Chp1 kromodomain binder h3k9me-halen og nukleosomkjernen for å montere heterochromatin

Plasmider og stammer konstruksjon

Chp1CD-mutanter for ekspresjon og rensing ble generert gjennom invers PCR ved bruk av primere oppført I Tilleggstabell S2 fra begynnelsen Av pet28a chp1 chromodomain Plasmid . Heterokromatin rescue assays ble utført ved innføring av plasmider som inneholder chp1 wt og chp1 mutant protein under sin endogene promoter i en chp1δ stamme (SP170, Se Supplerende Tabell S3). chp1-genet i full lengde og dets endogene promoter (-949 bp fra starten av chp1+ – kodingssekvensen) ble klonet i prep1-plasmidet. chp1-kromodomainmutanter ble generert av invers PCR ved bruk av primerne listet i Tilleggstabell S2 og transformert til den angitte chp1δ-stammen.

for genomisk integrasjon ble prep1 plasmid modifisert for å erstatte nmt1+ promotoren med følgende integrasjonskassett: (SphI) Region ved 5′ Av Chp1 genet (Kromosom i, 2215500-2215055) (AscI)—HphMX6 motstandskassett -(SphI) chp1 endogen promoter (Kromosom i, 2214829-2214664)—chp1 kodingssekvens—(bamhi) chp1 terminator (kromosom i, 2210976-2210582) (bamhi). Integrasjonskassetten (både chp1+ og chp1loop1b / 2b-kassetten) BLE DERETTER PCR forsterket og transformert ved elektroporasjon, TIL sp101, SP170 og SP64-stammer. Cellene ble deretter valgt PÅ yes + Hygromycin (50 mg ml−1 Hygromycin) plater. Enkeltkolonier ble isolert, PCR-screenet og sekvensert for genomisk innføring Av HphMX6-resistenskassetten og LOOP1B/2B-mutasjonene.

Stammer som inneholdt plasmider ble dyrket På Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu media. Alle stammer og plasmider som brukes i denne studien er oppført I Tilleggstabellene S3 Og S4.

proteinrensing

His6-SUMO-Chp1CD og ALLE CD-mutanter ble uttrykt I E. COLI BL21 (de3) (pLys) og renset gjennom affinitetskromatografi ved Bruk Av Ni-NTA harpiks (GE Healthcare, Freiburg, Tyskland). His6-SUMO-Chp1CD inneholder trombin spaltningssted mellom to tagger .

totalt ble 0,2 mM IPTG tilsatt for å indusere proteinuttrykk etterfulgt av vekst ved 18 °c O/N. Celler ble høstet ved sentrifugering og re-suspendert i lysisbuffer (20 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 20 mM imidazol). Etter flashfrysing ble cellene tint og inkubert i 30 min i lysozym før sonikering(Branson Sonifier 250-utgang 4, driftssyklus 40). Suspensjonen ble sentrifugert (12000 g, 20 min ved 4 °C) og supernatanten tilsatt Til Ni-NTA-harpiksen pre-equilibrated i bindingsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidazol) og inkubert i 30 min ved 4 °C under rotasjon. Resin ble deretter 5× vasket med bindingsbuffer og proteiner ble eluert i elueringsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidazol). Chp1CD wt og mutanter ble deretter dyalisert O / N i en buffer inneholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD ble deretter ytterligere renset ved gelfiltrering (Superdex 75 pg; GE Healthcare) og dialysert i en buffer inneholdende 20 MM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT.

Silencing assays

Celler for silencing assays ble dyrket til EN OD 0,7–1 Og deretter normalisert til en endelig konsentrasjon av 1×107 celler ml−1 av kultur. Tifoldige serielle fortynninger ble gjort slik at det høyeste tetthetspunktet inneholdt 1×105 celler. Celler ble oppdaget på ikke-selektive (JA) og 5-fluor-orotinsyre (5-FOA 1 g l−1 5-FOA) plater. Platene ble inkubert ved 32 °C i 2-3 dager og avbildet. Celler har et ura4 reporter-gen satt inn i perikentromere imr-repetisjoner (heterochromatic locus). Når ura4 reporter genet er tavlet, kan celler vokse på 5-FOA som inneholder medium. Når heterochromatin er tapt, ura4 reporter genet er uttrykt og celler er ikke i stand til å vokse på 5-FOA medium.

