Plantes et l’agent pathogène
La plante de glace commune (Mesembryanthemum crystallinum L.) a été cultivée en serre décrit par Kuźniak et al. . Après l’apparition de la 3ème paire de feuilles, un ensemble de plantes a été irrigué avec du NaCl de 0,4 M pour induire le métabolisme de l’acide Crassulacé (plantes CAM) tandis qu’un autre a été irrigué avec de l’eau du robinet (plantes C3). Après 12 jours, l’induction de CAM dans les plantes traitées au NaCl a été confirmée par la mesure du malate diurne ∆ dans la sève des cellules foliaires. Par la suite, les feuilles des 2ème paires de feuilles de plantes C3 et CAM ont été inoculées avec Botrytis cinerea selon Kuźniak et al. .
Imagerie de fluorescence de Chlorophylle a
La version Mini d’un fluoromètre de chlorophylle Imaging-PAM Série M (Walz, Effeltrich, Allemagne) équipé d’un porte-feuille a été utilisée pour enregistrer l’imagerie de fluorescence (Fluoromètre de chlorophylle Imaging-PAM série M). Le fluoromètre est un modèle de pince à feuilles pour les applications sur le terrain. Le porte-feuille garantit que la feuille est maintenue à l’horizontale par rapport à la source de lumière pour éviter un éclairage hétérogène sur différentes zones de l’échantillon de feuille. Les positions d’échantillonnage ont été choisies pour être également espacées le long de la nervure médiane, mais elles différaient légèrement pour n’importe quelle feuille en raison de sa taille et de sa morphologie, et de la technique de placement des feuilles dans le support. Pour identifier uniquement les effets du stress biotique et éviter l’introduction d’artefacts dans la procédure de mesure de la fluorescence de la chlorophylle, aucune marque de référence permettant de référencer l’image foliaire n’a été appliquée sur les feuilles. La fluorescence de la chlorophylle des feuilles de plantes de glace communes a été obtenue en définissant une zone d’intérêt (outil AOI) à l’aide du logiciel d’imagerie Win 2.41a.
Avec l’Imaging-PAM, le rendement de fluorescence actuel (Ft) a été surveillé en continu. Les plantes ont été adaptées à l’obscurité pendant 20 min. Sur application d’une impulsion de saturation, on a déterminé le rendement de fluorescence au niveau de l’obscurité (Ft = F0) et le rendement de fluorescence maximal (Fm). Le rendement quantique maximal PSII, Fv/Fm, et les rendements quantiques de dissipation d’énergie régulée et non régulée en PSII, Y (NPQ) et Y (NO) ont été imagés. Fv / Fm a été calculé selon l’équation: Fv / Fm = (Fm−F0) Fm. Y (NPQ) a été calculé selon Kramer et al. par la formule: 1-Y (II)-1/(NPQ+1 + qL (Fm/F0-1)). Y(NO) a été calculé selon Kramer et al. par l’équation : Y(NO) = 1/. Le processus d’imagerie fournit des images en pseudo-couleur (mode couleur indexé) de matériel biologique avec une résolution de 640 × 480 pixels correspondant au champ de vision des dimensions physiques 32 × 24 mm.
Les feuilles infectées des plantes C3 et CAM ont été prises pour une analyse de fluorescence chl au moment de l’inoculation et 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 et 72 h après l’inoculation. La fluorescence de Chl a a été mesurée pour les feuilles attachées de la 2e paire de feuilles de trois plantes C3 et CAM provenant de deux répétitions indépendantes de culture de plantes. Chaque feuille prélevée pour analyse a été criblée séparément à tous les moments (Fig. 1). Des séries représentatives de neuf images (une pour chaque point temporel) de Y (NO), Y (NPQ) et Fv / Fm pour les plantes de glace C3 et CAM ont été traitées pour mesurer les changements de ces paramètres dans une zone sélectionnée de limbe de feuille criblée au fil du temps. À titre de comparaison, Y(NO), Y (NPQ) et Fv/Fm ont fait la moyenne des données des régions foliaires entières représentées à la Fig. 2 ont été obtenus. Les résultats de l’alignement de l’image et de la mesure du pattern spatio-temporel de la propagation du stress biotique dans les feuilles avec la méthode proposée ont été illustrés sur des images Y(NO).
