1.4.1 Milieu d’homogénéisation
La perturbation cellulaire est généralement effectuée dans un milieu légèrement hypo-osmotique ou iso-osmotique pour préserver l’intégrité morphologique. Le saccharose est couramment utilisé comme osmotique pour empêcher les organites ou les vésicules subcellulaires de gonfler ou de rétrécir. Le mannitol et le sorbitol ont également été utilisés lorsqu’il a été constaté que le saccharose interférait avec l’analyse biochimique du composant subcellulaire. Le saccharose est préféré aux solutions salines car ces dernières ont tendance à agréger les organites subcellulaires. Les milieux hypo-osmotiques sont souvent utilisés dans l’isolement des fractions de membranes plasmiques car dans ces conditions, les cellules perturbées produisent des membranes plasmiques sous la forme de grands fantômes ou de feuilles. Cela réduit considérablement le degré élevé de variation de la taille de ces fragments avant la centrifugation. Bien que le milieu d’homogénéisation soit généralement de nature aqueuse, des milieux non aqueux tels que l’éther/chloroforme ont été utilisés pour isoler les organites subcellulaires. Cependant, les milieux non aqueux peuvent inactiver certaines enzymes et réduire l’intégrité morphologique de certains tissus.
Des agents chélatants (EDTA ou EGTA) peuvent être ajoutés au milieu d’homogénéisation pour éliminer les cations divalents, tels que Mg2+ ou Ca2+ qui sont requis par les protéases membranaires. Il est important de noter que les inhibiteurs de protéase doivent toujours être inclus dans le milieu car les réactifs EDTA et thiol peuvent activer certaines enzymes protéolytiques. Cependant, de nombreuses enzymes marqueurs membranaires ont besoin de ces cations pour leur activité et peuvent être inhibées après élimination des cations de l’extrait. L’addition de Mg2+ ou de Ca2+ au milieu d’homogénéisation maintient l’intégrité nucléaire. Cependant, ces ions peuvent provoquer une agrégation membranaire et diminuer le contrôle respiratoire dans les mitochondries.
La perturbation cellulaire des tissus végétaux libère souvent des phénols qui peuvent avoir plusieurs effets délétères sur les enzymes végétales. Les composés phénoliques végétaux comprennent essentiellement deux groupes : les composés phénylpropanoïdes (par exemple les tanins hydrolysables) et les flavonoïdes (par exemple les tanins condensés). Les composés phénoliques peuvent se lier à l’hydrogène avec des liaisons peptidiques de protéines ou subir une oxydation par la phénol oxydase en quinones. Les quinones sont de puissants agents oxydants qui ont également tendance à polymériser et à se condenser avec des groupes réactifs de protéines pour former un pigment sombre appelé mélanine qui constitue la base du brunissement des tissus végétaux. La fixation de la mélanine aux protéines peut inactiver de nombreuses enzymes. Les groupes hydroxyles phénoliques peuvent former des interactions ioniques avec les acides aminés basiques des protéines ou interagir hydrophobiquement avec les régions hydrophobes des protéines. Par conséquent, il est important d’éliminer les composés phénoliques le plus rapidement possible et cela est mieux réalisé en utilisant des adsorbants qui se lient aux phénols ou aux quinones ou en utilisant des agents protecteurs tels que le borate, le germanate, les sulfites et le mercaptobenzothiazole qui inhibent l’activité de la phénol oxydase. L’adsorbant de phénol, la polyvinylpyrrolidone, sous forme hydrosoluble ou sous forme de produit insoluble hautement réticulé « Polyclar », peut être ajouté au milieu d’isolement. La polyvinylpyrrolidone lie les composés phénoliques qui forment de fortes liaisons hydrogène avec les protéines. Il a également été rapporté que l’albumine sérique bovine réagissait avec les composés phénoliques végétaux et qu’elle était également un piégeur efficace de la quinone.
