap av kroppsholdning; Fig. 1C) ble bekreftet som viser elektro utslipp med interictal – og ictal-lignende komponenter i påfølgende feltopptak fra forebrain (Fig. 1D). Gjennomsnittlig svømmehastighet for larver identifisert som S3 eller ‘antatte scn1Laa mutanter’ sebrafisk var signifikant høyere enn for søsken kontroller, eller alle larver testet (Fig. 1e); mutanter ble bekreftet som scn1Laa homozygoter ved post hoc PCR. Vi testet deretter legemidler som tidligere har vist seg å undertrykke spontane anfall i Dravet syndrom og scn1Lab mutanter (250 µ stiripentol og 250 µ diazepam) samt 250 µ lamotrigin (EN AED som kan forverre anfall i Dravet syndrom). Som forventet undertrykte stiripentol og diazepam, men ikke lamotrigin, signifikant anfallsadferd i scn1laa mutantlarver; 250 µ clemizol var også effektivt i denne analysen( Fig . 1F). Sammen viser disse studiene at clemizol kan undertrykke anfallsadferd i to forskjellige scn1 mutant sebrafisk linjer.

Undersøkelse av virkningsmekanismen for clemizol

Sekundær legemiddelskjerm ved bruk av scn1lab mutanter

Tertiær screening for å identifisere lovende blyforbindelser for klinikken

5-ht-reseptoruttrykk i sebrafisklarver

da clemizol har signifikant bindingsaffinitet TIL HTR2A og HTR2B, og både trazodon og lorcaserin er 5-HT signalmodulatorer, søkte vi å bekrefte ekspresjonen av disse reseptorene i sebrafisk. Proteinsekvensjustering av humane OG sebrafisk HTR2-reseptorer avslørte evolusjonsbevaring med sebrafiskorthologier, Med Htr2aa og Htr2ab som begge viser 59,3% proteinidentitet med den humane HTR2A; Og en enkelt HTR2B-orthologue, Htr2b som viser 62,0% proteinidentitet. Kvantifisering av htr2 uttrykksnivå ved hjelp av isolerte hoder eller haler av 5 dpf villtype eller scn1Lab mutant larver avdekket beriket htr2a og htr2cl1 uttrykk i hodet. Lignende resultater ble oppnådd fra voksen villtype sebrafisk hjerne, da mutantlarver ikke overlever til voksen alder (Supplerende Fig. 4).

Reduksjon av anfallsfrekvens hos pasienter med Dravet syndrom

Dravet syndrom er en katastrofal barndomsepilepsi og sjelden lidelse (http://www.rarediseases.org/) med svekkende utfall inkludert uhåndterlig epilepsi, alvorlig begrenset kognitiv utvikling og risiko FOR SUDEP. Våre prekliniske data gir bekreftelse på at modulering av 5-HT-signalering kan undertrykke anfall assosiert MED SCN1A tap av funksjon mutasjoner. Fordi identifiserte 5-HT modulatorer ER FDA-godkjente forbindelser med kjente sikkerhetsprofiler, kan behandling med disse repurposed stoffene endre anfallsfrekvens hos barn med Dravet syndrom. Denne translasjonelle tilnærmingen retter seg mot sjeldne og ødeleggende sykdommer som store kliniske studier ikke er gjennomførbare for (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

da clemizol for tiden ikke er produsert eller tilgjengelig i klinisk karakterformulering, og trazodon kan fungere som en 5-HT reseptoragonist eller antagonist, avhengig av konsentrasjon (Maj et al ., 1979; Marcoli et al., 1998), valgte Vi Å evaluere Belviq® (lorcaserin) under et compassionate use off-label-program hos en liten populasjon av barn med Dravet syndrom. Disse barna ble vist å være resistente mot minst fem godkjente AEDs. Fem barn (gjennomsnittsalder: 11,8 år; område: 7-18 år) heterozygot for sletting I SCN1A ble behandlet prospektivt Med Belviq® og fulgt i lengderetningen ved Children ‘ S Hospital Colorado (Aurora, CO). Behandlingsprotokollen ble godkjent Av Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB), og foreldre Til Dravet syndrom pasienter samtykket skriftlig til barnets deltakelse. Vi gjennomgikk i ettertid det dagboksrapporterte antallet atoniske, myokloniske og generaliserte tonisk-kloniske (GTC) anfall, bivirkninger og Samtidige Bivirkninger.

