Tests simplifiés ChIP-exo

Anticorps

Des IgG de lapin (Sigma) conjuguées à des Dynabeads ont été utilisées contre des souches marquées par TAP dans lesquelles l’étiquette TAP contenant la protéine A était la cible. L’anticorps Millipore 07-729 a été utilisé contre des échantillons K562 ciblant le CTCF.

Purification du Tn5

Une construction personnalisée de Tn5 E54K E110K P242A L372P14 dans un vecteur pET-45b (+) a été commandée (GenScript) pour exprimer le Tn5 hyperactif avec une balise His6 à N terminaux. Le plasmide est disponible chez Addgene (Addgene ID: 112112). Des cellules d’E. coli compétentes en BL21 (DE3) (Biolabs de la Nouvelle-Angleterre) ont été transformées et une seule colonie a été cultivée à 37 °C à une OD600 de 0,4 dans 500 ml de LB + 50 µg/ml d’ampicilline + 30 µg/ml de chloramphénicol. Les cellules ont été transférées dans un incubateur à 25 ° C et induites avec de l’isopropyl-β-D-galactopyranoside de 0,5 mM pendant 4 h. Les cellules ont été collectées par centrifugation, lavées une fois avec du tampon ST et la pastille cellulaire a été congelée à l’éclair dans de l’azote liquide.

Le Tn5 a été purifié comme décrit précédemment 10, avec peu de modifications. Brièvement, les cellules ont été remises en suspension dans 10 volumes (ml / g) de Tampon TEGX100 (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, glycérol 10%, Triton-X 100 0,1%) contenant du CPI et du fluorure de phénylméthylsulfonyle 100 µM et lysées par incubation avec du lysozyme (Sigma; 1 mg / 1 g de culot cellulaire) à température ambiante pendant 30 min. Le lysat a été centrifugé à 20 000 ×g pendant 20 min à 4 °C, et le surnageant a été précipité avec de la polyéthylèneimine (Sigma) à 0,25% et centrifugé à 10 000 × g pendant 15 min. Le surnageant a ensuite été précipité avec du sulfate d’ammonium saturé à 47% (0.28 g/ml) sur une incubation de 30 min, puis centrifugé à 20 000 × g pendant 15 min.

Le culot a ensuite été remis en suspension dans 50 ml de Tampon de Charge d’Affinité de nickel (phosphate de potassium 50 mM, pH 7,4, KCl 50 mM, glycérol 20%) et chargé sur une colonne HisTrap HP (GE Healthcare; 5 ml) à 1,5 ml/min équilibrée avec le même tampon. La colonne a été lavée séquentiellement avec du Tampon de lavage I (phosphate de potassium 50 mM, pH 7,4, 1 M KCl, imidazole 50 mM, glycérol 20%), du Tampon de lavage II (phosphate de potassium 50 mM, pH 7.4, 500 mm KCl, 50 mm imidazole, 20% de glycérol), puis le Tn5 a été élué avec du Tampon d’élution d’affinité de nickel (phosphate de potassium 50 mM, pH 7,4, KCl 500 mM, imidazole 500 mM, glycérol 20%) à 2 ml / min. L’éluat a été dilué à 300 mm KCl avec du Tampon de dilution (phosphate de potassium 50 mM, pH 7,4, glycérol 20%), et le volume final ajusté à 50 ml avec du Tampon TEGX300 (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 300 mm, EDTA 1 mM, glycérol 10%, Triton-X 100 0,1%).

Ensuite, l’échantillon a été chargé sur une colonne HiTrap Héparine HP (GE Healthcare; 1 ml) équilibrée avec TEGX300 à 1 ml/min. Après lavage avec 5 volumes de colonne de tampon, un gradient de NaCl linéaire de 10 ml (300 mM à 1,2 M) a été exécuté pour éluer. Tn5 élué de la colonne à environ 600 mm de NaCl. Des fractions contenant le pic d’élution principal ont été combinées (3,5 ml) et dialysées pendant une nuit contre un Tampon TEGX300 contenant 30% de glycérol, puis stockées à -80 °C.