Exemples d’images du rendement quantique de la dissipation d’énergie non régulée dans les feuilles de plantes de glace communes. S’applique à PSII Y (NO) des paramètres de fluorescence C3 (a–d) et CAM (e–h). Le fragment de feuille contient le site d’inoculation de l’agent pathogène et les symptômes de propagation du stress
Exemple d’image d’une feuille de plante de glace commune en C3 avec des régions d’intérêt sélectionnées. Les sélections effectuées manuellement dans l’éditeur de micrologiciel couvrent les zones infectées (1), sans symptômes (2) ainsi que les zones médianes (3)
Alignement d’image
Le mécanisme de collecte de données d’image PAM dans une séquence temporelle entraîne le déplacement du fragment de feuille dans le champ de vision entre des points temporels individuels (Fig. 1). En raison du changement de position des feuilles, des caractéristiques telles que la nervure médiane et les sites d’inoculation ont à la fois un emplacement et une orientation différents. De plus, l’effet du rééchelonnement peut être observé. Pour évaluer correctement la propagation des contraintes, les champs de vue doivent être synchronisés mutuellement en supposant que l’un d’eux soit une image de référence (fixe) et que le reste des images soit aligné avec l’image fixe. Cette approche est connue en imagerie médicale sous le nom d’enregistrement d’images. La tâche d’enregistrement de base pour les images de fluorescence consiste à trouver la transformation de « similarité » consistant en une rotation, une translation et une mise à l’échelle appropriées. La flexion de la surface foliaire et le pliage des feuilles par contrainte ne se produisent que dans des régions locales d’images uniques et sont d’une importance mineure pour l’alignement global de l’image. Ils peuvent être compensés au stade du post-traitement d’enregistrement par des transformations non linéaires telles que par exemple des plaques minces, des cannelures de surface et des mappages de démons.
Les images de fluorescence sont prises sous la forme d’une série de prises de vue dans des intervalles de temps prédéfinis d’approximativement la même région foliaire. Les éléments caractéristiques de l’empilement d’images considéré représentent principalement des nervures de feuilles. Cependant, ils se distinguent mal du contenu de l’image en raison du contraste limité ainsi que de la mode de couleur de l’imagerie PAM. Les zones de symptômes de stress dominant visuellement le contenu peuvent changer d’une image à l’autre dans une seule série. Dans une telle situation, l’enregistrement automatique échouerait.
Les méthodes de pointe automatiques les plus populaires sont basées sur la comparaison de l’intensité de l’image avec certaines mesures de corrélation (méthodes basées sur l’intensité) ou reposent sur la recherche dans les images fixes et en mouvement de la correspondance entre les caractéristiques d’image sélectionnées telles que les points, les lignes et les contours (méthodes basées sur les caractéristiques). Aucune de ces approches ne permet d’enregistrer correctement les images de fluorescence PAM d’une plante glaciaire commune, ce qui a été vérifié et montré dans les exemples inclus dans les matériaux supplémentaires (fichier supplémentaire 1). Les résultats qui y sont présentés confirment que la raison de l’échec des enregistrements automatiques est la forte obscurcissement des régions d’image avec des caractéristiques préservées par des changements dynamiques du contenu de l’image causés par une infection du tissu foliaire. Des tests des méthodes populaires ont été effectués à la fois par l’estimateur d’enregistrement à Matlab et dans l’environnement des Fidji.
L’algorithme d’enregistrement d’image PAM a été conçu dans l’environnement Matlab à partir de l’ensemble de points de contrôle sélectionnés manuellement par un expert. Pour définir les points de contrôle correspondants dans chaque image, la fonction cpselect de l’outil de sélection des points de contrôle de la Boîte à outils de traitement d’image a été appliquée. Les images ont été éditées par paires, y compris une image fixe et une image en mouvement. La première image acquise juste après l’inoculation de l’agent pathogène a été supposée être une image fixe (de référence). Grâce à la cartographie interactive des points, l’utilisateur peut pointer non seulement les contours visibles des nerfs, mais également d’autres éléments caractéristiques tels que le point d’injection, les sites le long de la propagation de l’agent pathogène ainsi que les cellules de la vessie épidermique les plus apparentes (Fig. 3).
