Cisplatin ototoxicity innebærer cytokiner OG STAT6 signalnettverk

Reagenser

Cisplatin og 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT) ble kjøpt Fra Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, USA). Plastkulturmaterialene ble kjøpt fra Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA). Dulbeccos modified essential medium (DMEM), føtal bovint serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) og andre vevskulturreagenser ble oppnådd Fra Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Rekombinant MUS IL-4 og IL-13 protein, antistoffer mot IL-4, IL-13, tnf-α, IL-1Β, IL-6 og sett med Enzymbundne immunosorbentanalyser (Elisa) for cytokiner ble kjøpt Fra R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Disse antistoffene ble brukt til immunhistokjemi i en konsentrasjon på 1: 200. Antistoffer mot P-STAT4, STAT4, P-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) og IkB ble kjøpt Fra Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

Cellekultur og levedyktighet

etablering og karakterisering av betinget udødelig HEI-OC1 auditive celler ble beskrevet i vår tidligere rapport 1. Ekspresjon AV OHC-spesifikke markører som Math1 Og Myosin 7a antyder AT HEI-OC1-celler representerer OHC-forløpere. HEI-OC1-celler ble opprettholdt i HØYGLUKOSE DMEM (Gibco BRL) som inneholdt 10% FBS. FOR forsøkene beskrevet nedenfor ble HEI-OC1-celler dyrket under følgende permissive forhold: 33 °C og 5% CO2 i DMEM supplert med 10% FBS. Celler (3 × 104 celler / brønn på en 24-brønnplate) ble inkubert med 20 µ cisplatin i 24 timer. FOR å bestemme cellens levedyktighet ble MTT (0,25 mg) tilsatt til en 1 ml cellesuspensjon i 4 timer. etter vasking av cellene og tre vasker MED PBS (pH 7,4) ble det uoppløselige formazanproduktet oppløst i DMSO. Den optiske tettheten (OD) av hver kulturbrønn ble deretter målt ved Hjelp Av En Mikroplateleser (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) ved 590 nm. OD av kontrollcellene ble tatt for å indikere 100% levedyktighet. For å undersøke effekten av ulike cytokiner ble nøytraliserende antistoffer mot cytokiner tilsatt til kulturene i 30 min, hvoretter de ble dyrket med 20 µ cisplatin i 24 timer.

Dyr

STAT4−/− (backcross generasjon N10), STAT6−/− (backcross generasjon N6), OG wt BALB/c mus ble kjøpt fra Jackson Laboratoriet (Bar Harbor, ME, USA). De homozygote STAT4-og STAT6 KO-musene ble identifisert VED PCR. KO-musene viste ikke noen utviklingsmessige abnormiteter. Eksperimenter ble utført i 6 uker gamle mus, og alle musene ble aldersmatchet innen 3 dager. Mus ble matet et standard kommersielt kosthold mens de var plassert ved en omgivelsestemperatur på 20-22 °C og en relativ fuktighet på 50 ± 5% under en 12:12 h lys: mørk syklus i et spesifikt patogenfritt anlegg. Alle dyreforsøk ble godkjent Av Animal Care And Use Committee Ved Wonkwang University School Of Medicine.

Luciferase reporter assay

Celler ble transittvis transfisert MED nf-kB luciferase reporter plasmid ved hjelp av transfeksjonsreagenset, Lipofectamine 2000. Etter 36 h inkubasjon ble cellene behandlet med cisplatin for 12 h i nærvær av nøytraliserende cytokinantistoffer. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS buffer og deretter lysert i reporter lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA). Et 20-µ aliquot av lysatet ble deretter blandet med 100 µ av luciferase-analysereagenset, hvorpå den utstrålede lysintensiteten ble målt ved bruk Av et luminometer AutoLumat LB953 (F.eks. Og G Berthold, Bad Wildbad, Tyskland). Endelig ble luciferaseaktiviteten målt i triplikat, gjennomsnitt, og deretter normalisert mot β-galaktosidaseaktivitet ved bruk av galaktosidaseanalysesystemet (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) i henhold til produsentens instruksjon.

Transfeksjon med siRNA constructs

Forhåndsdesignede siRNAs mot musen STAT4, STAT6, OG kontroll kryptert siRNA ble kjøpt Fra Santa Cruz Biotechnology. Sense tråder av siRNAs mot STAT4 OG STAT6 er som følger. STAT4 siRNAs-konstruksjonen er et basseng av tre sekvenser av siRNA som følger: Duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU Uca A-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3′, Og Duplex 3 Sense Strand: 5 ‘- IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3′ (mRNA tiltredelsesnummer: NM_011487). STAT6 siRNAs-konstruksjonen er et basseng av tre sekvenser av siRNA som følger: Duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG A-3’, Og Duplex 3 Sense Strand: 5 ‘- IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC aag A-3’ (mRNA tiltredelsesnummer: NM_009284). Cellene ble transfektert med 100 nM siRNA konstruksjoner I x-tremeGENE siRNA transfeksjon reagens (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Etter inkubasjon ved 33 °C og 5% CO2 i 36 timer ble cellene videre behandlet med cisplatin i 24 timer. prøvene ble deretter fremstilt og analysert for levedyktighet eller Western blot analyse. Forstyrrelsen av uttrykk ble bekreftet ved immunoblotanalyse.

