Dans cette vidéo, vous observerez comment effectuer le test de libération de chrome et déterminer le potentiel cytotoxique des cellules effectrices.
Les cellules immunitaires sont responsables de l’identification et de l’élimination des cellules potentiellement nocives, comme les cellules cancéreuses ou infectées par un virus, du corps, qui fait partie intégrante de la réponse immunitaire. Plusieurs cellules immunitaires, comme les cellules T et les cellules NK, possèdent une propriété appelée potentiel cytotoxique, qui est la capacité d’identifier les cellules cibles et de sécréter des protéines qui induisent la dégradation des protéines, la lyse et la mort de ces cellules cibles. La quantification du potentiel cytotoxique est essentielle pour mesurer l’activation et la puissance des cellules immunitaires, et le test de libération de chrome est couramment utilisé à cette fin.
Cette méthode permet aux utilisateurs de comparer la cytoxicité induite par des types spécifiques de cellules immunitaires dans différentes conditions, ce qui est précieux pour étudier l’immunothérapie du cancer et les maladies liées à l’immunité. Pour commencer, les cellules cibles, comme les cellules cancéreuses, sont incubées avec un isotope radioactif, le chrome 51, qui est absorbé par les cellules. Ensuite, ces cellules radio-marquées sont co-cultivées avec les cellules immunitaires isolées d’intérêt, également appelées cellules effectrices, dans une plaque à fond rond à 96 puits pour faciliter l’interaction entre les deux types de cellules.
La configuration globale de l’essai implique l’incubation d’un nombre spécifique de cellules cibles avec des concentrations différentes des cellules immunitaires, ainsi que des contrôles appropriés. La co-culture permet aux cellules effectrices d’induire une apoptose et une lyse dans les cellules cibles, entraînant la libération du chrome intracellulaire 51 dans le surnageant. Puis, à un moment préoptimisé, le surnageant contenant le chrome libéré est récolté dans tous les puits. Le chrome 51, étant radioactif, subit spontanément une désintégration radioactive pour émettre un rayonnement gamma. Les niveaux de rayonnement gamma dans les surnageants de tous les puits de la plaque de dosage représentent une sortie quantifiable de la lyse des cellules cibles. Ceci est mesuré à l’aide d’un compteur gamma, qui est ensuite utilisé pour déterminer le potentiel cytotoxique des cellules immunitaires.
Pour commencer, les cellules cibles, la lignée cellulaire de mélanome humain WM793 dans cet exemple, sont préparées en une seule suspension cellulaire. Pour ce faire, retirez d’abord le milieu du flacon de culture tissulaire et lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS. Décanter le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine dans la plaque pendant environ deux minutes. Tapotez doucement la fiole pour détacher les cellules de la surface de la fiole, puis ajoutez cinq millilitres de milieu RPMI dans la fiole. Pipeter le fluide de haut en bas pour recueillir les cellules et ajouter cette suspension dans un tube conique de 15 millilitres.
Placer le tube dans la centrifugeuse pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Ensuite, retirez le support du tube en veillant à ne pas perturber la pastille cellulaire. Faites glisser doucement le fond du tube pour perturber la pastille cellulaire et ajoutez 10 millilitres de média dans le tube. Ensuite, pipeter doucement le support de haut en bas pour mettre les cellules en suspension. Ensuite, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et transférez deux millilitres de la suspension cellulaire d’origine dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Placez le tube dans une centrifugeuse et pelletez les cellules à 12 cents tr / min pendant cinq minutes. Après centrifugation, versez l’excès de fluide hors du tube dans un récipient à déchets. Vortexez brièvement le tube pour remettre en suspension la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé.
Ensuite, préparez-vous à utiliser le chrome 51 en vous déplaçant dans un espace de laboratoire dédié à cette radioactivité particulière. Il devrait y avoir un blindage suffisant pour le stockage et l’utilisation sûrs du chrome 51 pendant toutes les étapes, ainsi qu’une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons contenant du chrome 51 sont conservés. Un compteur Geiger équipé d’une sonde à crêpes est également nécessaire pour servir dans l’espace pour une éventuelle contamination.
Une fois mis en place pour l’utilisation correcte de la radioactivité, ajouter 100 microcuries de chrome 51 directement à la suspension de cellules cibles. Ensuite, ajoutez un petit morceau de ruban adhésif radioactif au tube pour indiquer que l’échantillon et le tube sont maintenant radioactifs. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés celsius avec un écran de plomb et incubez pendant une heure, en faisant glisser le tube toutes les 15 à 20 minutes.