Le fractionnement des cellules ou des tissus est invariablement effectué à +4 ° C pour réduire l’activité des protéases membranaires. Les protéases peuvent être subdivisées en endopeptidases et exopeptidases. Les endopeptidases, qui sont des enzymes qui clivent les liaisons peptidiques internes, comprennent: les protéases acides qui ont un pH optimal de pH 2,5 à 3,8 et peuvent être inhibées par l’inhibiteur de l’état de transition pepstatine; les protéases de sérine qui peuvent être inhibées par le diisopropylfluorophosphate et le phénylméthylsulfonylfluorure; et les protéases de sulfhydryle qui sont inhibées par le N-éthylmaléimide ou l’E-64 (l-trans-époxysuccinyl-leucylamide – butane). Des exemples d’exopeptidases comprennent les carboxypeptidases présentes dans la plupart des tissus végétaux et qui hydrolysent facilement la plupart des acides aminés C-terminaux. Toutes les carboxypeptidases végétales étudiées à ce jour sont inhibées par le diisopropylfluorophosphate. Des aminopeptidases, des dipeptidases et des tripeptidases ont également été identifiées chez les plantes. D’autres composés utilisés dans les milieux d’homogénéisation comprennent des agents réducteurs de disulfures tels que le 2-mercaptoéthanol, le dithiothréitol, le dithioérythritol, le glutathion réduit ou la cystéine. En effet, de nombreuses enzymes contiennent un groupe sulfhydryle essentiel au site actif qui doit rester réduit pour maintenir l’activité enzymatique. De nombreux problèmes d’isolation des organites sont associés à la rupture des membranes fragiles, par exemple le tonoplaste entourant la vacuole. Outre la destruction physique de ces membranes, les tissus végétaux contiennent des enzymes lipolytiques actives qui peuvent attaquer directement les composants lipidiques des membranes et perturber les organites. Les acides gras libres libérés par l’action hydrolytique des hydrolases d’acyl peuvent inhiber les activités atpases des mitochondries, des chloroplastes et de la membrane plasmique. D’autres effets délétères des acides gras sont également bien établis. Certaines conditions peuvent réduire la dégradation des lipides par les lipases et les acylhydrolases lipolytiques chez les plantes. Ceux-ci comprennent l’utilisation (1) d’un milieu d’isolement avec un pH de 7.5-8 où la plupart des enzymes lipolytiques et des lipooxygénases présentent peu d’activité, (2) des agents chélateurs tels que l’EDTA, car de nombreuses phospholipases sont dépendantes du Ca2 +; de nombreuses enzymes lipolytiques, cependant, ne sont pas affectées par les agents chélateurs et (3) d’autres additifs tels que des antioxydants pour prévenir la dégradation oxydative des hydroperoxydes d’acides gras, des agents réducteurs de disulfures, des inhibiteurs d’enzymes spécifiques et l’utilisation de sérum albumine bovine sans acides gras qui lie les acides gras libres. Chaque milieu d’homogénéisation individuel est différent et peut contenir des inhibiteurs spécifiques pour des enzymes telles que les phospholipases ou les phos-phatases. Le glycérol, par exemple, est souvent ajouté au milieu d’isolement afin d’inhiber la phosphatase de l’acide phosphatidique. L’éthanolamine et le chlorure de choline sont couramment utilisés pour inhiber la phospholipase D.
La capacité tampon du milieu d’homogénéisation pour le fractionnement des cellules végétales doit être élevée afin de compenser la libération d’acides organiques par la vacuole perturbée qui constitue un volume important de la cellule. Le milieu d’homogénéisation peut être formulé soit par évaluation empirique, soit par analyse rationnelle. Par exemple, pour s’assurer que la protéine purifiée concernée reste intacte, tous les principaux inhibiteurs des protéases peuvent être ajoutés au milieu d’homogénéisation ou bien des solutions physiologiques peuvent être copiées. Comme le pH cytoplasmique de la cellule végétale est d’environ 7,5-8,0, le milieu d’homogénéisation doit refléter l’état physiologique de la cellule et est donc faiblement tamponné au pH cytoplasmique.