Le test de chimérisme est utilisé pour la documentation de routine de la prise de greffe et le suivi post-greffe des receveurs de transplantation allogénique. Les cellules donneuses et receveuses peuvent être distinguées en testant des marqueurs génétiques déterminés avant la greffe.2 Dans les transplantations non appariées selon le sexe, lorsque le receveur et le donneur sont de sexe différent, la proportion de cellules féminines et masculines est généralement déterminée par analyse de marqueurs des chromosomes sexuels, le plus souvent avec des POISSONS.8,9 L’évaluation du nombre variable de répétitions en tandem (VNTR) ou de répétitions en tandem courtes (STR) par PCR est devenue la méthode la plus précieuse pour déterminer le chimérisme dans les greffes appariées selon le sexe.10 Différentes méthodes ont été développées pour la détection de la MRD. L’analyse morphologique de la moelle permet d’identifier une maladie résiduelle occupant plus de 5% de l’espace médullaire et n’a donc pas la sensibilité nécessaire pour une détection précoce. En outre, il est souvent difficile de différencier une petite population de blastes leucémiques des blastes hématopoïétiques normaux dérivés du donneur repeuplant la moelle sans utiliser de marqueurs supplémentaires. Des tests spécifiques peuvent détecter la MRD lorsqu’il existe un marqueur tumoral spécifique, tel qu’une anomalie cytogénétique spécifique, un immunophénotype spécifique pouvant être identifié par FACS, des séquences spécifiques d’ADN ou d’ARN pouvant être amplifiées par PCR ou un modèle de croissance spécifique dans les dosages clonogènes. En l’absence d’un marqueur tumoral spécifique pour la MRD, le test de chimérisme peut être utilisé pour détecter les cellules dérivées du receveur. La détection de cellules dérivées du receveur peut ne pas toujours être en corrélation avec le risque de rechute. Les cellules receveuses contribuant au chimérisme mixte (MC) appartiennent au clone malin ou peuvent être des cellules hématopoïétiques normales, voire des cellules stromales. Au cours des premières semaines suivant la transplantation allogénique standard, les cellules réceptrices peuvent encore être détectées lorsque des tests sensibles sont utilisés.9,11 Ce sont principalement des cellules T qui survivent au régime de conditionnement. Les cellules hôtes peuvent être détectées à de faibles niveaux (< 1%) même plus tard dans le cours post-greffe. MC est détecté plus souvent après un conditionnement non myéloablatif.2 Ainsi, les sondes de marqueurs spécifiques à la tumeur sont probablement supérieures et plus précises que les sondes de non-concordance sexuelle pour la détection de la MRD.12 Cependant, même la détection de MRD avec des tests spécifiques à la tumeur peut ne pas toujours être corrélée avec le risque de rechute. Des tests PCR positifs pour le BCR / ABL ont été rapportés chez des personnes en bonne santé.13 La translocation t(14;18) a été détectée dans des lignées autres que les lymphocytes B chez des patients atteints de lymphome non Hodgkinien.14 Il peut y avoir un seuil pour que la MRD soit cliniquement significative. Dans plusieurs maladies, telles que la LAM avec t (8;21), 15 rémissions de longue durée ont été observées en présence de MRD détectées par PCR, tandis que dans d’autres, comme dans la leucémie promyélocytaire aiguë, la positivité PCR prédit la rechute.16 Encore une fois, cela peut être lié à la sensibilité du test PCR spécifique et au seuil de signification clinique. Les cellules malignes résiduelles peuvent être à un état de dormance17 sans le potentiel de contribuer à la rechute, en raison de l’absence ou du gain d’une deuxième altération génétique. Dans certaines maladies, une différenciation partielle en cellules plus matures peut se produire et ces cellules peuvent ne pas avoir le potentiel de proliférer. La MRD peut être sous surveillance immunitaire, ou les cellules MRD sont en phase apoptotique, ce qui les rend non pertinentes pour la récurrence de la maladie. Les tests de PCR sensibles ne préservent pas la morphologie cellulaire, et il n’est donc pas clair quelles cellules sont en corrélation avec la MRD dans ces différents contextes.
Le système Duet™ pour l’analyse multiparamétrique combinée morphologique et cytogénétique simultanée offre quelques avantages qui peuvent aider à révéler la pertinence de la détection de MRD. Ce système recherche automatiquement un grand nombre de cellules (environ 150000 cellules par lame) pour de petits sous-ensembles cellulaires avec un phénotype cytogénique ou immunitaire unique. La sensibilité à la détection de petites populations est accrue. Dans une série d’expériences de dilution, nous avons montré que la sensibilité pour la détection d’une cellule mâle dans une population de cellules femelles est supérieure à 1: 50000, cependant, en raison de la spécificité limitée de ce titre, la meilleure détection se produit entre 1: 10000 et 1: 50000 (voir annexe). Comme on l’a vu dans l’analyse des échantillons de moelle osseuse du patient 1 (dernière analyse) et du patient 2, le système Duet ™ pourrait détecter de très petites populations de cellules receveuses XY non détectées par les POISSONS de routine. La précision quantitative des POISSONS dépend de la fréquence observée et du nombre de cellules notées, ainsi améliorée en marquant plus de cellules.18 Le marquage d’un si grand nombre de cellules n’est pas pratique avec le FISH manuel, mais le système automatique Duet ™ est capable de scanner 10000 cellules / min en microscopie en champ lumineux et 2000-10000 cellules / h en microscopie fluorescente, ce qui répond à la nécessité d’un balayage rapide et efficace et d’une sensibilité accrue.