Préparation de chromatine de levure

Des souches Saccharomyces cerevisiae (Biosystèmes ouverts) marquées au ROBINET ont été cultivées dans 500 ml de milieu dextrose peptonique de levure jusqu’à un OD600 = 0,8 à 25 °C. Les cellules ont été réticulées avec du formaldéhyde à une concentration finale de 1% pendant 15 min à température ambiante, et trempées avec une concentration finale de 125 mM de glycine pendant 5 min. Les cellules ont été collectées par centrifugation, lavées dans 1 ml de tampon ST (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM) à 4 °C et divisées en deux aliquotes. Les cellules ont été à nouveau granulées, le surnageant a été retiré et la pastille a été congelée à l’éclair.

Une aliquote de culture de 250 ml a été lysée dans 750 µl de Tampon de Lyse FA (Hepes-KOH 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mm, EDTA 2 mM, Triton 1%, 0.1% de désoxycholate de sodium, et CPI) et 1 ml de volume de billes de zircone / silice de 0,5 mm par battement de billes dans une machine Mini-Beadbeater-96 (Biospec) pendant trois cycles de cycles de 3 min on / 5 min off (Les échantillons ont été conservés sur de la glace pendant le cycle off). Le lysat a été transféré dans un nouveau tube et microcentrifugé à vitesse maximale pendant 3 min à 4 °C pour granuler la chromatine. Le surnageant a été éliminé, et le culot a été remis en suspension dans 750 µl de tampon de lyse de FA additionné de SDS à 0,1% et transféré dans un tube conique en polystyrène de 15 ml. L’échantillon a ensuite été soniqué dans un Biorupteur (Diagénode) pendant 15 cycles avec des intervalles marche/arrêt de 30 s pour obtenir des fragments d’ADN de 100 à 500 pb. Un test ChIP-exo a traité l’équivalent de 50 ml de culture cellulaire (~ 6 × 108 cellules). Cela représente un montant pratique plutôt qu’un montant minimum nécessaire.

Préparation de chromatine K562

Les cellules de leucémie myéloïde chronique humaine (K562, ATCC) ont été maintenues entre 1 × 105 et 1 × 106 cellules/ml dans un milieu DMEM additionné de sérum fœtal bovin à 10% à 37 °C avec 5% de CO2. Les cellules ont été lavées avec du PBS (8 mm Na2HPO4, 2 mm KH2PO4, 150 mm NaCl et 2,7 mm KCl), puis réticulées avec du formaldéhyde à une concentration finale de 1% pendant 10 min à température ambiante, et trempées avec une concentration finale de 125 mM glycine pendant 5 min. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS pour être lavées. Les cellules ont été aliquotées pour contenir 100 millions de cellules, centrifugées, le surnageant a été éliminé et la pastille a été surgelée.

Une aliquote de 100 millions de cellules (pour une utilisation dans plusieurs puces) a été lysée dans 500 µl (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 10 mM, 0.5% de NP40, et inhibiteur complet de protéase (CPI, Roche)) par incubation sur glace pendant 10 min. Le lysat a été microcentrifugé à 2500 tr/min pendant 5 min à 4 °C. Le surnageant a été éliminé, le culot remis en suspension dans 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mm EDTA, 0,32% SDS et CPI), et incubé sur glace pendant 10 min pour lyser les noyaux. L’échantillon a été dilué avec 600 µl de tampon de dilution d’immunoprécipitation (Tampon de dilution IP: Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, NaCl 150 mm, Triton X-100 à 1% et CPI) à une concentration finale de (Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, EDTA 7 mM, NaCl 56 mM, Triton-X 100 à 0,4%, 0.2% SDS, et CPI), et soniqué avec un Biorupteur (Diagénode) pendant 10 cycles avec des intervalles marche/arrêt de 30 s pour obtenir des fragments d’ADN de 100 à 500 pb.

Préparation de tissus de souris

Des tissus de souris mâles adultes de 16 semaines du cerveau, des poumons, du foie et des reins ont été généreusement fournis par le Dr Yanming Wang Les tissus de souris ont été traités à 100 mg et la chromatine a été générée comme décrit précédemment 21 avec des modifications mineures. En bref, 100 mg de tissu de souris ont été hachés en morceaux sur de la glace, fixés avec du formaldéhyde à 1% pendant 10 min, puis trempés avec une concentration finale de glycine de 125 mM pendant 5 min. Les cellules ont été filées, lavées avec du PBS, puis remises en suspension dans 1 mL de tampon de lyse cellulaire de Farnham à froid (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 85 mm, NP-40 0,5%, Triton X-100 0,5% et CPI). Les cellules ont ensuite été incubées sur un rototorque pendant 20 min à 4 C. Les noyaux isolés ont été isolés par filage et remis en suspension dans du tampon de lyse nucléaire RIPA (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% NaDéoxycholate, 0,5% SDS et CPI). Les noyaux ont ensuite été soniqués avec un Biorupteur (Diagénode) pendant 10 cycles avec des intervalles de marche / arrêt de 30 s pour générer de l’ADN dans la plage de taille de 100 à 500 pb. Le nombre de cellules hépatiques a été estimé comme décrit précédemment 22, en utilisant un facteur de conversion de 1 mg de poids humide de tissu égal à ~ 250 000 cellules.