Måling AV proinflammatoriske cytokiner VED ELISA

for å måle sekresjonen av proinflammatoriske cytokiner fra cisplatinbehandlede celler ble kultur-supernatanter høstet på hvert tidspunkt, og nivåene av utskillede proinflammatoriske cytokiner ble deretter bestemt AV ELISA (Quanticincytokin Kits; R & D Systems Inc.) i henhold til produsentens instruksjon.

Fremstilling av cytosoliske og nukleære ekstrakter

Celler ble vasket med iskalde PBS, skrapt og sentrifugert ved 1 000× g i 5 min ved 4 °C. cellepellet ble deretter resuspendert i 200 µ lysisbuffer (10 MM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og 0,5 mm dithiothreitol) og deretter ruges På is i 15 min. Ved slutten av inkubasjonen ble det tilsatt 10 µ på 10% NP-40 og røret ble virvlet i 10 sek. Etter sentrifugering ved 13 000 hryvnias g i 1 min ved 4 °C ble supernatanten (cytosolisk ekstrakt) samlet og lagret ved -80 hryvnias C, mens pelleten ble viderebehandlet for å oppnå atomekstraktene. Pelleten ble deretter resuspendert i ekstraksjonsbuffer (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM dithiothreitol og 25% (vol/vol) glyserol) og inkubert i 30 minutter ved 4 °C. Kjerneekstrakter ble isolert ved sentrifugering ved 13 000× g i 30 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble deretter fjernet og lagret ved -80 °C til den ble brukt til western blot-analyse. Endelig ble proteinkonsentrasjonen bestemt Av Lowry-metoden.

Western blot analyse

Western blot analyse ble utført som følger. Kort sagt ble cellene høstet og vasket to ganger med iskald PBS. De totale og nukleare / cytosoliske fraksjonerte lysatene ble deretter underkastet elektroforese på 12% sds-polyakrylamidgeler for 3 h ved 20 mA, hvoretter de ble overført til nitrocellulose. Membranen ble deretter inkubert i 5% (wt/vol) tørket melkeprotein I PBS som inneholdt 0,05% (vol/vol) Tween-20 (PBS-T) i 1 h, hvorpå DE ble vasket I pbs-T, og deretter reagert videre med primært antistoff (1:1 000) i 1 h. deretter ble membranen grundig vasket med PBS-T og deretter inkubert med anti-kanin IgG-antistoff konjugert TIL HRP (1:3 000) i 1 h. etter omfattende vasker ble proteinbånd på membranen ble visualisert ved hjelp av kjemiluminescerende reagenser i henhold til produsentens instruksjoner (supersignal SUBSTRAT; pierce, rockford, il, usa).

in vivo eksperiment med cisplatin ototoksisitet

alle mus ble tilfeldig delt inn i to grupper på seks mus hver. Gruppe 1 dyr, som ble ansett som en kontrollgruppe, fikk intraperitoneal injeksjon AV PBS. Gruppe 2 dyr ble gitt cisplatin (4 mg/kg kroppsvekt) ved intraperitoneal injeksjon i 4 påfølgende dager. Dyrene ble deretter drept under anestesi VED BRUK AV CO2-gass dagen etter den endelige cisplatininjeksjonen, hvoretter temporal bein i høyre øre ble fjernet.

Måling AV ABR

FOR videre analyse av auditiv terskel BLE ABR målt før og 24 timer etter den endelige behandlingen av cisplatin. ABR-terskelendringene mellom forbehandling og etterbehandling ble deretter sammenlignet. Mus ble bedøvet ved hjelp av en cocktail av ketamin (40 mg / kg) og xylazin (10 mg/kg) og holdt varm med en varmepute under ABR-opptak. En subdermal (aktiv) nålelektrode ble satt inn på toppunktet, mens jord-og referanseelektroder ble satt inn subdermalt i den løse huden under pinnae av motsatte ører. Test stimuli besto av vekslende fase tone bursts ved frekvenser på 4, 8, 16 og 32 kHz. Signaler ble generert ved Hjelp Av Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen programvare. Hver tone burst (1 ms varighet) ble gated gjennom En Blackmann vindu, og hadde en 0.5-ms stige-fall tid uten platå. Stimuliene ble kalibrert før hver testøkt, ved å registrere høyttalerens utgang med en mikrofon plassert på dyrets hodenivå. ABR bølgeformer ble i gjennomsnitt som svar på 300 tone bursts ved hver testet frekvens. Ved hver frekvens ble signalets amplitude automatisk dempet i 10 dB trinn fra 90 dB SPL til ABR-bølgene forsvant i spor registrert med filterinnstillinger på 100-3 000 Hz. Dommen av terskelen ble gjort off-line av to uavhengige, eksperimentelt blinde observatører basert PÅ ABR-postene.