de kliniske karakteristikkene til Dravet syndrom barn behandlet Med Belviq® er oppsummert i Tabell 1. Det var ingen dødsfall blant de fem Belviq®-behandlede pasientene, Og Belviq® ble godt tolerert uten alvorlige bivirkninger som forårsaket seponering av behandlingen. Under off-label Belviq® behandling var en pasient i utgangspunktet anfallsfrie i 3 uker, en pasient var anfallsfrie i 2 uker, og en tredje pasient hadde 1-2 anfallsfrie dager per uke. Alle fem pasientene viste en reduksjon i totalt antall anfall. Generaliserte tonisk-kloniske anfall ble signifikant redusert hos Pasienter 1, 2 og 3. Faktisk opplevde Pasient 2 en 90% reduksjon i generaliserte tonisk-kloniske anfall uten behov for redningsmedisiner. To pasienter forblir på Belviq® uten økning i anfallsfrekvens, og som forventet var den vanligste bivirkningen observert nedsatt appetitt. En pasient startet medisinering en gang til med midlertidig forbedring i en kort periode og deretter avsmalnet.

Diskusjon

Clemizol, et første generasjons antihistamin oppdaget på 1950-tallet (Zierz et al., 1952), ble identifisert som en potensiell terapeutisk for behandling Av Dravet syndrom ved bruk av scn1Lab mutant sebrafisk for å screene repurposed drug libraries (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Her bekreftet vi en antiepileptisk aktivitet for clemizol ved hjelp av en annen scn1 sebrafisk mutantmodell. Dessverre metaboliseres clemizol raskt hos mus med en plasmahalveringstid på < 10 min (sammenlignet med 3.4 h hos mennesker) (Nishimura et al., 2013), begrenser evalueringen i murine-modeller. Vellykket brukt som et antihistamin (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) med akutte og kroniske studier som rapporterte en lav toksisitetsrekkefølge (Finkelstein et al., 1960), er clemizole ikke lenger produsert og ikke tilgjengelig for off-label klinisk administrasjon. I mangel av et middel for å effektivt evaluere clemizol i prekliniske gnagermodeller, brukte vi sebrafisk for målengasjement (5-HT-reseptorer) og identifisering av relaterte legemidler (trazodon og lorcaserin) med passende sikkerhetsprofiler som letter rask oversettelse til en klinisk anvendelse. Medfølende bruk, off-label resept Av Belviq® (lorcaserin) til medisinsk intractable Dravet syndrom pasienter er også beskrevet.

Antihistamin H1-reseptorantagonister er normalt kontraindisert hos pediatriske pasientpopulasjoner (Miyata et al., 2011) og screening av disse stoffene bekreftet deres manglende evne til å undertrykke (og i noen tilfeller forverre) anfall i scn1 sebrafisk. Bindingsdata avdekket en tidligere ukjent affinitet til clemizol FOR htr2a-og / ELLER HTR2B-reseptorer. En etterfølgende fenotypisk skjerm av målrettede biblioteker identifiserte to 5-HT-modulerende forbindelser, trazodon og lorcaserin, som var i stand til å undertrykke atferds-og elektrofysiologiske anfall på en måte som var sammenlignbar med clemizol. Belviq® (lorcaserin) er EN FDA-godkjent HTR2C-agonist foreskrevet for kronisk vektstyring (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (trazodon) er også ET FDA-godkjent antidepressivt middel som ofte foreskrives for søvnforstyrrelser(Mendelson, 2005). Det er ofte klassifisert SOM EN HTR2A og HTR2C invers antagonist og 5-HT opptakshemmer (Stahl, 2009). Studier på rotter tyder imidlertid på at trazodon, eller metabolitten meta-klorfenylpiperazin (mCPP), kan fungere SOM EN htr2c-agonist ved høyere konsentrasjoner (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). Spesielt ble kronisk trazodonbehandling tidligere vist å være beskyttende mot elektrokonvulsive induserte anfall hos mus (Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), som støtter våre data fra scn1Lab mutant sebrafisk. En 5-HT reseptormediert virkning for clemizol er også i samsvar med en nylig fenotypisk skjerm hvor modulatorer av serotonerg signalering (inkludert clemizol) ble vist å være en effektiv behandling i en preklinisk modell Av Machado-Joseph sykdom (Teixeira-Castro et al ., 2015); og studier her tyder på at clemizol og trazodon garanterer videre utvikling for off-label testing hos pasienter med Dravet syndrom.

