Mesure comparative de CNP et de NT-proCNP dans des échantillons de sang humain: une évaluation méthodologique

Introduction

Peptide natriurétique de type C (CNP), identifié en 1990 par Sudoh et al., est le membre le plus ancien de la famille des peptides natriurétiques. Le CNP stimule sélectivement le récepteur peptidique natriurétique humain 2 (NPR2), qui active la kinase cGMP-dépendante (cGK) en élevant la concentration intracellulaire de cGMP. De plus, la CNP lie la NPR3 et à son tour désactive la protéine kinase A par inhibition dépendante de la protéine Gi de l’adénylate cyclase. Le CNP a des propriétés anti-prolifératives et anti-migratoires et a également été identifié comme un facteur relaxant dérivé de l’endothélium. De plus, la PCN inhibe la resténose néointimale, réduit le remodelage constrictif vasculaire et les lésions d’ischémie-reperfusion cardiaque. La PCN joue un rôle important dans la croissance osseuse, la reproduction, la croissance nerveuse, la ré-endothélialisation, ainsi que la fonction rénale, pancréatique et cardiaque. De plus, la CNP a récemment été reconnue comme impliquée dans le développement de la formation de plaques athérosclérotiques.

En raison de la pléthore de fonctions CNP, ce peptide a suscité un intérêt croissant dans la recherche cardiovasculaire au cours des dernières années. Cependant, les études concernant les concentrations de CNP dans les échantillons sanguins sont incohérentes. Certaines de ces études ont mesuré les concentrations de CNP ou de son pro-peptide amino-terminal (NT-proCNP) dans des échantillons de sérum et d’autres ont utilisé des échantillons de plasma. Malheureusement, les détails sur les retards potentiels lors des prélèvements sanguins et du traitement ultérieur des échantillons n’ont pas encore été rapportés. Dans la littérature disponible jusqu’à présent, il n’existe aucune donnée sur la différence des concentrations de CNP / NT-proCNP entre les échantillons sériques et plasmatiques. En outre, l’influence du retard du traitement des échantillons de sang reste incertaine. De plus, la concentration de CNP dans les échantillons de sérum et de plasma variait considérablement (tableau 1). Par conséquent, l’objectif de cette étude était de répondre aux questions méthodologiques suivantes: (1) Le traitement retardé des échantillons de sang stockés à température ambiante provoque-t-il un biais? (2) Existe-t-il une différence entre les concentrations sériques et plasmatiques de CNP ou de NT-proCNP? (3) Ces différences dépendent-elles du temps?

Méthodes

Nous avons étudié 12 volontaires masculins (âge moyen 29 ± 2 ans, poids normal, pas de traitement médicamenteux, pas d’antécédents de maladies cardiovasculaires ou autres, 3 fumeurs). De tous les sujets étudiés, un consentement éclairé a été obtenu. Des triplés d’échantillons de sang à jeun ont été prélevés sur tous les volontaires à 8 heures du matin. Des échantillons de sang ont été prélevés à l’aide du système de collecte S-Monovette® de 7,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne) contenant soit un activateur de coagulation (Kaolin) pour les échantillons de sérum, soit du citrate de sodium pour les échantillons de plasma ou du Potassium-EDTA pour les échantillons de sang complets. Tous les échantillons pour les analyses de base ont été immédiatement centrifugés à 2 000 × g pendant 10 min à 4 ° C et le surnageant a été stocké à -70 ° C jusqu’à l’analyse. Pour les analyses à mi-parcours (30 minutes ou 2 heures), des échantillons de plasma ont été centrifugés à 2000 × g pendant 10 min à température ambiante. Le surnageant a été retiré et conservé à température ambiante pendant 30 min ou 2 heures. Après la coagulation du sang, les échantillons de sérum ont été traités de manière identique aux échantillons de plasma. Le surnageant a été conservé et également stocké à température ambiante pendant 30 min ou 2 heures. Des échantillons de sang complets ont été stockés à température ambiante sans centrifugation. Après 30 min ou 2 heures, des échantillons sanguins complets ont été centrifugés à 2000 ×g pendant 10 min à 4°C. Le surnageant a été retiré et stocké à -70°C jusqu’à analyse. La concentration de CNP a été mesurée à l’aide du kit EIA CNP-22 (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Allemagne) selon le protocole du fabricant. La concentration de NT-proCNP a été mesurée à l’aide du kit d’EIE NT-proCNP (Biomedica, Vienne, Autriche) selon le protocole du fabricant. L’ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour la comparaison entre les groupes. Pour les comparaisons par paires, le test t a été appliqué. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (SD) ou d’intervalle de confiance à 95 % (IC à 95 %). La signification statistique a été supposée à p < 0,05. Les données ont été analysées à l’aide de MedCalc® pour Windows, Version 10.0.1.0 (Logiciel MedCalc, Mariakerke, Belgique).