Points de contrôle sélectionnés par l’expert. Exemple Y (NON) images d’un fragment de feuille d’une plante de glace commune CAM : une image fixe (de référence), b une image en mouvement à aligner avec la fixe
Plusieurs paires d’emplacements de points de contrôle, réparties aussi largement que possible sur la surface de l’image de la feuille, suffisent pour aligner correctement les images d’une même feuille grossièrement considérée comme un corps rigide. Une répartition plus large des points de contrôle améliore la sensibilité de la correspondance d’image mais est limitée par le champ de vue d’image recadré après la transformation d’alignement et par la possibilité de localisation précise du point sélectionné sur le limbe. Avec un tel alignement d’image, la transformation affine a été effectuée à l’aide de la fonction fitgeotrans incluse dans la Boîte à outils de traitement d’image. Cette transformation a été limitée à la version « similarité » (composée uniquement de translation, de rotation et de similitude) car la scène du fluoromètre PAM semblait non inclinée. Les images animées ont été appariées à l’image fixe à l’aide de la fonction imwarp. Une illustration graphique de l’algorithme d’enregistrement est incluse dans la Fig. 4.
Le schéma de principe de l’enregistrement affine et optionnel de la spline B appliqué aux images PAM de fluorescence. \(\left\) – le vecteur des points de contrôle dans l’image fixe, \(\left^{\left(k\right)}\) – le vecteur des points de contrôle dans la k-th image animée, \(\left^{{\left({k^{\prime}}\right)}}\) – le vecteur des points de contrôle dans la k-th image animée après l’enregistrement de B-spline
Les feuilles à différents stades d’infection peuvent avoir une surface localement ondulée ou ridée comme dans la région marquée sur les images analysées du PAM-fluoromètre (Fig. 5a, b), dont la forme peut potentiellement influencer la bonne analyse du phénomène de propagation de l’agent pathogène. Cela signifie que la méthode d’enregistrement affine basée sur la transformation géométrique peut ne pas être suffisante pour correspondre aux images PAM de fluorescence dans certains cas de feuilles présentant une déformation non linéaire apparemment visible. Par conséquent, les auteurs proposent une méthode d’enregistrement en deux étapes où l’enregistrement rigide affine est suivi d’un enregistrement B-spline réduisant les déformations non linéaires.
Exemple d’enregistrements affine et B-spline pour l’image de feuille de plante de glace commune C3. a L’image Y (NO) après acquisition de PAM, b l’image après transformation affine rigide avec les flèches représentant des vecteurs de déplacement définis de manière interactive utilisés dans la deuxième étape d’enregistrement et c forme finale après l’enregistrement de B-spline basé sur un point de contrôle
Le choix du type d’enregistrement non rigide exploite le fait que les feuilles communes de la plante de glace représentent un peu de matériau flexible et que de petites forces de flexion maintiennent des changements en douceur dans le profil de la surface des feuilles. La spécificité de cette modification d’enregistrement est que les vecteurs de champ de déformation de l’image doivent être imposés de manière interactive. A cet effet, un éditeur de champ vectoriel dédié a été attaché à l’algorithme. Seuls quelques vecteurs de déplacement dans l’image animée doivent être spécifiés pour enregistrer des déformations locales et lisses d’une surface foliaire comme sur la Fig. 5b.
L’algorithme de Rueckert B-spline a été sélectionné pour la deuxième étape de l’enregistrement. Sa mise en œuvre est disponible dans Matlab Central File Exchange sous la forme de la boîte à outils d’enregistrement des splines Dirk-Jan Kroon.
