Matériaux et méthodes
Après avoir reçu le consentement éclairé écrit des patientes, nous avons examiné la pharmacocinétique à l’état d’équilibre de la clonidine administrée par voie orale dans le plasma de 17 femmes enceintes recevant de la clonidine en milieu de grossesse (22-26 semaines de gestation) ou en fin de grossesse (34-38 semaines de gestation). Six de ces femmes ont participé à des prélèvements d’échantillons de plasma maternel et de cordon ombilical (artériel et veineux) au moment de l’accouchement pour mesurer les concentrations de clonidine. L’âge gestationnel était basé sur la dernière période menstruelle ou la datation par échographie précoce.
Sélection du sujet. Cette étude a été approuvée par le Comité d’examen expérimental de l’Université de Washington. Les sujets étaient admissibles à participer si elles étaient enceintes, âgées de 18 ans, avaient un hématocrite ≥28% et recevaient de la clonidine par voie orale pour l’hypertension maternelle.
Schéma posologique. Le traitement par clonidine par voie orale n’a pas été modifié aux fins de l’étude. Les doses variaient de 0,15 à 0,30 mg par jour, administrées en doses fractionnées. La durée de l’étude pharmacocinétique dépendait de l’intervalle posologique du sujet, qui allait de 6 à 12 h. Pendant 3 jours avant l’étude, des comprimés oraux de clonidine, provenant du même lot de fabrication, ont été fournis. Les sujets ont enregistré l’heure de chaque dose sur un calendrier d’étude. Les sujets ont pris leur dose de clonidine le matin dans les 30 minutes de 8h00. Les doses suivantes ont été prises dans les 30 minutes suivant les heures d’administration prévues. Le matin de l’étude pharmacocinétique, les sujets ont été invités à jeûner, à l’exception des liquides clairs, pendant 5 h avant l’administration de clonidine jusqu’à 1 h après l’administration.
Prélèvement d’échantillons. Des échantillons de plasma en série ont été prélevés aux moments suivants: 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, et 12 h après le dosage, ou tronqué pour correspondre à l’intervalle de dosage du sujet. L’urine a été recueillie sur un intervalle d’administration pour déterminer la clairance rénale de la clonidine et la clairance de la créatinine. Des échantillons de plasma, de cordon maternel et ombilical (artériel et veineux), ont été prélevés au moment de l’accouchement pour quantifier les concentrations de clonidine. Tous les échantillons ont été stockés à -80°C jusqu’à l’analyse de l’échantillon.
Concentrations de clonidine. Les concentrations plasmatiques de clonidine ont été quantifiées à l’aide d’un dosage validé par chromatographie liquide/spectrométrie de masse (LC/MS). En bref, 250 µl d’échantillons de plasma ont été mélangés à 500 pg d’étalon interne (clonidine-d4) dans 500 µl de carbonate de sodium (0,1 M) (pH = 9,3) et 3 ml d’heptane/ alcool isoamylique (98,5: 1,5). Des étalons ont été préparés en dopant du plasma blanc avec 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 250, 375, 500, et 750 pg de clonidine. Les échantillons ont été secoués sur un agitateur horizontal pendant 15 min à température ambiante. Après centrifugation (1500g pendant 10 min), les échantillons ont été congelés sur de la glace carbonique et la couche organique décantée dans un tube de culture propre. Deux millilitres d’aliquotes d’acide sulfurique (0,05 M) ont été ajoutés à la couche organique et de nouveau agités pendant 15 min. Après centrifugation (1500g pendant 10 min), les échantillons ont été congelés sur de la glace carbonique et la couche organique a été jetée. Une aliquote de 200 µl de 29.de l’hydroxyde d’ammonium aqueux à 29% a été ajouté à la couche aqueuse avec 3 ml d’heptane/alcool isoamylique (98,5:1,5) et agité pendant 15 min. Après centrifugation (1500g pendant 10 min), les échantillons ont été congelés sur de la glace carbonique et la couche organique décantée dans un tube de culture propre. La couche organique a été évaporée sous courant d’azote à 40°C. Le résidu a été reconstitué avec 75 µl d’acide formique (12 mm)/méthanol (60:40) dont 10 µl ont été injectés sur le système LC/MS.