Påvisning AV rna-nivåer ved qPCR (RT-qPCR)

Gjærkulturer (10 ml) ble dyrket TIL EN OD600 PÅ 0,7–1,5. Cellene ble deretter suspendert på nytt i 500 µ lysisbuffer (300 Mm NaOAc pH 5,2, 1% natriumdodecylsulfat) og 500@l fenol-kloroform og inkubert ved 65 °C i 10 min med konstant blanding. Den vandige fraksjonen ble separert fra fenol-kloroform ved sentrifugering (10 min, 20 000 g) og etanol utfelt. Nukleinsyrer ble behandlet Med DNAse I (Roche, Basel, Sveits) i 30 minutter ved 37 °c etterfulgt av 15 minutter ved 75 °varmeinaktivering. Komplementært DNA ble syntetisert ved bruk av 100 ng RNA og 1 pmol AV DNA oligos Med Hevet Iii (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) ved hjelp av standardbetingelser. Rna nivåer ble kvantifisert med qPCR ved Hjelp Av Biozym DyNAmo Flash qRT-PCR kit og normalisert til eukromatisk genet tdh1.

rna elektroforetiske mobilitetsskiftanalyser

RNA-skiftanalyse ble utført etter de tidligere rapporterte tilstandene . Totalt 0.66 pmoler med 32p radiomerket 30 nt sentromere RNA ble inkubert med 10 µ chp1 kromodomain (villtype og mutant) i en buffer inneholdende 20 Mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT og 3% Glyserol. FOR RNA EMSA med 100 nt dg sentromere transkripsjoner ble 2 pmoler AV 32p radiomerket RNA inkubert med 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmoler Av Chp1CD-protein (wt og LOOP1B/2B mutant) i 15 µ sluttvolum. H3K9me3-peptid (Eurogentec, Kö, Tyskland) ble tilsatt Ved Et 1: 1 Chp1CD-H3K9me-peptid, som rapportert i . Inkubasjon ble utført i 1 time på is, og prøver (20 µ sluttvolum) ble deretter lastet på En 10% Akrylamid-Tbe Native gel (bis-Akrylamid-forhold 1:29). For IN vitro rna-nedtrekk ble 1 µ SUMO-Chp1CD (villtype og LOOP1B/2B mutant) bundet til 15 µ ni-NTA-harpiks (GE Healthcare), Og H3k9me3nukleosom ble tilsatt For å montere chp1cd-H3k9me3nukleosomkomplekset I Bindingsbuffer (20 MM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol). Etter vask tre ganger med 50 µ bindingsbuffer ble 2 pmoler AV 32P-merket 100nt dg RNA tilsatt og inkubert med Chp1CD-Nukleosomharpiksen på is i 1 time. harpiksen ble sentrifugert med lav hastighet (60 g, 10 s) og gjennomstrømmingen samlet. Harpiks ble vasket tre ganger med minst 3× (v/v) Bindingsbuffer og Chp1CD-Nukleosom-RNA-komplekset ble eluert ved tilsetning av 300 mM imidazolbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM imidazol), inkubert i 1 time på is med 5 min intervallblanding (bundet fraksjon). Prøver ble lastet på En 10% Tbe Innfødt Akrylamidgel (Bis-Akrylamidforhold 1:29) og løp i 2 timer ved 10 mA ved 4 °C. etter eksponering over natten ble geler skannet ved Hjelp Av TyphoonFLA9000 fosfoimager.