La procédure d’enregistrement de la spline B comprend deux étapes de base:
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Initialisation d’une grille G de points d’image uniformément répartis sur la surface de l’image avec tous les vecteurs de champ de déformation mis à zéro, puis calcul d’un champ de vecteurs dense T de déformations dans la grille G par interpolation cubique B-spline de vecteurs de déplacement de points de contrôle définis manuellement \(\left^{\left(k\right)}\). La grille et le champ de transformation T associé sont ensuite affinés de manière itérative en 4 étapes pour réduire l’espacement des nœuds de grille. La transformation T est préparée par la fonction point_registration de Spline Registration Toolbox.
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B – transformation spline de toutes les positions de pixels et interpolations bi-cubiques des composantes de couleur dans l’image mobile (enregistrée affine) \(I_{M}\) selon le champ de déformation lissé spline.
Précision d’enregistrement d’image
La précision de l’alignement d’image proposé a été réalisée par le carré moyen racine (RMS) sur les écarts de N = 15 points de contrôle représentés à la Fig. 3. Le déplacement de chaque point de contrôle d’image fixe \(P_{i}\) évalué dans une image en mouvement pour le cas avec et sans l’alignement a été illustré à la Fig. 6 comme vecteurs \(R_{i} P_{i} = \Delta r_{i}\) et \(Q_{i} P_{i} = \Delta q_{i}\) respectivement. Les erreurs de déplacement efficaces de tous les points de contrôle dans une seule image pour les deux cas sont exprimées en Eq. (1) comme \(\Delta r_{\text{rms}}\) et \(\Delta q_{\text{rms}}\).
Illustration de l’évaluation des erreurs dans l’enregistrement affine des images PAM. \(P_ {i} ,\;i = 1, \ldots, N\) — point de contrôle dans l’image fixe \(I_{F}\), \(Q_{i}\) — mappage du point de contrôle \(P_{i}\) dans l’image en mouvement \(I_{M}\), \(R_{i}\) — mappage du point de contrôle \(P_{\text{i}}\) après enregistrement, \(R_{i} P_{i} = \Delta r_{i}\) — erreur de déplacement du point de contrôle \(P_{\text{i}}\) après l’enregistrement
Le pourcentage de déplacement résiduel \(\delta_{rms}\) après enregistrement de type affine, peut être évalué par image selon Eq. (2).
Les erreurs d’enregistrement affine évaluées sont répertoriées dans le tableau 1. Les déplacements d’origine \(\Delta q_{\text{rms}}\) variant de 3,01 à 7,09 mm sont réduits après l’enregistrement de « similarité » à la plage de 0,45 à 1,71 mm de \(\Delta r_{\text{rms}}\) pour la centrale C3 testée. Les mêmes paramètres pour CAM plant sont \(1,90\div 5,69\; {\text{mm}}\) pour \(\Delta q_{\text{rms}}\) et \(0,41\div 1,53\; {\text{mm}}\) pour \(\Delta r_{\text{rms}}\). Lorsque \(\delta_{rms}\) est moyennée à la fois pour les séries d’images C3 et CAM, elle est égale à environ 21% et 23% respectivement. Les valeurs des paramètres de fluorescence Y(NO), Fv/Fm et NPQ obtenues à partir d’images de feuilles de plantes de glace sans enregistrement sont extraites de parties incompatibles de la feuille et ne peuvent pas être prises en compte (voir Fichier supplémentaire 2).
Pour un mappage d’enregistrement de B-spline supplémentaire, l’erreur de transformation est définie par deux composants. Le premier d’entre eux est le déplacement post-enregistrement \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) représenté à la Fig. 7a, avec \(R_{i}\) évalué en Eq. (3) comme le centroïde \(\bar{p}\) de la région \(A_{i}\).
où \(I_{R}\left(p\right)\in\left\) indique l’intensité de l’image de point de contrôle enregistrée au pixel p, \(\left/{A_{i}}\right |\) – la zone de la région de flou. La deuxième composante d’erreur est définie par le rayon d’écart type \(\rho_{i}\) d’intensité étalée autour de chaque point de contrôle \(R_{i}\) comme décrit dans Eq. (4).
