1.4.1 Homogeniseringsmedium
celleavbrudd utføres vanligvis i enten et litt hypo-osmotisk eller et iso-osmotisk medium for å bevare morfologisk integritet. Sukrose brukes ofte som et osmoticum for å forhindre subcellulære organeller eller vesikler fra uønsket hevelse eller krymping. Mannitol og sorbitol har også blitt brukt når sukrose har blitt funnet å forstyrre den biokjemiske analysen av den subcellulære komponenten. Sukrose foretrekkes fremfor saltløsninger fordi sistnevnte har en tendens til å aggregere subcellulære organeller. Hypo-osmotiske medier brukes ofte i isolering av plasmamembranfraksjoner fordi under disse forholdene gir forstyrrede celler plasmamembraner i form av store spøkelser eller ark. Dette reduserer signifikant den høye variasjonen i størrelsen på disse fragmentene før sentrifugering. Selv om homogeniseringsmediet vanligvis er vandig i naturen, har ikke-vandige medier som eter/kloroform blitt brukt til å isolere subcellulære organeller. Imidlertid kan ikke-vandige medier inaktivere noen enzymer og redusere morfologisk integritet i enkelte vev.
Chelateringsmidler (EDTA eller EGTA) kan tilsettes til homogeniseringsmediet for å fjerne divalente kationer, som Mg2+ Eller Ca2+ som kreves av membranproteaser. Det er viktig å merke seg at proteasehemmere fortsatt skal inkluderes i mediet fordi EDTA og tiolreagenser kan aktivere noen proteolytiske enzymer. Imidlertid krever mange membranmarkørenzymer disse kationene for aktivitet og kan hemmes etter at kationene er fjernet fra ekstraktet. Tilsetningen Av Mg2 + Eller Ca2 + til homogeniseringsmediet opprettholder kjerneintegritet. Imidlertid kan disse ionene forårsake membranaggregering og redusere respiratorisk kontroll i mitokondrier.
Celleforstyrrelse av plantevev frigjør ofte fenoler som kan ha flere skadelige effekter på planteenzymer. Plantefenolforbindelser består i hovedsak av to grupper: fenylpropanoidforbindelser (f.eks. hydrolyserbare tanniner) og flavonoider (f. eks. kondenserte tanniner). Fenolene kan hydrogenbinding med peptidbindinger av proteiner, eller gjennomgå oksidasjon av fenoloksidase til kinoner. Kinoner er kraftige oksidasjonsmidler som også har en tendens til å polymerisere og kondensere med reaktive grupper av proteiner for å danne et mørkt pigment kalt melanin som danner grunnlaget for bruningen av plantevev. Vedlegg av melanin til proteiner kan inaktivere mange enzymer. Fenoliske hydroksylgrupper kan danne ioniske interaksjoner med basiske aminosyrer av proteiner eller interagere hydrofobisk med hydrofobe regioner av proteiner. Derfor er det viktig å fjerne fenolforbindelsene så raskt som mulig, og dette oppnås best ved å bruke adsorbenter som binder seg til fenolene eller kinonene eller ved å bruke beskyttelsesmidler som borat, germanat, sulfitter og merkaptobenzotiazol som hemmer fenoloksidaseaktiviteten. Fenoladsorbenten polyvinylpyrrolidon i enten en vannløselig form eller som det høyt tverrbundne uoppløselige Produktet Polyclar kan tilsettes isolasjonsmediet. Polyvinylpyrrolidon binder de fenolforbindelsene som danner sterke hydrogenbindinger med proteiner. Bovint serumalbumin har også blitt rapportert å reagere med plantefenoler og er også en effektiv kinon-scavenger.
Celle-eller vevsfraksjonering utføres alltid ved +4°C for å redusere aktiviteten til membranproteaser. Proteaser kan deles inn i endopeptidaser og eksopeptidaser. Endopeptidaser, som er enzymer som spalter interne peptidbindinger, inkluderer: syreproteaser som har en ph optima på pH 2,5–3,8 og kan hemmes av overgangsstaten inhibitor pepstatin; serinproteaser som kan hemmes av diisopropylfluorofosfat og fenylmetylsulfonylfluorid; og sulfhydrylproteaser som hemmes Av N-etylmaleimid eller E-64(l-trans-epoksysuccinyl-leucylamid-butan). Eksempler på eksopeptidaser inkluderer karboksypeptidaser som finnes i de fleste plantevev og hydrolyserer lett De Fleste c-terminale aminosyrer. Alle plantekarboksypeptidaser som hittil er studert, hemmes av diisopropylfluorofosfat. Aminopeptidaser, dipeptidaser og tripeptidaser har også blitt identifisert i planter. Andre forbindelser som brukes i homogeniseringsmedier inkluderer disulfidreduserende midler som 2-merkaptoetanol, dithiothreitol, dithioerythritol, redusert glutation eller cystein. Dette skyldes at mange enzymer inneholder en viktig aktiv sulfhydrylgruppe som må forbli redusert for å opprettholde enzymaktiviteten. Mange av problemene med organellisolasjon er forbundet med brudd på de skjøre membranene, for eksempel tonoplasten som omgir vakuolen. Bortsett fra den fysiske ødeleggelsen av disse membranene, inneholder plantevev aktive lipolytiske enzymer som kan angripe lipidkomponentene i membraner direkte og forstyrre organeller. Frie fettsyrer frigjort av hydrolytisk virkning av acylhydrolaser kan hemme ATPase-aktiviteter av mitokondrier, kloroplast og plasmamembran. Andre skadelige effekter av fettsyrer er også godt etablert. Det er visse forhold som kan redusere lipidbrudd av lipaser og lipolytiske acylhydrolaser i planter. Disse inkluderer bruk av (1) et isolasjonsmedium med en pH på 7.5-8 hvor de fleste lipolytiske enzymer og lipooxygenaser utviser liten aktivitet, (2) chelateringsmidler som EDTA fordi Mange fosfolipaser er Ca2+ avhengige; mange lipolytiske enzymer er imidlertid upåvirket av chelateringsmidler og (3) andre tilsetningsstoffer som antioksidanter for å forhindre oksidativ nedbrytning av fettsyrehydroperoksider, disulfidreduserende midler, spesifikke enzymhemmere og bruk av fettsyrefri bovint serumalbumin som binder frie fettsyrer. Hvert enkelt homogeniseringsmedium er forskjellig og kan inneholde spesifikke hemmere for enzymer som fosfolipaser eller phos-phataser. Glyserol for eksempel blir ofte tilsatt til isolasjonsmediet for å hemme fosfatidinsyrefosfatase. Etanolamin og kolinklorid brukes ofte til å hemme fosfolipase D.
bufferkapasiteten til homogeniseringsmediet for plantecellefraksjonering må være høy for å kompensere for frigjøring av organiske syrer av den forstyrrede vakuolen som utgjør et betydelig volum av cellen. Homogeniseringsmediet kan enten formuleres ved empirisk evaluering eller ved rasjonell analyse. For eksempel, for å sikre at det relevante rensede proteinet forblir intakt, kan alle hovedhemmere av proteaser tilsettes homogeniseringsmediet eller alternativt kan fysiologiske løsninger kopieres. Siden cytoplasmatisk pH i plantecellen er rundt 7,5-8,0, bør homogeniseringsmediet gjenspeile cellens fysiologiske tilstand og derfor svakt bufret til cytoplasmatisk pH.