Des échantillons d’urine de 250 µl ont été mélangés avec 250 µl d’acide formique (12 mM) et 50 ng d’étalon interne (clonidine-d4). Les étalons ont été préparés en dopant l’urine vierge avec 0, 1.25, 2.5, 6.25, 12.5, 18.75, et 25 ng de clonidine, respectivement. Les échantillons ont été vortexés et 1 µl a été injecté sur le LC/MS.
Le système LC/MS était un Agilent 1100 MSD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) composé d’une pompe binaire, d’un échantillonneur automatique, d’un compartiment à colonne et d’un spectromètre de masse. La colonne de chromatographie liquide haute performance était un Phenomenex Synergi Polar RP80A, 250 mm × 2.0 mm, 4 µm (Phenomenex, Torrance, CA). La colonne est maintenue à 40°C. Les composants de phase mobile sont l’acide formique (A) et le méthanol (B) de 12 mM, avec un débit initial de 0,25 ml/min. La phase mobile initiale a été maintenue pendant 1 min et comprenait 40% de B pour les échantillons de plasma et 35% de B pour les échantillons d’urine. Le pourcentage de B a été augmenté linéairement au cours des 4 minutes suivantes à 90% pour le plasma et à 60% pour l’urine, puis maintenu constant pendant 1 minute avec une augmentation linéaire du débit à 0,3 ml / min pour l’urine et le plasma. Pour le gradient de retour, le pourcentage de B a ensuite diminué linéairement sur 1 min jusqu’à 40% (plasma) ou 35% (urine), qui a ensuite été maintenu constant. Le débit a été maintenu à 0,3 ml/min pendant 1 min puis diminué linéairement sur 1 min jusqu’à 0,25 ml/min puis maintenu constant. Le temps d’exécution total était de 12,5 min. Pour les analyses plasmatiques et urinaires, le spectromètre de masse a été utilisé en mode électrospray positif et réglé pour la surveillance sélective des ions m / z 230 (clonidine) et m / z 236 (clonidine-d4) avec un temps de séjour de 289 msec pour chaque ion.
Paramètres pharmacocinétiques. Les paramètres pharmacocinétiques à l’état d’équilibre ont été déterminés à l’aide de techniques non conventionnelles. L’aire sous la courbe concentration-temps de clonidine plasmatique sur un intervalle de dosage (ASCt) a été calculée à l’aide de la règle trapézoïdale linéaire. La clairance orale apparente (CL/F) a été calculée par CL/F = Dose/ASCt. La clairance rénale de la clonidine (Clrénale) a été calculée par Clrénale = Ae, τ/AUCt, où Ae, τ = la quantité de clonidine excrétée inchangée dans l’urine sur un intervalle d’administration. La clairance de la créatinine a été calculée par CrCl = (VolumeUrine × CréatinineUrine) / (CréatinineSerum× τ). La clairance rénale de la clonidine ajustée en fonction du taux de filtration glomérulaire (DFG) a été calculée par CLrenal ajusté en fonction du DFG = CLrenal–fu × CrCl, où la fraction non liée dans le plasma (fu) a été supposée être de 0,80 (Hulter et al., 1979). Chez tous nos sujets, l’intervalle de dosage relativement court n’a pas permis d’estimer avec précision la demi-vie de la clonidine, qui avait déjà été rapportée à 11,1 ± 3,3 et 10,8 ± 2,2 h chez des adultes sains non enceintes (Cunningham et al., 1994; Fujimura et coll., 1994).
Statistiques. Nos paramètres pharmacocinétiques de la clonidine pendant la grossesse ont été comparés à des paramètres publiés précédemment chez des volontaires sains et non enceintes (CL/F, Porchet et al., 1992; Cunningham et coll., 1994) (CLrenal, Fujimura et al., 1994). La régression linéaire a été utilisée pour déterminer la corrélation entre la clairance de la créatinine et la clairance rénale de la clonidine. Le test t de Student non apparié a été utilisé pour comparer les groupes enceintes et non enceintes. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme significative. Tous les résultats sont présentés en moyenne ± D.S.