où \(\left\|\cdot\right\|\) désigne la norme euclidienne du vecteur entre les points p et \(\bar{p}\) dans le plan image. Le flou du point de contrôle aligné \(R_{i}\) apparaît du fait que l’enregistrement non linéaire utilise une interpolation bicubique dans la grille de résolution finie G. Cet effet a été mesuré expérimentalement en effectuant une transformée B-spline donnée dans l’image construite à partir de points de contrôle blancs sur un fond noir. Le tableau 2 comprend les grandeurs \(\Delta q_{i}\) de N = 9 exemples de vecteurs de champ de déplacement représentés à la Fig. 5 ter. Les grandeurs \(\Delta r_{i}\) des erreurs de mappage vectoriel après l’enregistrement de spline sont mesurées entre les points de contrôle fixes souhaités \(P_{i}\) et les centroïdes des points enregistrés \(R_{i}\) évalués dans la région \(A_{i}\). Toutes les valeurs testées \(\Delta r_{i}\) sont inférieures à la résolution en pixels égale à \(50\;\upmu{\text{m}}\) et peuvent être négligées – arrondies à 0. Cela signifie un positionnement précis des points de contrôle par la transformée spline. L’écart type \(\rho_{i}\) de la région de flou indiquée dans le tableau 2 après doublement peut être une mesure du flou du point de contrôle. Ensuite, cela varie approximativement de \(24 \; {\text{to}} \; 63 \; \upmu{\text{m}}\) ce qui est l’équivalent du flou d’un pixel. Ainsi cette transformée permet de restituer localement la forme correcte des changements Y(NO) dans une image de fluorescence.
Explication de l’erreur dans l’enregistrement de l’image B-spline des images PAM. a L’inadéquation du mappage d’emplacement de point de contrôle lors de l’enregistrement, b distribution d’intensité d’image du point de contrôle enregistré par spline, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots, N\) — point de contrôle dans l’image fixe \(I_{F}\), \(Q_{i}\) — l’équivalent du point de contrôle \(P_{i}\) dans l’image en mouvement \(I_{M}\), \(R_{i}\) — mappage du point de contrôle \(P_{i}\) après enregistrement, \(R_{i} P_{i} = \Delta r_{i}\) — mesure d’erreur de déplacement du mappage du point de contrôle \( P_{i}\), \(A_{i}\) — région floue autour de \(R_{i}\) correspondant au point de contrôle \(P_{i}\), \(\rho_{i}\) — le rayon d’écart type du flou \(R_{i}\)
La mesure de la propagation des contraintes
L’analyse des données applique un outil d’édition spécial pour manipuler une pile d’images PAM après leur enregistrement. La fonction d’édition principale permet de dessiner deux sections de ligne d’acquisition de données \(L_{1}\; {\text{ and}}\; L_{2}\) de longueur égale (Fig. 8), qui peut être observé et disponible sur n’importe quelle image de la pile. Dans l’expérience considérée, la première ligne \(L_{1}\) commence au site d’inoculation \(s_{1}\), où le facteur de contrainte est appliqué au tissu foliaire au temps t, et doit être approximativement réglé dans le sens de l’expansion de la contrainte. La deuxième ligne \(L_{2}\) est placée le long de la nervure médiane où l’influence de la contrainte observée dans le temps était toujours limitée et les paramètres de fluorescence présentent des changements minimes. Les lignes doivent s’adapter entièrement au contexte de l’image.
Régions de mesure dans des images Y (NO) de feuilles de plantes de glace communes après l’alignement informatique. Les points de mesure indiquent: (1) mésophylle au site d’inoculation, (2) mésophylle sans lésion, (3) nervure médiane près du site d’inoculation. La ligne de mesure (L1) est orientée dans la direction de propagation de la contrainte à l’intérieur du mésophylle et la ligne (L2) est située le long de la nervure médiane. Lignes commencées aux points (S1) et (S2), respectivement
Une option supplémentaire de mesure ponctuelle est possible lorsque trois petites régions circulaires différentes du rayon de 10 pixels sont placées de manière interactive dans le champ de vision (Fig. 8). Ils devraient appartenir aux régions foliaires avec différents paramètres de fluorescence qui se mélangent au fil du temps. Toutes les valeurs de pixels enregistrées sont moyennées à l’intérieur de ces régions.