i denne videoen vil du observere hvordan du utfører kromfrigjøringsanalysen og bestemme det cytotoksiske potensialet til effektorcellene.
Immunceller er ansvarlige for å identifisere og fjerne potensielt skadelige celler, som kreft eller virusinfiserte celler, fra kroppen, som er en integrert del av immunresponsen. Flere immunceller, som T-celler og NK-celler, har en egenskap kjent som cytotoksisk potensial, som er evnen til å identifisere målceller og utskille proteiner som induserer proteindegradering, lysis og død av disse målcellene. Kvantifisering av cytotoksisk potensial er kritisk for måling av immuncelleaktivering og potens, og kromfrigjøringsanalysen brukes ofte til dette formålet.
denne metoden gjør det mulig for brukere å sammenligne cytoksisitet indusert av bestemte typer immunceller under forskjellige forhold, noe som er verdifullt for å studere kreftimmunterapi og immunitetsrelaterte sykdommer. Til å begynne med blir målcellene, som kreftceller, inkubert med en radioaktiv isotop, krom 51, som tas opp av cellene. Deretter blir disse radiomerkede cellene ko-kultivert med de isolerte immuncellene av interesse, også kalt effektorcellene, i en rundbunn, 96 – brønnplate for å lette samspillet mellom de to celletyper.
det samlede oppsettet av analysen innebærer å inkubere et bestemt antall målceller med forskjellige konsentrasjoner av immuncellene, sammen med passende kontroller. Medkulturen gjør det mulig for effektorcellene å indusere apoptose og lysis i målcellene, noe som resulterer i frigjøring av det intracellulære krom 51 i supernatanten. Deretter høstes supernatanten som inneholder det frigjorte krom, på et preoptimisert tidspunkt fra alle brønnene. Krom 51, som er radioaktivt, gjennomgår spontant radioaktivt henfall for å avgi gammastråling. Gammastrålingsnivåene i supernatantene fra alle brønnene i analyseplaten representerer en kvantifiserbar utgang av lysis av målcellene. Dette måles ved hjelp av en gamma-teller, som deretter brukes til å bestemme immuncellens cytotoksiske potensial.
for å begynne, blir målcellene, human melanomcellelinje WM793 i dette eksemplet, fremstilt i en enkeltcellesuspensjon. For å gjøre dette må du først fjerne mediet fra vevskulturkolben og vaske cellene med fem milliliter 1X PBS. Dekanter PBS og legg deretter en milliliter trypsin til platen i omtrent to minutter. Trykk forsiktig på kolben for å løsne cellene fra kolben overflaten og deretter legge fem milliliter RPMI media til kolben. Pipette media opp og ned for å samle cellene og legge denne suspensjonen til en 15 milliliter konisk rør.
Plasser røret i sentrifugen i fem minutter ved 1200 RPM. Deretter fjerner du media fra røret og sørger for ikke å forstyrre cellepellet. Forsiktig flick bunnen av røret for å forstyrre cellepellet og tilsett 10 milliliter media til røret. Deretter pipetter du forsiktig opp og ned for å bringe cellene i suspensjon. Deretter bestemmer du cellekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer og overfører to milliliter av den opprinnelige cellesuspensjonen til et nytt 15 milliliter konisk rør. Plasser røret i en sentrifuge og pellet cellene ved 12 hundre RPM i fem minutter. Etter sentrifugering, hell overflødig media ut av røret i en avfallsbeholder. Kort vortex røret for å resuspend cellepellet i det lille volumet av medium igjen.
forbered deg På Å bruke Chromium 51 Ved å flytte til et laboratorierom dedikert til denne spesielle radioaktiviteten. Det bør være rikelig blyskjerming for sikker lagring og bruk Av Krom 51 under alle trinn, samt riktig skilting for å indikere hvor prøver med Krom 51 holdes. En Geiger-teller utstyrt med en pannekake-sonde er også nødvendig for å tjene i rommet for mulig forurensning.
når det er satt opp for riktig bruk av radioaktivitet, legg til 100 mikrokurer Av Krom 51 direkte til målcellesuspensjonen. Deretter legger du til et lite stykke radioaktivt tape til røret for å indikere at prøven og røret nå er radioaktive. Plasser røret i en 37 grader celsius inkubator med en bly skjold og inkubere i en time, flicking røret hver 15 til 20 minutter.
mens målcellene merker, forbereder du en enkeltcellesuspensjon av effektorceller. I dette eksemplet ble humane perifere blodmono kjerneceller, Eller PDMCs, isolert fra fullblod ved standard tetthetsgradientsentrifugering til en konsentrasjon på 5 ganger 10 til 6. Overfør denne effektorcellesuspensjonen til et engangs reagensreservoar og tilsett deretter 200 mikroliter av denne suspensjonen i hver brønn i rad B i en 96-brønns rundbunnsplate. Deretter legger du til 100 mikroliter RPMI til hver brønn I rad C Til G på platen.
