Chimerismetesting brukes til rutinemessig dokumentasjon av engraftment og oppfølging etter transplantasjon av allogene transplantasjonsmottakere. Donor-og mottakerceller kan skilles ved å teste genetiske markører som bestemmes før transplantasjonen.2 i kjønns-feilaktige transplantasjoner når mottaker og donor er av forskjellig kjønn, bestemmes andelen kvinnelige og mannlige celler vanligvis ved analyse av kjønnskromosommarkører, oftest MED FISK.8,9 Vurdering av variabelt antall tandemrepetisjoner (VNTR) eller korte tandemrepetisjoner (STR) VED PCR har blitt DEN mest verdifulle metoden for bestemmelse av kimerisme i kjønnstilpassede transplantasjoner.10 Forskjellige metoder er utviklet for påvisning AV MRD. Morfologisk analyse av margen kan identifisere rest sykdom opptar mer enn 5% av marg plass og dermed mangler nødvendig følsomhet for tidlig deteksjon. Det er også ofte vanskelig å skille en liten leukemiblastpopulasjon fra normale donoravledede hematopoietiske blaster som repopulerer margen uten å bruke ekstra markører. Spesifikke tester kan oppdage MRD når DET er en spesifikk tumormarkør som en spesifikk cytogenetisk abnormitet, en spesifikk immunfenotype som kan identifiseres VED FACS, spesifikke DNA – eller RNA-sekvenser som kan forsterkes VED PCR eller et spesifikt vekstmønster i klonogene analyser. I fravær av en spesifikk tumormarkør FOR MRD, kan chimerism testing brukes til å oppdage mottakeravledede celler. Påvisning av mottakeravledede celler kan ikke alltid korrelere med risikoen for tilbakefall. Mottakerceller som bidrar til blandet kimerisme (MC) tilhører den ondartede klonen eller kan være normale hematopoietiske celler, eller til og med stromale celler. I løpet av de første ukene etter standard allogen transplantasjon kan mottakerceller fortsatt oppdages når sensitive tester brukes.9,11 Disse Er for det meste T-celler som overlever kondisjoneringsregimet. Vertsceller kan påvises ved lave nivåer (< 1%) selv senere i posttransplantasjonskurset. MC oppdages oftere etter ikke-myeloablativ kondisjonering.2 dermed er tumorspesifikke markørprober sannsynligvis overlegne og mer nøyaktige enn sex-mismatchprober for påvisning AV MRD.12 selv påvisning AV MRD med tumorspesifikke tester kan imidlertid ikke alltid være korrelert med risikoen for tilbakefall. Positive PCR-tester FOR BCR / ABL er rapportert hos friske individer.13 t-translokasjonen(14;18) ble påvist i andre linjer enn b-lymfocytter hos pasienter med non-Hodgkins lymfom.14 det kan være en terskel for AT MRD skal være klinisk signifikant. I flere sykdommer, SLIK SOM AML med t (8;21), 15 langvarige remisjoner er observert i NÆRVÆR AV MRD detektert AV PCR, mens I andre, som ved akutt promyelocytisk leukemi, PCR positivitet spår tilbakefall.16 igjen kan dette være relatert til følsomheten til DEN spesifikke PCR-testen og terskelen til klinisk signifikans. Residual maligne celler kan ha en sovende status17 mangler potensial til å bidra til tilbakefall, på grunn av mangel eller gevinst av en andre genetisk endring. I noen sykdommer kan partiell differensiering til mer modne celler forekomme, og disse cellene kan mangle potensialet til å proliferere. MRD kan være under immunovervåking, ELLER MRD-cellene er i en apoptotisk fase, noe som gjør dem irrelevante for tilbakefall av sykdom. De sensitive PCR-testene bevarer ikke cellulær morfologi, og det er derfor uklart hvilke celler som korrelerer MED MRD i disse forskjellige innstillingene.
Duet™ – systemet for kombinert samtidig morfologisk og cytogenetisk multiparametrisk analyse gir noen fordeler som kan bidra til å avsløre relevansen AV mrd-deteksjon. Dette systemet søker automatisk et stort antall celler (ca 150000 celler per lysbilde) for små cellulære undergrupper med unik cytogentisk eller immunfenotype. Følsomheten for påvisning av små populasjoner øker. I en serie fortynningsforsøk har vi vist at følsomheten for deteksjon av en hanncelle i en kvinnelig cellepopulasjon er høyere enn 1:50000, men på grunn av begrenset spesifisitet i denne titer, oppstår best deteksjon mellom 1: 10000 og 1:50000 (se vedlegg). Som sett i analysen av benmargsprøver fra pasient 1 (siste analyse) og pasient 2, kan Duet™ – systemet oppdage svært små populasjoner AV xy-mottakerceller som ikke oppdages av rutinemessig FISK. Den kvantitative nøyaktigheten AV FISK er avhengig av observert frekvens og antall celler scoret, og dermed forbedret ved å score flere celler.18 Scoring et så stort antall celler er ikke praktisk med manuell FISK, men Duet™ automatisk system kan skanne 10000 celler/min i lysfeltmikroskopi og 2000-10000 celler / t i fluorescerende mikroskopi, og dermed støtte behovet for rask og effektiv skanning og økt følsomhet.