Kromatinimmunoprecipitasjon

Gjærkulturer (100 ml) ble dyrket TIL EN OD600 PÅ 0,7 og kryssbundet med 3% formaldehyd ved romtemperatur i 15 min som beskrevet . Reaksjonen ble slukket med 125 mM glycin i 10 min ved romtemperatur. Cellene ble re-suspendert i 500 µ lysisbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 m natriumacetat, 5 mM MgCl2, 2 mM etylendiamintetraeddiksyre, 2 mM etylenglykoltetraeddiksyre, 0,1% NP-40, 20% glyserol) som inneholder proteasehemmere (proteasehemmere cocktail tabletter, Roche, Komplett, etylendiamintetraeddiksyrefri). Frosne celler ble lysert ved HJELP AV MP Biospec beater. Etter lysis ble ekstraktet sonikert 35× i 30 sekunder (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgia) og spunnet ved 13 000 g i 15 min for å oppnå kromatin-supernatanten. For input-DNA ble det brukt 50 µ av supernatanten. For immunoprecipitasjoner ble supernatantene normalisert basert på proteinkonsentrasjonen og inkubert med anti-dimetylert H3K9 antistoff eller anti-Chp1 antistoff (H3K9me2, Abcam nr. Ab1220 Og Chp1, Abcam nr. Ab18191), immobilisert på magnetiske Dynabeads, i 2 timer ved 4 °C. kulene og immobilisert protein ble vasket 5× med 1 ml lysisbuffer. Proteiner ble eluert ved inkubering med 150 µ elueringsbuffer (50 Mm Tris-HCl pH 8,0, 10 mM etylendiamintetraeddiksyre, 1% natriumdodecylsulfat) ved 65 °C i 15 min. Kryssforbindelser ble reversert ved inkubering ved 65 °c over natten etterfulgt av rna-degradering med RNase A og proteindegradering med Proteinase K. DNA ble deretter gjenfunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling og kvantifisert ved bruk av qPCR. Eukromatisk gen tdh1 ble brukt til normalisering. Oligonukleotider brukt i kromatinimmunopresipitasjonsanalyser er oppført I Supplementstabell S2.

Nukleosom in vitro rekonstituering og (H3K9me3) metylering

Nukleosomer ble rekonstituert ved Bruk Av Xenopus laevis histoner og 601-sekvensen som tidligere beskrevet . In vitro metylering ble gjort som beskrevet . Toppen på +42 Da har blitt observert i original publikasjon, og det er ikke en forurensning(Matt Simon, personlig kommunikasjon og beskrevet i).

In vitro Chp1CD–H3K9me3 Mla Nukleosomkompleks dannelse og eluering

totalt var 5 µ av Chp1CD bundet til 15 µ av Ni-NTA-harpiks i bindingsbuffer (20 MM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol) i 20 min ved 4 °C. Harpiksen ble vasket en gang med fem bindingsvolumer og 10 µ av h3k9me3 metyllysinanalog (mla) nukleosomer ble tilsatt (mla nukleosomer ble tidligere dialysert i bindingsbuffer) i et endelig volum på 20 µ og inkubert 1 time på is med konstant re-suspensjon hvert 5.minutt. Etter inkubasjon ble harpiksen sentrifugert (60 g for 10 s) og gjennomstrømningen samlet. Harpiksen ble deretter vasket tre ganger med fem volumer bindingsbuffer. Sumo-Chp1CD-H3K9me3Nucleosome-komplekset ble eluert ved å tilsette trombin (Sigma, Munich, Tyskland) i 2 timer på is i 20 µ bindingsbuffer. Kompleks formasjon ble deretter vurdert gjennom sds-polyakrylamidgelelektroforese på 15% akrylamidgeler og ved negativ flekk EM.

Chp1CD H3K9me3 peptidbindende analyser

totalt ble 1 µ Av-Histon H3 (1-21)-Ggk(Biotin) peptid (Eurogentec) inkubert med 15 µ av streptavidin agaroseharpiks (Invitrogen) i 20 MM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. Omtrent 5 µ Chp1CD (både wt og mutanter) ble deretter tilsatt i et endelig volum på 20 µ og inkubert i 1 time på is under de samme bufferforholdene. Harpiksen ble vasket tre ganger og deretter ble bindingseffektiviteten vurdert PÅ sds-polyakrylamidgelelektroforese på 15% akrylamidgeler. Kvantifisering av binding ble gjort ved Hjelp Av ImageJ programvare. Binding av hver mutant ble normalisert til wt Chp1CD for hver analyse.

Mikroskala termoforese (MST)

FOR MST SUMO tag ble fjernet Fra chp1cd konstruksjoner Med Ulp1 protease. Totalt ble 100 µ av villtype Og mutant Chp1CD fluorescent merket VED HJELP AV MO-L003 Monolith Protein Merking Kit BLUE – Nhs (Amine Reactive) i henhold til produsentens instruksjoner (Nanotemper Technologies, Munich, Tyskland). En 1: 1 Fluorescens: Protein ratio ble estimert ved Hjelp Av Nanodrop1000 programvare ‘Proteiner Og Etiketter’ funksjon og Hver Chp1 Chromodomain ble kjørt på en 15% sds akrylamid gel for å normalisere konsentrasjoner til 0,1 mg ml−1.