Résultats

Comme le montre la figure 1a, les concentrations de base de CNP dans le sérum, le plasma et les échantillons de sang complets étaient de 0,997 ± 0,379 ng / ml, 1,933 ± 0,699 ng / ml et 0,991 ± 0,489 ng / ml, respectivement. Les concentrations plasmatiques de CNP étaient significativement plus élevées que les échantillons de sérum et de sang complet à tous les points de temps (ANOVA, p = 0,001 à l’inclusion, p < 0,001 à 30′ min. et p = 0,003 à 120′ min.). Aucune différence significative n’a été observée entre les échantillons de sérum et de sang complet à aucun moment (ANOVA, p > 0,05). Les concentrations initiales de NT-proCNP dans le sérum, le plasma et les échantillons sanguins complets étaient de 58,5 ± 28,3 pg/ml, 60,3 ± 23,9 pg/ml et 50,7 ± 21,4 pg/ml, respectivement (figure 1b). Aucune différence significative n’a été trouvée entre les groupes à aucun moment (ANOVA, p > 0,05). Dans les échantillons sanguins complets, la concentration de lactate a augmenté de manière significative après 2 heures par rapport à la valeur de base (3,2 ± 0,8 mm vs 2,0 ± 0,6 mM, p < 0,001). De plus, la valeur du pH a diminué de 7,34 ± 0.03 au départ à 7,29 ± 0,03 après 2 heures (p < 0,001).

Discussion

Notre étude a révélé que le CNP et le NT-proCNP sont stables dans le sérum et dans les échantillons de sang complets pendant au moins deux heures à température ambiante. Par conséquent, la stabilité du peptide CNP n’est probablement pas affectée par un retard dans le traitement de l’échantillon pendant au moins deux heures. Il a déjà été signalé que le ProCNP (protocole du fabricant, conditions de stockage inconnues des échantillons de sang) était stable pendant au moins 2,5 heures. En conséquence, nos expériences ont confirmé la stabilité du NT-proCNP même à température ambiante. La concentration de NT-proCNP dans tous les types d’échantillons est restée constante pendant une durée allant jusqu’à 2 heures, ce qui indique une stabilité durable de cette protéine. Comme indiqué dans le tableau 1, la concentration moyenne de NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg/ml) mesurés dans cette étude se situaient dans la fourchette indiquée (voir tableau 1) chez les individus en bonne santé (3,7 à 432 pg/ml).

Contrairement au NT-proCNP, la concentration de CNP était significativement plus élevée dans les échantillons de plasma que dans les échantillons de sérum et de sang complet (figure 1). Jusqu’à présent, ni notre groupe ni le service technique des fabricants n’ont trouvé de preuve concernant l’influence du type d’échantillon sur le test ELISA utilisé dans cette étude. Cependant, à l’inclusion, le surnageant de plasma et les échantillons de sang complets étaient identiques à l’exception du type d’inhibiteur de la coagulation sanguine utilisé. Cet inhibiteur était le citrate de sodium dans le groupe plasmatique et l’EDTA dans le groupe de l’échantillon sanguin complet. Les échantillons sanguins complets ont révélé des résultats comparables aux échantillons de sérum (p = 0,98). Par conséquent, il est fort probable que le citrate de sodium puisse influencer de manière significative la concentration mesurée de CNP dans le plasma et par conséquent falsifier les résultats obtenus par cette technique.

De façon inattendue, les concentrations initiales de CNP dans les échantillons de plasma et de sérum étaient environ mille fois plus élevées que dans les autres rapports (tableau 1). Dans toutes ces études, le dosage Radio-immunologique (RIA-Kit) a été utilisé pour la détermination des concentrations de CNP. En revanche, dans deux autres études, les concentrations mesurées de CNP dans les échantillons de sérum et de plasma étaient comparables à nos résultats en ce qui concerne l’ampleur de la dimension. Fait intéressant, dans ces dernières études, le même kit ELISA a été utilisé que dans notre enquête. Même après une évaluation approfondie de divers facteurs internes et externes, aucune explication satisfaisante de cet écart n’a pu être trouvée. Les mesures de contrôle utilisant la CNP exogène dans le sérum humain ont révélé une erreur de mesure non significative de +7,8% (95%–KI:-). Le peptide CNP utilisé pour la courbe de référence a été synthétisé par le fabricant lui-même (Phoenix). En revanche, le peptide CNP utilisé comme témoin « exogène » a été fourni par Bachem. Comme l’ont assuré les deux fabricants, les séquences d’acides aminés étaient identiques et des liaisons disulfures se sont formées dans les deux peptides.