overflatebehandling av Organet Til Corti explants

alle mus ble drept dagen etter siste cisplatininjeksjon. Tinningbenet ble dissekert og festet i 4% paraformaldehyd i 16 timer ved 4 °C, og skylles med 0,1 M PBS. Tinningbenet ble ytterligere avkalket med 10% EDTA i PBS i 3 dager. Cochlea ble nøye dissekert ut. Deretter ble stria vascularis og spiral ligament dissekert bort, forlater organ Av Corti. Den midterste sving av cochlea ble nedsenket I TRITC-merket phalloidin (Sigma P1951, 1: 100) I PBS for 20 min. Etter tre vasker MED PBS ble prøven undersøkt under et fluorescensmikroskop ved hjelp av passende filtre FOR TRITC (excitasjon: 510-550 nm, utslipp: 590 nm).

Immunhistokjemisk farging og TUNELANALYSE

det fjernede temporale benet ble fastgjort i 4% paraformaldehyd i 16 timer og deretter avkalket med 10% EDTA I PBS i 2 uker, hvoretter det ble dehydrert og innebygd i parafinvoks. Seksjoner på 5 µ ble deparaffinert i xylen og rehydrert gjennom graderte konsentrasjoner av etanol. For immunhistokjemistudien ble et immunhistokjemisett (DAKO Lsab Universal K680, Carpinteria, CA, USA) brukt og prosedyrer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Den endogene peroksidasen ble deretter blokkert med 3% hydrogenperoksid i 5 min ved romtemperatur (RT). Etter at seksjonene ble vasket I PBS, ble ikke-spesifikk binding blokkert med 1% bovint serumalbumin i 1 h. Primære antistoffer (1: 200 fortynnet) ble deretter tilsatt til lysbildene, hvoretter inkubasjonen fortsatte i 1 h. etter gjentatte vasker MED PBS ble seksjonene inkubert med biotinylert sekundært antistoff i 30 min og deretter dekket i 30 min med et sekundært antistoff som inneholdt pepperrotperoksidase. Til slutt ble seksjonene farget i en nylaget substratløsning (3 mg 3-amino-9-etylkarbazol i 10 ml natriumacetatbuffer (pH 4,9), 500 µ dimetylformamid, 0,03% hydrogenperoksid)i 5 min. Kjernene til de immunfargede cellene ble deretter counterstained Med Mayers hematoksylin (Sigma-Aldrich Co.). Apoptotiske celler ble påvist in situ ved BRUK AV TUNEL-analysen (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Tyskland). Kort sagt ble en seksjon deparaffinisert og rehydrert. Etter inkubasjon med 20 µ/ml proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Tyskland) ble den endogene peroksidasen blokkert ved å inkubere prøvene i 2% H2O2 i metanol i 30 min VED RT. deretter ble vevsseksjonene vasket I PBS og inkubert med merkeløsning for 1 h ved 37 °C. kjernene ble deretter counterstained med propidiumjodid (0,5@g/ml, Molekylære Prober) i 10 min VED RT. Etter vask MED PBS ble prøven undersøkt under a fluorescensmikroskop.

Revers transkriptase-PCR-forsterkning

for cochlear PCR ble det venstre ørebeinet raskt høstet og nedsenket I RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) til bruk ved -20 °C. deretter ble hele cochleae dissekert ut og brukt til å trekke ut total RNA ved Bruk Av TRIzol (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoller. Etter ekstraksjon av total RNA Ved Bruk Av Trizol (Invitrogen) ble enkeltstrenget cDNA syntetisert fra total RNA. DERETTER BLE PCR med Taq DNA-polymerase (Takara, Takara Shuzo, Japan) utført ved å utsette prøvene for 30 sykluser på 95 °C for 40 s, 58 °C for 40 s og 72 °C for 50 s. Ti mikroliter AV PCR-produktene ble deretter separert på 1,2% agarosegel og visualisert under UV-lys. Sekvensene av primerne som ble brukt TIL PCR-forsterkning var som følger: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, omvendt, 5 ‘- IndexTermGCA GCG HANDLE CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

Statistisk analyse

hvert eksperiment ble utført minst tre ganger, og alle rapporterte verdier representerer midlene ± SD for triplikatanalyser. Statistisk multivariat analyse ble utført ved analyse av varians og Duncan tester, ved HJELP AV spss 11 (Chicago, IL, USA) statistisk programvare. Toveis ANOVA og / ELLER enveis ANOVA ble brukt til å bestemme betydningen av resultatene. De statistiske resultatene ble gjennomgått av en masternivå biostatistiker. Verdier av P < 0.05 ble vurdert som statistisk signifikante.