Reaksjoner ble samlet i 20 µ med 300 ng fluorescerende Chp1CD, og økende mengder-Histon H3 (1-21) – Ggk (Biotin) peptid (Eurogentec) eller H3k9me3nukleosomer, i en buffer inneholdende 10 Mm Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT og 0,05% Tween-20. For H3K9me3Nucleosomes-bindende analyser ble glyserol tilsatt til 10% endelig concentraksjon. For h3k9me3-analyser ble disse fortynningene brukt til målinger: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µ, 800 µ, 1.2 µ, 1.8 µ. For H3K9me3Nucleosome assay brukte vi følgende fortynninger til mål: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1.06 µ, 1.2 µ, 1.4 µ, 1.6 µ, 2.4 µ.

MST-løp ble utført ved bruk av standardbehandlede kapillærer (Nanotemper Cat#K002) på NT.115 Monolitt instrument. Alle målinger ble utført med 80% LED og 40% MST effekt, med 30 S Laser på tid og 5 S Laser Av tid. For hvert eksperiment ble det utført fem enkeltmålinger.

Data ble analysert med GraphPad Prism programvareversjon 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) Og SigmaPlot software versjon 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). For peptid-bindende analyser, med kurvene viser en distinkt sigmoid trend, vi montert Richards fem Parameter Logistisk Asymmetrisk Sigmoidal ligning og automatisk beregnet Kd. For H3K9me3Nucleosome-bindende analyser, som rå data trend var ikke lenger sigmoid for alle proteiner analysert, en tredje ordens polynom (kubikk) ligning ble brukt for montering og sammenligning av rådata poeng av vill-Type Chp1CD og de forskjellige mutanter. Kd ble beregnet basert på ‘Interpolering’ funksjon Av GraphPad prism programvare, ved hjelp av 50% bundet / ubundet verdi på y-aksen.

Nukleosom trypsinfordøyelse

Haleløse nukleosomer ble fremstilt ved å inkubere rekonstituerte nukleosomer med en immobilisert tpck-Trypsinharpiks (Termovitenskapelig) i 2 timer ved romtemperatur i en buffer som inneholder 20 MM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT . Den tryptiske fordøyelsen genererer svært definerte histonbånd, og det har blitt karakterisert i detalj hvor nøyaktig trypsin kutter .

Nukleosombindende analyser med Chp1CD-mutanter

chp1cd villtype og mutant nukleosombindende analyser ble utført som beskrevet tidligere for Chp1CD-H3KC9me3 Mla Nukleosomkompleksdannelse i 20 MM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM imidazol. Harpiks og Innganger ble kjørt PÅ SDS-polyakrylamid gel elektroforese 15% akrylamid geler. Alle prøver ble deretter analysert av immunoblot med anti – h3 histon (AbCam, Cambridge, UK, 1: 1000) Eller anti-h3k9me3 Antistoff (AbCam, 1: 1000), anti-geit IgG-HRP (BioRad, 1:3000) anti-kanin IgG-HRP (BioRad, Munich, Tyskland, 1:3000).

negativ flekkelektronmikroskopi

etter trombineluering ble 3 µ av chp1cd–H3KC9me3 nukleosomekomplekset oppdaget på et glødutladet kobberrutenett (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großö, Tyskland) belagt med en 1 nm karbonfilm i 45 s. etter en rask vask med vann ble rutenettet inkubert i 15 s i 2% av tilfellene.uranylacetat. Negative flekkbilder ble samlet på ET FEI Morgagni-transmisjonselektronmikroskop.

Cryo-EM På Chp1CD-H3KC9me3 nukleosomer kompleks

Cryo-EM nett (Holey karbon-belagt nett, Cu 300 Mesh R3/3+1 nm karbonlag, Quantifoil) ble fremstilt Ved Hjelp Av En Vitrobot Mark IV (Fei Selskap). Cryo-EM-data ble samlet inn ved Bruk Av Et Titan-Krios-transmisjonselektronmikroskop (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) ved 200 KeV og en forstørrelse på 113 000× ved flyet TIL CCD ved bruk Av Et F816 CMOS-kamera (TVIPS GmbH, Gauting, Tyskland), noe som resulterte i en bildepikselstørrelse på 1,2 Å per piksel på objektskalaen (pikselstørrelsen PÅ CCD var 13,6 µ). FOR automatisert datainnsamling BLE EM-TOOLS-programvaren brukt og data ble samlet inn i et defokusområde på 10 000-40 000 Å.