Cependant, les résultats des mesures de contrôle interne peuvent être résumés comme suit: Tout d’abord, les mesures de contrôle effectuées dans notre étude ont révélé que les kits ELISA ont été utilisés correctement, conformément aux instructions du fabricant. Deuxièmement, les mesures effectuées à l’aide d’échantillons témoins ont confirmé la pertinence de la courbe standard appliquée. Troisièmement, les échantillons de sérum témoins contenant de la CNP exogène ont révélé une précision acceptable et les résultats se situaient dans l’ordre de grandeur attendu. Quatrièmement, une concentration plus élevée de CNP dans les échantillons de plasma est très probablement un artefact causé par le citrate de sodium.

Comme l’ont rapporté Clerico et ses collègues, des différences de résultats relativement importantes entre les différentes méthodes de RIA et d’EIE sont également connues, par exemple ANP et BNP. Clerico et ses collègues ont conclu que les grandes différences dans ces résultats sont très probablement dues à la spécificité des anticorps monoclonaux ou polyclonaux utilisés, à la conception du système d’immunoessai (dosage compétitif vs non compétitif), à la matrice analytique (sérum vs EDTA vs plasma héparinisé) utilisée et à la pléthore de formes circulantes de peptides natriurétiques, comme indiqué précédemment pour les immunoessais ANP et BNP. Ces sources méthodologiques de biais peuvent également être envisageables pour les dosages CNP et NT-proCNP et expliquent ainsi la grande différence de résultats dans les études citées (tableau 1).

Limites de l’étude

Nous reconnaissons qu’une taille d’échantillon de 12 est trop petite pour conclure qu’il n’y a aucune différence. Cependant, d’un point de vue statistique, il serait important de préciser à quel point la différence doit être importante pour avoir une pertinence médicale. A notre connaissance, ce dernier n’est pas encore clairement défini. Par conséquent, les moyennes et les intervalles de confiance à 95% de toutes les mesures ont été donnés dans la figure pour permettre à chaque lecteur de tirer également sa propre interprétation des données.

En ce qui concerne les concentrations sériques et plasmatiques, il faut mentionner que les valeurs rapportées dans le tableau 1 ont été mesurées avec différentes méthodes (RIA, ELISA) chez des patients souffrant de différentes maladies. Il aurait été très utile de comparer CNP-RIA avec des tests CNP-ELISA utilisant directement les mêmes échantillons, car une différence de mille fois l’ordre de grandeur reste perceptible. Malheureusement, les mesures des dosages RIA n’étaient pas disponibles dans notre laboratoire. Pour la concentration de NT-proCNP, cette dernière comparaison a été étudiée par Olney et ses collègues montrant que l’ELISA commercial (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Vienne, Autriche) donnait des valeurs qui étaient en moyenne de 21% (entre 11 et 52%) des valeurs de RIA. La validation croisée de l’étalon de référence du kit ELISA à l’aide du test RIA a montré un désaccord de 15%.

Résumé

Les mesures de CNP et de NT-proCNP n’ont probablement pas été affectées par le retard de la procession de l’échantillon ou le type d’échantillon de sang (sauf pour la CNP dans les échantillons de plasma). Pour les échantillons de plasma, seuls les échantillons de sang anticoagulé EDTA convenaient au test ELISA CNP utilisé dans cette étude. Par conséquent, la concentration de CNP et de NT-proCNP pourrait être utilisée dans des applications cliniques afin de déterminer les effets de la CNP. Il faut également considérer que la concentration de NT-proCNP, n’étant qu’un sous-produit du peptide actif, peut masquer la véritable nature de la CNP. Cependant, la divergence dans les concentrations mesurées de CNP déterminées soit par des dosages RIA, soit par des dosages ELISA reste encore inexpliquée, mais semble probablement être due à des problèmes méthodologiques. Par conséquent, comme recommandé pour l’ANP et le BNP, les dosages immunologiques pour la CNP doivent également être normalisés ou harmonisés à l’avenir.