nå begynner du å utføre serielle fortynninger Av Pbmcene for å ha en rekke effektorcellenumre ved først å fjerne 100 mikroliter av cellene i brønnene I rad B og legge til dette i rad C. deretter fortynner effektorcellene ytterligere ved å overføre 100 mikroliter celler Fra Rad C Til Rad D. Fortsett seriell fortynning. Når rad G er nådd, flytt 100 mikroliter fra brønnene for å legge et endelig volum på 100 mikroliter i hver brønn i den raden. Deretter legger du til 100 mikroliter av vevskulturmedium til brønnene I rad A for å tjene som en kontroll for spontan frigjøring Av Krom 51 fra målcellene, da ingen effektorceller skal legges til denne raden. Deretter plasserer du en plate i en 37 graders celsius inkubator til målcellene er klare til å bli tilsatt.
etter inkubasjonsperioden, fjern målcellene fra inkubatoren og vask med 5 ml FBS for å fjerne overflødig Krom 51. Plasser deretter røret i en utpekt sentrifuge og spinn ved 1200 rpm i 5 minutter. Fjern den radioaktive fbs-vasken i en passende avfallsbeholder og gjenta vasketrinnet ved å resuspendere pellet i en frisk 5 ml FBS. Plasser røret i en utpekt sentrifuge og spinn cellene igjen ved 1200 rpm i 5 minutter. Fjern den andre vasken og kontroller pellet for innlemmet radioaktivitet ved hjelp Av En Geiger-teller. Til slutt Resuspend pelleten i 10 ml komplett medium og hell Den Krom 51-merkede målcellesuspensjonen i et engangs reagensreservoar. Deretter legger du til 100 mikroliter av disse merkede målcellene i hver brønn på 96-brønnseffektorcelleplaten. Deretter legger du til 100 mikroliter av 1% NP – 40 i vann til brønnene I rad H for å lyse alle målcellene denne hver rad. Disse brønnene vil bli brukt som en kontroll for å bestemme de totale teller per minutt, eller cpm.
nå som platen er forberedt, fest lokket ved å legge til et lite stykke tape på hver side av platen og legg et stykke radioaktivt tape på lokket for å indikere at det inneholder krom 51. Deretter plasserer platen i en sentrifuge merket for å håndtere radioaktive prøver. Hvis bare en eksperimentell plate blir brukt, legg til en balanseplate til sentrifugen. Sett sentrifugen til 1200 rpm, og ta platen opp til hastighet. En gang i hastigheten, stopp maskinen. Fjern platen fra sentrifugen. Deretter plasserer platen i en 37 grader celsius inkubator med et lite stykke bly skjerming over platen for ekstra sikkerhet. Inkuber i 16 timer for å la målcellene lyse.
på slutten av inkubasjonsperioden, fjern forsiktig båndet rundt kanten av platen, og fjern lokket. Deretter plasserer du høstrammen på platen og sørger for å bekrefte at de små filterskivene er på plass for hver av bomullspluggene. Nå, trykk sakte og forsiktig på bomullspluggene i brønnene. Etter omtrent ti sekunder, slipp trykket på bomullspluggene, og overfør deretter bomullspluggene til rørstrimler. Plasser hvert av disse rørene i et sekundært FACS-rør. Til slutt laster DU FACS-rørene på en gamma-teller og kjører prøvene for å kvantifisere mengden krom 51 som frigjøres i hver tilstand. Ta forsiktig opp rekkefølgen der rørene ble lastet inn i disken.
her ble ustimulerte Pbmcer lagt til de første 3 banene og CPG-stimulerte Pmbcer ble lagt til baner 4 til 6. I dette eksemplet ble tellingene per minutt lagt inn i cellene i et regneark på samme måte som prøvene ble lagt ut i den opprinnelige platen, og gjennomsnittet av triplikatene ble beregnet. For den første betingelsen var for eksempel cellene A1, A2 og A3 i gjennomsnitt i celle I3. Når gjennomsnittene er bestemt, kan prosentandelen av spesifikk lysis for hver tilstand beregnes ved hjelp av denne formelen. For eksempel, for å beregne prosentspesifikk lysis for de ustimulerte cellene som hadde et forhold på 50 til 1 effektorceller til målceller, ble spontan CPM, som i dette eksemplet er 1164,67, trukket fra eksperimentell CPM, 1129. 67. Dette tallet kan da deles med forskjellen mellom maksimal CPM og spontan CPM, og deretter multiplisert med 100 for å gi prosentspesifikk lysis. Dette beregnes deretter for hver tilstand. Disse dataene kan deretter tegnes for å vise sammenligning Av E – t-forholdet med prosentspesifikk lysis for både de ustimulerte Pbmc – ene og DE CPG-stimulerte Pbmc-ene. I dette eksemplet drepte effektorceller stimulert med CPG mer effektivt målceller da forholdet mellom effektorceller og målceller økte. Denne økningen ble ikke observert i de ustimulerte Pbmc-ene, noe som indikerer AT CPG-stimulering er nødvendig for den observerte økningen i målcellelyse.