våre resultater legger også til en voksende mengde bevis som tyder på modulering av serotonerg signalering som en potent suppressor av anfallsaktivitet, spesielt i katastrofale barndomsepilepsi som Dravet syndrom. Nylig ble 7 av 10 pasienter på lavdosebehandling med 5-HT reuptake blocker fenfluramine selvrapportert å være anfallsfrie i 1 år (Ceulemans et al ., 2016). En liten fortykkelse av en eller to hjerteventiler ble rapportert hos to av disse pasientene i samsvar med en mulig sammenheng mellom bruk av fenfluramin og pulmonal hypertensjon (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Hos mennesker uttrykkes HTR2A og HTR2C i CNS, MENS HTR2B-uttrykk er beriket i hjertet (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Mer spesifikt er HTR2C uttrykt på en subpopulasjon av hemmende interneuroner (Liu et al., 2007) og aktivering av disse reseptorene med 5-HT øker GABA-mediert synaptisk inhibering (Boothman et al.(2006) det vil si den antiepileptiske virkningsmekanismen som ligger til grunn for mange vanlige foreskrevne antiepileptika. Faktisk, de fleste prekliniske studier tyder aktivering AV HTR2A og / ELLER HTR2C reseptorer har antiepileptiske effekter (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), som er en rimelig virkningsmekanisme som forbinder clemizol, lorcaserin, trazodon og 5-HT reuptake blocker fenfluramine (Dinday et al ., 2015; Ceulemans et al., 2016). Interessant nok var htr2b-uttrykk i sebrafiskhjernen relativt lav, noe som tyder på at disse stoffene potensielt utøver antiepileptisk aktivitet via HTR2A eller HTR2C-reseptoraktivering. Interessant, studier I Drosophila knock-in fluer bærer K1270T SCN1A human mutasjon i para natrium kanal genet har vist at tilskudd med en 5-ht forløper (5-hydroxytryptophan) redder varmen indusert anfall fenotype (Schutte et al., 2014). I tillegg evaluerte en nylig studie ved hjelp av scn1Lab mutanter 13 5-HT signalforbindelser og foreslo også en potensiell antiepileptisk rolle for modulatorer av 5-HT signalering(Sourbron et al ., 2016). Disse sistnevnte sebrafiskstudiene brukte imidlertid en fundamentalt forskjellig protokoll (24 timer versus 30-90 min legemiddeleksponering) som ikke tidligere var validert som vellykket identifiserende AEDs brukt i Dravet syndrom (benzodiazepiner, valproat, stiripentol, bromider og ketogen diett). I tillegg er legemiddelkonsentrasjoner noen 10 ganger lavere enn vi viser å være effektive i sebrafisk (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), og rapportering av en antiepileptisk virkning for hallusinogen TCB-2 (Fig. 5), antyder at direkte sammenligning av data fra laboratorier som bruker forskjellige prosedyrer, bør tolkes med forsiktighet.

Samlet konkluderer vi med at mutant sebrafisk er en egnet modell for rask screening og oppdagelse av nye AEDs som med passende sikkerhetsprofiler kan direkte informere klinisk behandling for pasientpopulasjoner i fare som Dravet syndrom.

Forkortelser

Forkortelser
• 5-HT

  serotonin

• AED

  antiepileptisk legemiddel

• dpf

  dager etter befruktning

• GPCR

  g-proteinkoblet reseptor

• iZAP

  integrert sebrafisk analyseplattform

Takk

vi vil gjerne takke medlemmer Av baraban laboratory, Brian Grone og Matthew Dinday spesielt, for nyttig diskusjoner i løpet av disse studiene.

Finansiering

Scb anerkjenner finansiering FRA NINDS R01 stipend nr. NS079214, UCSF Catalyst Award Og Raymond & Beverley Sackler Senter Sabbatsår Fond.

Supplerende materiale

Supplerende materiale er tilgjengelig På Brain online.