totalt ble 2 480 mikrografer for Chp1CD–H3KC9me3-komplekset og 991 mikrografer for h3kc9me3-nukleosomkontrollen valgt for enkeltpartikkelanalyse ved Hjelp Av xmipp-programvarepakken (Supplerende Figur S9A) . Få tusen partikler ble manuelt plukket og nøye rengjort fra støy. Disse partiklene ble deretter brukt til halvautomatisk og automatisk partikkelplukking I XMIPP. Kontrastoverføringsfunksjonen ble bestemt AV CTFFIND3 . Utvalgte enkeltpartikler ble konvertert til SPIDER og RELION formater for videre analyse (Supplerende Figur S9B). De todimensjonale klasse gjennomsnitt ble generert MED RELION programvarepakke (Supplerende Figur S9C). Dårlig klasse gjennomsnitt ble fjernet fra videre dataanalyse. De tredimensjonale forbedringer ble senere gjort MED SPIDER OG RELION programvarepakker .

Unsupervised partikkel klassifisering ble utført av tilfeldig seeding med komplett tetthet kart uten fokusert klassifisering I SPIDER programvarepakke. Forsøk på å bruke fokusert klassifisering resulterte i en sterk skjevhet og støy overfitting i regioner av interesse. Derfor brukte vi ikke fokusert klassifisering for å redusere bias. I første klassifisering gjort I SPIDER, klasser C0-C6 Og N0-N5 ble backprojected ved hjelp av vinkler Fra c0 og N0 kart og disse klassene ble ikke fullstendig raffinert. Her ville vi bare velge klasser som hadde ytterligere tetthet bundet til nukleosomet. Partikler som genererte kart med forskjellige Chp1CD-tettheter ble separert og videre klassifisert. Omtrent 20 runder med tilfeldige såingsklassifiseringer ble utført til vi har delt partikler i fem forskjellige grupper (Supplerende Figur S3). Klasser C11-C15 ble raffinert MED RELION programvarepakke. Endelige forbedringer Av Chp1CD-H3K9me3Nucleosome komplekser (C15 klasse) og Nucleosome kontroll ble gjort MED RELION programvarepakke. For endelig forfining ble referansen filtrert til ~50 Å (RELIONFILTER). Referansen vi brukte hadde ingen av funksjonene som ble observert i raffinerte rekonstruksjoner(DNA-dobbeltspiralen er ikke løst, større spor er ikke synlig, α-helices er ikke løst). Dette indikerer ingen referanse skjevhet i vår struktur. Oppløsningen av Nukleosomkontroll nådde 7,3 Å ved hjelp av automatisk raffinering I RELION og C2-symmetri(FSC 0,143 cutoff av to uavhengig raffinerte kart). Chp1CD-H3K9me3Nucleosome complex ble raffinert til 10 Å (FSC 0.143 cutoff av to uavhengig raffinerte kart) uten symmetri påført.

Lokal oppløsning ble beregnet Ved Hjelp Av ResMap-programvare(endelig enkeltvolum, minRes=7, maxRes=14, automask). Gjennomsnittlig oppløsning bestemt Av Resmap er 9.4 Å For Chp1CD-H3K9me3Nucleosome complex, som uavhengig bekrefter tidligere bestemt gjennomsnittlig oppløsning på 10 Å (FSC 0.143) (Figur 1c). For Chp1CD-H3K9me3Nucleosome kompleks er lokal oppløsning for nukleosom 9-10 Å og for liganden ~10 Å (Figur 2a). Euler vinkelfordeling for endelige rekonstruksjoner er vist for Både Nukleosom Og Chp1CD-H3K9me3Nucleosome kompleks (Supplerende Figur S9D). Alle orienteringer er til stede med en preferanse for topp-og sidevisninger.

Molekylære modeller ble bygget Ved Hjelp Av Chimera-programvarepakke ved hjelp av stiv kroppsmontering av krystallstrukturer . Passformen i tetthet ble gjort Med Chimera-alternativene ‘Fit In Map ‘og’ Fit In Segments ‘ med bare mindre manuelle justeringer. Segmentering og visualisering av alle cryo-EM kart ble gjort med Chimera programvare også .