Immunoprécipitation à la chromatine

Un équivalent de culture de 50 ml de levure ou 10 millions d’équivalents de cellules de chromatine K562 a été dilué à 200 µl avec un tampon de dilution IP et incubé pendant une nuit à 4 °C avec l’anticorps approprié. Un volume de lit de 10 µl d’IgG-Dynabeads a été ajouté aux échantillons de levure; et 3 µg d’anticorps anti-CTCF avec une suspension de 10 µl – équivalent de la protéine A Mag Sepharose (GE Healthcare) ont été ajoutés aux échantillons K562.

ChIP-exo 1.1

ChIP-exo 1.1 a été réalisée comme précédemment décrit7,8, 23. En bref, les étapes enzymatiques suivantes ont été réalisées avec de la chromatine immunoprécipitée encore sur la résine avec de multiples lavages au sel entre chaque étape: Polissage d’extrémité de l’ADN polymérase T4, polynucléotide kinase T4, tailing du fragment A de Klenow, ligature de l’adaptateur Read_2 médiée par l’ADN ligase T4, remplissage de l’ADN polymérase phi29, deuxième polynucléotide kinase T4, digestion de l’exonucléase lambda et digestion de l’exonucléase RecJf. Après une réticulation inverse pendant la nuit et un traitement par Protéinase K, les étapes suivantes ont été réalisées en solution : extension de l’amorce phi29, second fragment de Klenow A-tailing, ligature de l’adaptateur Read_1 médiée par l’ADN ligase T4 et PCR.

Puce – exo 3.0 et 3.1 (version à base de tagmentation)

Après immunoprécipitation, les étapes suivantes ont été réalisées sur la résine. Pour assembler la Transposase, le Tn5 a été incubé dans un Mélange 10 × Transposase contenant les composants suivants et incubé pendant 30 min à température ambiante : Tn5 de 12,5 µM, glycérol à 50% et adaptateur de 7,5 µM (comp NexA2/ME). Voir le tableau supplémentaire 1 pour les séquences oligonucléotidiques utilisées dans cette étude.

Le matériau de la PuCE sur résine a été lavé séquentiellement avec du Tampon de Lyse FA, du Tampon NaCl (50 mm HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mm NaCl, 2 Mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% de désoxycholate de sodium), Un Tampon LiCl (100 mm de Tris-HCl, pH 8,0, 500 mm de LiCl, 1% de NP-40, 1% de désoxycholate de sodium) et 10 mm de Tris-HCl, pH 8,0 à 4 ° C.

La réaction de tagmentation (30 µl) contenant: 20 mm de Tris-HCl, pH 7,5, 5 mm de MgCl2, 10% de diméthylformamide et 1 × Le mélange de tagmentation de l’étape 1 (concentration finale : Tn5 1,25 µM, glycérol 5%, adaptateur 750 nM) a été incubé pendant 30 min à 37 °C. Après incubation, la résine a été lavée deux fois avec du Tampon chlorhydrate de Guanidine (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, chlorhydrate de guanidine 500 mm, EDTA 2 mm, Triton-X 100,0 1%.1% de désoxycholate de sodium) pendant 5 min à 37 °C, puis une fois avec du Tampon LiCl et du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C.

La réaction de remplissage (30 µl) contenant : 10 U phi29 polymérase (NEB), 1 × phi29 tampon de réaction (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA et 165 µM dNTPs a été incubée pendant 20 min à 30 La réaction kinase (30 µl) contenant : 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 Tampon ADN Ligase (NEB), et 2 × BSA a été incubée pendant 15 min à 37 °C ; puis lavée avec 10 mM T4 PNK (NEB), pH 8,0 à 4 °C. La digestion de l’exonucléase λ (100 µl) contenant :: 20 U λ exonucléase (NEB), 1 × λ tampon de réaction d’exonucléase (NEB), 0,1% de Triton-X 100 et 5% de DMSO ont été incubés pendant 30 min à 37 °C; puis lavés avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C. La digestion de l’exonucléase RecJf (100 µl) contenant : 75 U RECJF exonucléase (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0,1% de Triton-X Du DMSO à 100 et 5% a été incubé pendant 30 min à 37 ° C; puis lavé avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C.