Sensitive tester er ofte forbundet med redusert spesifisitet og en relativt høy falsk positiv rate. Med standard FISK kan falsk positiv scoring oppstå på grunn av ikke-spesifikk hybridisering av sonden. Falsk positiv scoring for kromosomale translokasjoner kan oppstå på grunn av tilfeldig romlig forening og optisk fusjon.18 Duet™ – systemet kan potensielt forbedre spesifisiteten ved å identifisere morfologien til cellene i populasjonen som er søkt. Påvisning AV FISK positivitet, i en liten populasjon, men med en jevn duet™ morfologisk utseende gjør det mer sannsynlig å være en sann positiv, enn når positive celler er spredt innenfor forskjellige, urelaterte linjer. Specificiteten av deteksjon AV MRD med uspesifikk chimerism testing kan også forbedres. Som nevnt ovenfor kan mottakerceller tilhøre den maligne klonen (som i pasient 1), kan være normale hematopoietiske celler (pasient 3, pasient 1 etter behandling MED STI571) eller ikke-hematopoietiske/stromale celler (som osteoblaster, pasient 2). Duet™ systemet tillater differensiering mellom disse alternativene ved morfologisk utseende. Vi har vist i analysen av pasient 1, og to andre pasienter (data ikke vist), at identifisering av mottakerkarakteristika (som cytogenetikk av motsatt kjønn) i blaster eller umodne celler forutsier utilslørt tilbakefall og går foran det med noen uker til noen måneder. I pasient 1 viste SEPARATE FISKEANALYSER en liten xy-mottakerpopulasjon (0,6%) og en liten BCR / ABL-positiv populasjon (0,8%) som begge kunne vurderes innenfor DEN falske positive frekvensen AV FISKEANALYSEN. Duet™ – systemet har imidlertid vist at en stor andel AV XY-mottakercellene var blaster (OG OGSÅ BCR/ABL positive ved en andre FISKETEST på de samme cellene) og dermed kunne forutsi at pasienten er bestemt til å komme tilbake. Identifisering av en liten mottakerpopulasjon i modne hematopoietiske celler kan ikke forutsi tilbakefall. Hos ytterligere tre pasienter (data ikke vist) har vi dokumentert kontinuerlig remisjon i nærvær av en liten mottakerpopulasjon med moden morfologi. Større studier med lengre oppfølging er nødvendig for å bekrefte sammenhengen mellom morfologi av gjenværende vertsceller og tilbakefallsrisiko hos pasienter uten andre unike markører for den ondartede klonen.
systemet er relativt enkelt å betjene, er for det meste automatisk, dets uttakstid og kostnader er sammenlignbare med andre systemer for chimerisme og MRD-deteksjon som standard FISK og PCR, og det kan være egnet for storskala testing. Annet enn systemets maskinvare og kits bare standard utstyr lett tilgjengelig i store laboratorier er nødvendig (se vedlegg).
de siste årene har studiet av kimerisme innenfor ulike cellulære undergrupper fått interesse og popularitet.19,20 Dette er av største betydning etter ikke-myeloablative transplantasjoner.2 noen grupper Har vist at fullstendig kimerisme i T-lymfocyttene er nødvendig for induksjon AV GVL, OG DERFOR KAN MC i denne cellulære undergruppen være forbundet med økt risiko for tilbakefall, spesielt av aggressive, raskt voksende maligniteter.2,19 Chimerism testing av cellulære undergrupper trenger tungvint og tidkrevende sortering av celler med det teoretiske potensialet til å miste noen celler under den prosessen. Som omtalt i vedlegget forårsaker ikke klargjøring av lysbilder for duet™ – analyse tap eller reduksjon av noen cellulær populasjon. Duet™ – systemet bruker mgg-farget lysbilde for å lokalisere lymfocytter og andre cellulære undergrupper, og kan også bruke immunocytokjemiske flekker (som anti-CD3 monoklonale antistoffer) for å lokalisere disse cellene. I en andre fase, FISK kan brukes for kimerisme testing i kjønn-umake transplantasjoner. Kasuspresentasjonen av pasient 3 viser hvordan systemet ble brukt til å følge kimerisme hos en pasient etter ikke-myeloablativ transplantasjon, og hvordan konvertering til fullstendig kimerisme etter syklosporinabstinens forutsa forekomsten AV gvhd-og GVT-responser.
denne rapporten fokuserer på bruk av Duet™ etter benmargstransplantasjon, men det kan være mange andre implikasjoner. Systemet kan også bidra til å studere cellene og linjene som har en unik cytogenetisk eller immunfenotypisk markør, som BCR/ABL-fusjon (som sett i pasient 1) og korrelere deres morfologi med tilbakefallsrisiko etter standard kjemoterapi. Det kan bidra til å avsløre arten AV MRD i forskjellige maligniteter og hvorfor MRD-deteksjon ikke alltid er prediktiv for tilbakefall. I visse innstillinger kan små donorcellepopulasjoner eller mikro-chimerisme søkes. For eksempel kan systemisk lymfohematopoietisk mikrochimerisme som oppdages etter solid organtransplantasjon forutsi toleranse for det transplanterte organet og lede den immunsuppressive behandlingen.21 små maternale populasjoner som forurenser allotransplantater kan også påvises på en lignende måte og kan ha implikasjoner på posttransplantasjonsrisiko for GVHD.
avslutningsvis, ved å legge til morfologisk analyse av små populasjoner av celler med malignitet eller mottakerassosierte markører, kan Duet™ – systemet forbedre nøyaktigheten av kimerisme og MRD-testing, og avgrense deres kliniske betydning. Dette systemet fortjener videre studier i større skala forsøk.