Le test d’immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) est une méthode importante pour la surveillance de la régulation transcriptionnelle avec une connaissance non exhaustive des interactions entre des protéines spécifiques et une région d’ADN génomique. Étant donné que les protéines se liant à l’ADN (y compris les facteurs de transcription et les histones) dans les cellules vivantes peuvent être réticulées à l’ADN auquel elles se lient, ChIP est utilisé pour immunoprécipiter le complexe protéine-ADN à partir de lysats cellulaires par un anticorps approprié. Les complexes immunoprécipités sont collectés par centrifugation et les protéines sont éluées pour une analyse plus approfondie telle que western blot et LC / MS. L’analyse de l’acide nucléique est réalisée par PCR, RT-PCR, séquençage de l’ADNc et microarray. Ce protocole fournit une procédure détaillée pour réussir le dosage des puces de manière rapide et efficace.
Réactifs:
- 37% formaldéhyde
- 1 M glycine
- Tampon de lyse cellulaire: NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mm (pH 7,5), EDTA 5 mM, NP-40 0,5%, Triton X-100 1%, avec cocktail inhibiteur de protéase 1 ×.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Ajouter 27 µL de formaldéhyde à 37% par 1 mL de milieu de culture pour obtenir une concentration finale à 1%, incuber les cellules pendant 10 min à température ambiante en agitant lentement sur un dispositif à bascule ou à agitation.
2. Éteindre la réticulation en ajoutant 141 µL 1 M de glycine pour 1 mL de milieu de culture pour obtenir une concentration finale à 125 mM, incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante.
3. Pour les cellules flottantes : colleter les cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifuger à 2 000 × g à 4°C pendant 5 min. Jetez le surnageant et lavez les cellules deux fois avec du PBS froid.
Passez à l’étape 5.
4. Pour les cellules adhésives: retirez le support, lavez les cellules deux fois avec du PBS froid. Racler les cellules en PBS dans un tube conique de 15 mL, centrifuger à 2000 ×g à 4°C pendant 5 min.
Lyse et sonication
5. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de tampon de lyse des cellules froides pour 1 × 107 cellules. Remettre la pastille en suspension en pipetant de haut en bas plusieurs fois et incuber sur de la glace pendant 10 minutes.
6. Sonicate pour cisailler la chromatine en fragment de 0,5 à 1 kb. Évitez la mousse et gardez l’échantillon sur de la glace.
Notes:
- Les conditions de sonication doivent être optimisées en fonction de l’échantillon et du modèle de sonicateur. En règle générale, six impulsions de 15 secondes suivies de périodes de repos de 45 secondes à la sortie 6.0 se sont avérées efficaces. Pour analyser la taille du fragment, extraire un petit volume d’ADN total d’une aliquote de chromatine cisaillée, puis analyser sur un gel d’agarose (1 ~ 2%).
- Les volumes sont suggérés ≤ 1 mL pour maintenir l’efficacité de la sonication.
7. Centrifuger à 12 000 ×g à 4°C pendant 10 min, et retenir le surnageant.
8. Transférer 0,5 mL de surnageant dans un 1 frais.Tube de 5 mL pour l’analyse des fragments d’ADN.
Immunoprécipitation
9. Ajouter les anticorps pertinents ou les IgG normales à l’échantillon et incuber pendant 15 min dans un bain d’eau à ultrasons à température ambiante.
Notes:
- Choisissez des IgG de la même espèce où les anticorps ont été produits.
- Le temps d’incubation doit être optimisé en fonction de l’anticorps et de l’antigène. Pour les antigènes à faible niveau d’expression, l’incubation peut être effectuée à 4°C pendant une nuit sur une plate-forme rotative.
10. Préparer des perles de protéine A -agarose: laver les billes trois fois avec 1 mL de tampon de lyse (sans inhibiteur de protéase), centrifuger à 2000 ×g pendant quelques secondes à 4°C puis jeter le surnageant.
11. Diluer les billes 1: 1 avec du tampon de lyse et ajouter 50 µL à l’échantillon.
12. Incuber à 4°C pendant 30 ~ 45 min dans une plate-forme rotative.
13. Centrifuger à 2000 ×g pendant 1 min à 4°C puis jeter le surnageant.
14. Laver les billes quatre fois avec 1 mL de tampon de lyse (sans inhibiteur de protéase), jeter le surnageant.
Purification et analyse de l’ADN
15. Remettre les billes lavées en suspension avec 100 µL 10% de Chelex 100.
16. Pipeter de haut en bas pendant plusieurs secondes, puis faire bouillir l’échantillon pendant 10 minutes.
17. Centrifuger à 12 000 × g pendant 1 min à température ambiante et transférer le surnageant dans un tube frais de 1,5 mL.
18. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN ou par protocole standard d’extraction du phénol: chloroforme.
19. Dissoudre l’ADN avec 50 µL de ddH2O, et utiliser 2 à 10 µL de l’échantillon d’ADN (25% du volume de réaction) dans les réactions de PCR
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