Discussion
Les vers adultes de C. sinensis qui ont été incubés dans des milieux de bouillon ont produit plus de 4 000 œufs/ver / jour au début. Par la suite, le nombre d’œufs a diminué à un peu plus de 1 000 au jour 7 et à 300-400 au jour 14. Les comptes sont devenus inférieurs à 100 à 28 jours dans le milieu de bouillon. Les comptes étaient similaires les uns aux autres parmi 3 milieux de bouillon. Contrairement à cela, les dénombrements dans l’âme de Locke étaient respectivement de 220±44 et 1023±64 aux jours 1 et 3. Ces dénombrements étaient inférieurs à ceux des milieux en bouillon au début, mais les vers produisaient plus d’œufs au 21e jour et plus tard. Les vers dans les milieux de bouillon produisaient leurs œufs plus vigoureusement au début de la phase d’incubation, tandis que ceux dans la solution de Locke produisaient moins d’œufs par jour, mais pendant une période plus longue. Le nombre quotidien d’œufs de 4 000 par un ver adulte était compatible avec le nombre moyen estimé de 3 770 œufs d’un humain infecté.
Sur la base du nombre d’œufs, le nombre total d’œufs produits par un ver adulte incubé, qui a été récupéré sur des lapins après 8 semaines d’infection, a été estimé à 37 274 ± 2 988 en moyenne. Ces nombres totaux d’œufs étaient similaires indépendamment de la solution ou du milieu de culture. Le nombre quotidien d’ovules a diminué rapidement et l’utérus est devenu vide pendant la culture. Par conséquent, les comptes d’œufs quotidiens actuels représentaient que les vers cultivés in vitro ne produisaient que les œufs intra-utérins préformés dans leur utérus alors qu’ils vivaient chez des lapins avant la culture. Sur la base des données, on estime qu’un C. sinensis gravide contient environ 37 000 œufs dans son utérus et produit environ 4 000 œufs chaque jour. En conséquence, les œufs peuvent rester dans l’utérus environ 10 jours pour la maturation intra-utérine. La plupart des œufs dans l’utérus ont été trouvés matures et le miracidium s’est déjà développé, mais certains d’entre eux étaient immatures principalement dans l’utérus proximal. Ces œufs immatures n’ont pas réussi à se développer davantage pendant la culture. Ces résultats suggèrent que les vers cultivés sont incapables de formuler de nouveaux œufs viables et que la maturation des œufs immatures préformés est également impossible par culture in vitro.
Les œufs de C. sinensis ont une taille de 28-31×13-16 µm, avec un opercule à son extrémité conique et un petit bouton aboperculaire. Dans la présente étude, les œufs expulsés ont montré un contour anormal car le ver a survécu plus longtemps. La longueur moyenne de l’œuf a été réduite progressivement et de manière significative dans la solution de Locke (27,49 ±0,48 µm) et dans tous les milieux de bouillon. La réduction de la longueur a entraîné une réduction de la valeur de l’IMF. L’IMF a été proposé comme paramètre pour l’analyse biométrique afin d’approximer le volume des œufs pour les douves hétérophyides et opisthorchiides. Dans la présente étude, les valeurs de l’IMF ont diminué au jour 60 dans la solution de Locke et au jour 90 dans les milieux en bouillon. La diminution des valeurs de l’IMF suggère une réduction du volume des œufs par un rétrécissement de la longueur et une dégénérescence du contenu. La plupart des œufs produits après 60 jours de culture in vitro étaient déformés et leur rapport longueur / largeur était inférieur à 1,7 et la valeur du FMI était inférieure à 7 000. La plupart de ces œufs ont été jugés non viables lorsqu’ils étaient colorés au bleu trypan. La culture pendant 60 jours pourrait être la période maximale de viabilité des œufs.
L’observation au microscope optique a révélé une accumulation de vacuoles et de masses sombres à l’intérieur de la coquille de l’œuf, la culture ayant duré plus de 60 jours. Les vacuoles et les masses sombres semblaient être des cellules vitellines déformées comme le montre O. viverrini. Ces matériaux dans les œufs suggèrent que les cellules vitellines ou d’autres matériaux formant des œufs ont dégénéré et que les œufs ont avorté. Les œufs matures qui forment le miracidium peuvent survivre longtemps, mais ceux qui ont avorté ne le sont pas. La dégénérescence des matériaux internes pourrait avoir induit une déformation et une réduction du volume des œufs. Une étude a révélé des œufs déformés chez des adultes gravides matures d’Echinostoma caproni stockés dans la solution de Locke jusqu’à 4 mois à 4 ° C. Une explication possible des changements ci-dessus peut être un bronzage incorrect de la quinone qui est associé au processus de formation de la coquille d’œuf. La culture in vitro à long terme peut avoir affecté ce processus enzymatique médié par la phénol-oxydase, ce qui a entraîné une déformation de la coquille de l’œuf. Ainsi, une culture in vitro prolongée de C. sinensis peut déformer les œufs ainsi que leur viabilité.
Les œufs matures de C. sinensis contiennent un bouton aboperculaire très discret. O. viverrini, une douve du foie étroitement apparentée, présente également un bouton aboperculaire très petit à légèrement développé des œufs. Dans la présente étude, le bouton aboperculaire de la coquille de l’œuf est devenu plus important dans la plupart des œufs après 60 jours d’incubation. L’apparition d’un bouton aboperculaire aussi proéminent était évidente chez la plupart des œufs dégénérés. Krejci et Fried ont démontré que le bouton aboperculaire peut être peu profond ou profondément enfoncé dans la coquille de l’œuf dans le cas d’Echinostoma caproni et d’E. trivolvis respectivement. Dans la présente étude, on n’a pas observé de gonflement du bouton aboperculaire entourant la coquille. Le bouton aboperculaire proéminent peut être une extension du bouton discret normal existant en réponse à la physiologie changeante des vers mourants. Pris ensemble, il est difficile pour les douves de produire des œufs viables normaux par culture in vitro.
La structure de surface des œufs, observée par SEM, semblait être une caractéristique morphologique appropriée pour comprendre l’état de la coquille de l’œuf. Chez les opisthorchiidés, la surface de l’œuf de C. sinensis est extrêmement sculptée pour créer des rides entrelacées de hauteur variable, ce qui contribue à l’accumulation de fibres aquatiques naturelles et à augmenter la possibilité de contact avec les hôtes des mollusques. Dans la présente étude, une diminution des rides de surface a été observée par la MEB des œufs avortés. Cette diminution des rides avec le bouton aboperculaire proéminent peut être le résultat d’un processus de dégénérescence de la coquille de l’œuf.
La présente étude présentait quelques limites. Il n’y avait pas de données directes sur la viabilité des œufs à comparer avec les changements morphologiques. L’éclosion in vitro des œufs peut donner des informations précises sur la viabilité des œufs, mais celle des œufs de C. sinensis est toujours incapable. Les données de morphologie et de physiologie des vers incubés étaient également limitées.
En conclusion, le C cultivé. les vers sinensis dans les milieux de bouillon passent des œufs viables pendant 60 jours qui sont préformés dans leur utérus pendant leur survie chez le lapin. Les œufs immatures préformés ne peuvent pas développer de miracidium par culture in vitro. Un adulte mature de C. sinensis contient environ 37 000 œufs dans l’utérus et produit environ 4 000 œufs par jour. Les œufs déformés dont la valeur IMF est inférieure à 7 000 et le rapport longueur/largeur inférieur à 1,7 ne sont pas viables.