Les tests sensibles sont souvent associés à une spécificité réduite et à un taux de faux positifs relativement élevé. Avec FISH standard, un score faux positif peut se produire en raison d’une hybridation non spécifique de la sonde. Un score faussement positif pour les translocations chromosomiques peut se produire en raison d’une association spatiale aléatoire et d’une fusion optique.18 Le système Duet™ peut potentiellement améliorer la spécificité en identifiant la morphologie des cellules de la population recherchée. La détection de la positivité des POISSONS, dans une petite population mais avec un aspect morphologique Duet ™ uniforme, le rend plus susceptible d’être un vrai positif, que lorsque des cellules positives sont dispersées au sein de lignées différentes et non apparentées. La spécificité de la détection de MRD avec des tests de chimérisme non spécifiques peut également être améliorée. Comme discuté ci-dessus, les cellules receveuses peuvent appartenir au clone malin (comme chez le patient 1), peuvent être des cellules hématopoïétiques normales (patient 3, patient 1 après traitement par STI571) ou des cellules non hématopoïétiques / stromales (telles que les ostéoblastes, patient 2). Le système Duet™ permet de différencier ces options par l’aspect morphologique. Nous avons montré dans l’analyse du patient 1, et de deux patients supplémentaires (données non présentées), que l’identification des caractéristiques du receveur (telles que la cytogénétique du sexe opposé) au sein de blastes ou de cellules immatures prédit une rechute manifeste et la précède de quelques semaines à quelques mois. Dans le cas du patient 1, des analyses de POISSONS distinctes ont révélé une petite population de receveurs XY (0,6 %) et une petite population positive au BCR/ABL (0,8 %) qui pouvaient toutes deux être considérées dans le taux de faux positifs de l’analyse de POISSONS. Cependant, le système Duet™ a montré qu’une grande partie des cellules receveuses de XY étaient des blastes (et également positives au BCR/ABL par un deuxième test FISH sur les mêmes cellules) et pouvait ainsi prédire que le patient est destiné à une rechute. L’identification d’une petite population de receveurs au sein de cellules hématopoïétiques matures peut ne pas prédire la rechute. Chez trois patients supplémentaires (données non présentées), nous avons documenté une rémission continue en présence d’une petite population de receveurs présentant une morphologie mature. Des études à plus grande échelle avec un suivi plus long sont nécessaires pour confirmer l’association entre la morphologie des cellules hôtes résiduelles et le risque de rechute chez les patients n’ayant pas d’autres marqueurs uniques pour le clone malin.
Le système est relativement simple à utiliser, est principalement automatique, son temps de sortie et ses coûts sont comparables à d’autres systèmes de détection de chimérisme et de MRD tels que les POISSONS standard et la PCR et il peut convenir à des tests à grande échelle. Outre le matériel et les trousses du système, seul l’équipement standard facilement disponible dans les grands laboratoires est nécessaire (voir l’annexe).
Au cours des dernières années, l’étude du chimérisme au sein de différents sous-ensembles cellulaires a gagné en intérêt et en popularité.19,20 Ceci est de la plus haute importance après les greffes non myéloablatives.2 Il a été démontré par certains groupes que le chimérisme complet au sein des lymphocytes T est nécessaire pour l’induction de la GVL, et donc la MC dans ce sous-ensemble cellulaire peut être associée à un risque accru de rechute, en particulier de tumeurs malignes agressives à croissance rapide.2,19 Le test de chimérisme des sous-ensembles cellulaires nécessite un tri fastidieux et fastidieux des cellules avec le potentiel théorique de perdre certaines cellules au cours de ce processus. Comme indiqué dans l’annexe, la préparation des diapositives pour l’analyse Duet ™ ne provoque pas de perte ou de réduction de population cellulaire. Le système Duet ™ utilise la lame tachée MGG pour localiser les lymphocytes et d’autres sous-ensembles cellulaires et peut également utiliser des taches immunocytochimiques (telles que des anticorps monoclonaux anti-CD3) pour localiser ces cellules. Dans une deuxième phase, les POISSONS peuvent être soumis à des tests de chimérisme dans des transplantations non appariées selon le sexe. La présentation du cas du patient 3 montre comment le système a été utilisé pour suivre le chimérisme chez un patient après une greffe non myéloablative et comment la conversion en chimérisme complet après le retrait de la cyclosporine a prédit l’apparition de réponses GVHD et GVT.
Ce rapport se concentre sur l’utilisation de Duet ™ après une greffe de moelle osseuse, mais il peut y avoir de nombreuses autres implications. Le système peut également aider à étudier les cellules et les lignées qui abritent un marqueur cytogénétique ou immunophénotypique unique, tel que la fusion BCR / ABL (vue chez le patient 1) et à corréler leur morphologie avec le risque de rechute après une chimiothérapie standard. Cela peut aider à révéler la nature de la MRD dans différentes tumeurs malignes et pourquoi la détection de la MRD n’est pas toujours prédictive de la rechute. Dans certains contextes, de petites populations de cellules donneuses ou de micro-chimérisme peuvent être recherchées. Par exemple, un microchimérisme lympho-hématopoïétique systémique détecté après une transplantation d’organe solide peut prédire la tolérance à l’organe transplanté et diriger le traitement immunosuppresseur.21 Une petite population maternelle contaminant les allogreffes de sang de cordon peut également être détectée de la même manière et peut avoir des implications sur le risque de GVHD post-transplantation.
En conclusion, en ajoutant une analyse morphologique de petites populations de cellules avec des marqueurs de malignité ou associés au receveur, le système Duet ™ peut améliorer la précision des tests de chimérisme et de MRD, et délimiter leur signification clinique. Ce système mérite une étude plus approfondie dans des essais à plus grande échelle.