De l’ADN a été élué de la résine, et une réticulation inverse et un traitement par Protéinase K ont été effectués (40 µl) contenant : 30 µg de Protéinase K, Tris-HCl 25 mM, pH 7.5, 2 mm EDTA, 200 mm NaCl et 0,5% SDS incubés pendant 16 h à 65 °C. Le surnageant a ensuite été transféré dans un nouveau tube et purifié avec des billes magnétiques d’ampure Agencourt (Beckman Coulter) suivant les instructions du fabricant et en utilisant 1,8 × volume de suspension d’AMPure ajouté au volume d’ADN (72 µl).L’échantillon a été élué à partir des billes d’AMPure dans 10 µl d’eau, et les étapes enzymatiques suivantes ont été réalisées en solution.

Ligature de l’adaptateur (version 3.0) : pour la réaction d’extension de l’amorce (volume de réaction total 20 µl); a l’échantillon remis en suspension a été ajouté 1 × tampon réactionnel phi29, 2 × BSA, un oligonucléotide de séquence dNTPs 100 µM et 0,5 µM ME (total 9 µl) et incubé pendant 5 min à 95 °C, puis 10 min à 45 °C pour laisser le temps oligo de recuire. L’échantillon a été déplacé à 30 °C avant d’ajouter de la polymérase 10 U phi29 (1 µl) et d’incuber pendant 20 min à 30 °C ; puis pendant 10 min à 65 °C pour s’inactiver, et décalé à 37 °C

Pour la réaction de résidus A (volume de réaction total 30 µl); à la réaction d’extension de l’amorce a été ajouté 10 U Fragment de Klenow, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (total 10 µl) et incubé pendant 30 min à 37 ° C, puis pendant 20 min à 75 ° C pour s’inactiver, et décalé à 25 ° C Pour la deuxième réaction de ligature de l’adaptateur (volume de réaction total 40 µl); à la réaction de queue A a été ajouté 2 000 U T4 ADN ligase (enzymatiques), 1 × Tampon de ligature rapide NEBNext (NEB), adaptateur 375 nM (ExA1-58/13) et incubé pendant 1 h à 25 °C.

Ligature d’attelle (version 3.1) : pour ligature d’adaptateur (40 µl); a l’ADN remis en suspension a été ajouté 1200 U T4 ADN ligase, Tampon 1 × T4 ADN Ligase, adaptateur 375 nM (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) et incubé pendant 1 h à 25 °C

versions 3.0 et 3.1 : la réaction de ligature a ensuite été purifiée avec des billes d’AMPure et remise en suspension dans 15 µl d’eau. L’échantillon a ensuite été amplifié par PCR. Pour l’amplification par PCR (volume de réaction total 40 µl); à l’ADN remis en suspension a été ajouté 2 U de polymérase de démarrage à chaud de Phusion (Thermo scientific), 1 × Tampon HF de Phusion (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM chaque amorce (P1.3 et NexA2-iNN) et amplifié pendant 18 cycles (20 s à dénature à 98 °C, 1 min à recuit à 52 °C et 1 min à extension à 72 °C). Un quart de la réaction a été amplifié pendant six cycles supplémentaires (24 au total) et la présence de banques a été déterminée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2%.

Sélection de taille: 200-500 pb Les produits PCR ont été purifiés sur gel à partir d’un gel d’agarose à 2% à l’aide du kit d’extraction de gel QIAquick (Qiagen).

ChIP-exo 4.0 et 4.1 (versions de ligature d’ADN simple brin)

Après immunoprécipitation, les étapes suivantes ont été réalisées sur la résine. Le matériau de la PuCE sur résine a été lavé séquentiellement avec du Tampon de Lyse FA, du Tampon NaCl, du Tampon LiCl et du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 ° C. La réaction de réparation finale (50 µl) contenant: 7,5 U T4 ADN polymérase (NEB), 2,5 U ADN Polymérase I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 ADN Ligase Tampon et 390 µM dNTPs a été incubée pendant 30 min à 12 ° C; puis lavée avec 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 à 4 °C. La digestion de l’exonucléase λ (100 µl) contenant : 20 U λ exonucléase, tampon réactionnel d’exonucléase 1 × λ, 0,1% de Triton-X 100 et 5% de DMSO a été incubée pendant 30 min à 37 °C ; puis lavée avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8.0 à 4 °C. La digestion de l’exonucléase RecJf (100 µl) contenant : 75 U d’exonucléase RecJf, 2 × NEBuffer 2, 0,1% de Triton-X 100 et 5% de DMSO swas incubée pendant 30 min à 37 °C ; puis lavée avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C.