Pendant que les cellules cibles marquent, préparez une suspension cellulaire unique de cellules effectrices. Dans cet exemple, des cellules mono-nucléaires du sang périphérique humain, ou PDMC, ont été isolées du sang total par centrifugation par gradient de densité standard jusqu’à une concentration de 5 fois 10 à la 6ème. Transférer cette suspension de cellules effectrices dans un réservoir de réactif jetable, puis ajouter 200 microlitres de cette suspension dans chaque puits de la rangée B dans une plaque à fond rond à 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de RPMI dans chaque puits de la rangée C à G de la plaque.
Maintenant, commencez à effectuer des dilutions en série des PBMC pour avoir une gamme de numéros de cellules effectrices en retirant d’abord 100 microlitres des cellules dans les puits de la rangée B et ajoutez-les à la rangée C. Ensuite, diluez davantage les cellules effectrices en transférant 100 microlitres de cellules de la rangée C à la rangée D. Poursuivez la dilution en série. Une fois la rangée G atteinte, déplacer 100 microlitres des puits pour laisser un volume final de 100 microlitres dans chaque puits de cette rangée. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture tissulaire dans les puits de la rangée A pour servir de contrôle de la libération spontanée de chrome 51 des cellules cibles, car aucune cellule effectrice ne doit être ajoutée à cette rangée. Ensuite, placez une plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.
Après la période d’incubation, retirer les cellules cibles de l’incubateur et laver avec 5 millilitres de FBS pour éliminer tout excès de chrome 51. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse désignée et essorez à 1200 tr / min pendant 5 minutes. Retirez le lavage radioactif de FBS dans un récipient à déchets approprié et répétez l’étape de lavage en remettant la pastille en suspension dans 5 millilitres de FBS frais. Placez le tube dans une centrifugeuse désignée et faites tourner à nouveau les cellules à 1200 tr/ min pendant 5 minutes. Retirez le deuxième lavage et vérifiez la radioactivité incorporée dans la pastille à l’aide d’un compteur Geiger. Enfin, Remettre le culot en suspension dans 10 millilitres de milieu complet et verser la suspension de cellules cibles marquée au chrome 51 dans un réservoir de réactif jetable. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de ces cellules cibles marquées à chaque puits de la plaque de cellules effectrices à 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de NP-40 à 1% dans l’eau aux puits de la rangée H pour lyser toutes les cellules cibles de cette rangée. Ces puits seront utilisés comme témoin pour déterminer le nombre total par minute, ou cpm.
Maintenant que la plaque est préparée, fixez le couvercle en ajoutant un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban adhésif radioactif sur le couvercle pour indiquer qu’il contient du chrome 51. Ensuite, placez la plaque dans une centrifugeuse marquée pour traiter les échantillons radioactifs. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajoutez une plaque d’équilibrage à la centrifugeuse. Réglez la centrifugeuse à 1200 tr / min et amenez la plaque à la vitesse. Une fois à la vitesse, arrêtez la machine. Retirez la plaque de la centrifugeuse. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un petit morceau de blindage en plomb sur la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 heures pour permettre aux cellules cibles de lyser.
À la fin de la période d’incubation, retirez délicatement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirez le couvercle. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque en vous assurant que les petits disques filtrants sont en place pour chacun des bouchons de coton. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits. Après environ dix secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des bandes de tube. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire. Enfin, chargez les tubes FACS sur un compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de chrome 51 libérée dans chaque condition. Enregistrez soigneusement l’ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.
Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux 3 premières voies et des PMBC stimulés par le CPG ont été ajoutés aux voies 4 à 6. Dans cet exemple, les comptages par minute ont été entrés dans les cellules d’une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d’origine et les moyennes des triplicats ont été calculées. Par exemple, pour la première condition, les cellules A1, A2 et A3 ont été moyennées dans la cellule I3. Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition peut être calculé à l’aide de cette formule. Par exemple, pour calculer le pourcentage de lyse spécifique pour les cellules non stimulées ayant un rapport de 50 à 1 cellules effectrices aux cellules cibles, la CPM spontanée, qui dans cet exemple, est de 1164,67, a été soustraite de la CPM expérimentale, 1129. 67. Ce nombre peut ensuite être divisé par la différence entre la CPM maximale et la CPM spontanée, puis multiplié par 100 pour donner le pourcentage de lyse spécifique. Ceci est ensuite calculé pour chaque condition. Ces données peuvent ensuite être représentées graphiquement pour montrer la comparaison du rapport E / T avec le pourcentage de lyse spécifique pour les PBMC non stimulées et les PBMC stimulées par le CPG. Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées avec CPG tuent plus efficacement les cellules cibles à mesure que le rapport des cellules effectrices aux cellules cibles augmente. Cette augmentation n’a pas été observée dans les PBMC non stimulés, ce qui indique que la stimulation de la CPG est nécessaire à l’augmentation observée de la lyse des cellules cibles.