Première ligature de l’adaptateur : ligature de l’adNSS (version 4.0, 40 µl ): pour la ligature de l’adaptateur, 1200 U T4 ADN ligase, tampon 1 × T4 ADN Ligase, et adaptateur simple brin 375 nM (ExA1-58-N5) ont été incubés pendant 1 h à 25 °C; puis lavés avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C.

Ligature d’attelle (version 4.1, 40 µl): L’ADN ligase 1200 U T4, le Tampon ADN Ligase 1 × T4 et l’adaptateur 375 nM (ExA2.1-N5 / ExA2.1-20) ont été incubés pendant 1 h à 25 ° C; puis lavés avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C.

Versions 4.0 et 4.1: L’ADN a été élué de la résine, et une réticulation inverse et un traitement par Protéinase K ont été effectués (40 µl ) contenant : 30 µg de Protéinase K, 25 mm de Tris-HCl, pH 7,5, 2 mm d’EDTA, 200 mm de NaCl et 0,5% de SDS incubés pendant 16 h à 65 °C.

Le surnageant a ensuite été transféré dans un nouveau tube et purifié avec des billes magnétiques d’Ampure Agencourt (Coulter Beckman) suivant les instructions du fabricant (volume 1,8 ×). L’échantillon a été élué à partir des billes d’AMPure dans 20 µl d’eau, et les étapes enzymatiques suivantes ont été réalisées en solution.

Deuxième ligature de l’adaptateur : Ligature de l’ADN ssDNA (version 4.0, volume total de réaction 40 µl) : à l’ADN remis en suspension a été ajouté 1200 U T4 ADN ligase, Tampon 1 × T4 ADN Ligase, adaptateur 375 nM (ExA2.1-N5 / ExA2.1-20) et a été incubé pendant 1 h à 25 °C.

Ligature de l’adaptateur d’attelle (version 4.1, volume total de réaction 40 µl) : à l’ADN remis en suspension a été ajouté 1200 U T4 ADN ligase, Tampon 1 × T4 ADN Ligase, adaptateur 375 nM (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) et a été incubé pendant 1 h à 25 °C.

Versions 4.0 et 4.1 : la réaction de ligature a ensuite été purifiée avec des perles d’ampure (1,8 × volume) et remis en suspension dans 15 µl d’eau. L’échantillon a ensuite été amplifié par PCR. Pour l’amplification par PCR (volume de réaction total 40 µl); a l’ADN remis en suspension a été ajouté 2 U polymérase de Démarrage à Chaud de Phusion (Thermo scientific), 1 × Tampon HF de Phusion (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM chaque amorce (P1.3 et NexA2-iNN) et amplifié pendant 18 cycles (20 s à dénature à 98 ° C, 1 min à recuit à 52 °C, 1 min à extension à 72 ° C). Un quart de la réaction a été amplifié pendant six cycles supplémentaires (24 au total) et la présence de banques a été déterminée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2%. Sélection de la taille: Les produits PCR de 200 à 500 pb ont été purifiés sur gel à partir d’un gel d’agarose à 2% à l’aide du kit d’extraction de gel QIAquick (Qiagen).

Remarque: ChIP-exo 4.0 / 4.1 a incorporé un adaptateur universel Read_2, avec le code à barres ajouté plus tard pendant la PCR avec de longues amorces. Chaque fois que de longues amorces de PCR étaient utilisées dans une construction de bibliothèque impliquant une digestion par exonucléase lambda, les bibliothèques souffraient d’un faible rendement et de dimères d’adaptateur élevés. Nous n’utilisons plus que des adaptateurs pleine longueur et des amorces PCR de longueur minimale.

ChIP-exo 5.0

Après immunoprécipitation, les étapes suivantes ont été réalisées sur la résine. Le matériau de la PuCE sur résine a été lavé séquentiellement avec du Tampon de Lyse FA, du Tampon NaCl, du Tampon LiCl et du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 ° C Pour la réaction de résidus A (50 µl) contenant : Fragment de Klenow 15 U, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2 et dATP 100 µM a été incubé pendant 30 min à 37 ° C; puis lavé avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C. La première ligation de l’adaptateur et des réactions kinases (45 µl) contenant : 1200 U T4 d’ADN ligase, 10 U T4 PNK, 1 × Tampon de Ligation Rapide NEBNext et adaptateur 375 nM (ExA2_iNN/ExA2B) ont été incubées pendant 1 h à 25 °C; puis lavées avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C. La réaction de remplissage (40 µl) contenant : 10 U phi29 polymérase, 1 × phi29 tampon réactionnel, 2 × BSA, et 180 µM dNTPs a été incubée pendant 20 min à 30 °C ; puis lavée avec du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 à 4 °C. La digestion de l’exonucléase λ (50 µl) contenant : 10 U λ exonucléase, 1 × λ exonucléase tampon réactionnel, 0,1% Triton-X 100, et Du DMSO à 5% a été incubé pendant 30 min à 37 °C; puis lavé avec du Tris-HCl de 10 mM, pH 8,0 à 4 °C.

De l’ADN a été élué de la résine, et une réticulation inverse et un traitement à la protéinase K ont été effectués (40 µl) contenant: 30 µg de Protéinase K, 25 mm de Tris-HCl, pH 7,5, 2 mm d’EDTA, 200 mm de NaCl et 0,5% de SDS incubés pendant 16 h à 65 °C. Le surnageant a ensuite été transféré dans un nouveau tube et purifié avec des billes magnétiques d’ampure Agencourt (Beckman Coulter) suivant les instructions du fabricant (volume 1,8 ×).L’échantillon a été élué à partir des billes d’AMPure dans 20 µl d’eau, et les étapes enzymatiques suivantes ont été réalisées en solution. Pour la ligature du second adaptateur (volume de réaction total 40 µl): a l’ADN remis en suspension a été ajouté 1200 U T4 ADN ligase, Tampon 1 × T4 ADN Ligase, adaptateur 375 nM (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) et a été incubé pendant 1 h à 25 °C. La réaction de ligature a ensuite été purifiée avec des billes d’AMPure (1,8 × volume) et remise en suspension dans 15 µl d’eau.

L’échantillon a ensuite été amplifié par PCR. Pour l’amplification par PCR (volume de réaction total 40 µl); à l’ADN remis en suspension a été ajouté 2 U polymérase de Démarrage à chaud de Phusion (Thermo scientific), 1 × Tampon HF de Phusion (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM chaque amorce (P1.3 et P2.1) et amplifié pendant 18 cycles (20 s à dénature à 98 °C, 1 min à recuit à 52 °C, 1 min à extension à 72 °C). Un quart de la réaction a été amplifié pendant six cycles supplémentaires (24 au total) et la présence de banques a été déterminée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2%. Sélection de la taille: Les produits PCR de 200 à 500 pb ont été purifiés sur gel à partir d’un gel d’agarose à 2% à l’aide du kit d’extraction de gel QIAquick (Qiagen).

Remarque: nous avons constaté que l’utilisation d’une méthode autre que la purification par gel à ce stade conduit à un niveau inacceptable de dimères adaptateurs dans l’échantillon final. La purification par gel peut séparer efficacement le dimère de l’adaptateur (fragment de 150 pb) et les fragments plus petits de la bibliothèque ChIP-exo (fragment de 200 pb = adaptateurs de 150 pb + insert de 50 pb).

Séquençage de l’ADN

Un séquençage de l’ADN à haut débit a été effectué avec un NextSeq 500 en mode d’extrémité appariée produisant des lectures de 2 × 40 pb. Les lectures de séquences ont ensuite été alignées sur les génomes de levure (sacCer3) et humain (hg19) en utilisant bwa-mem(v0.7.9 a)24. Les lectures alignées ont été filtrées pour supprimer les alignements non uniques et les doublons PCR. Les doublons PCR ont été définis comme des lectures de séquences possédant des séquences Read_1 et Read_2 identiques.

Disponibilité des données

Tous les fichiers de séquençage et les fichiers de pics de cette étude sont disponibles chez NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sous les numéros d’accession GSE110681 et GSE114606. Les fichiers de coordonnées, les paramètres de script et le code personnalisé utilisés pour générer les chiffres de ce document peuvent être téléchargés à partir de: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.

Toutes les autres données sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.