L’ototoxicité du cisplatine implique des cytokines et un réseau de signalisation STAT6

Réactifs

Le cisplatine et le bromure de 3-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényl-tétrazolium (MTT) ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, USA ). Les matériaux de culture plastique ont été achetés auprès de Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, États-Unis). Le milieu essentiel modifié (DMEM) de Dulbecco, le sérum fœtal bovin (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) et d’autres réactifs de culture tissulaire ont été obtenus auprès de Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, États-Unis). La protéine IL-4 et IL-13 de souris recombinante, les anticorps contre l’IL-4, l’IL-13, le TNF-α, l’IL-1β, l’IL-6 et les kits de dosage immuno-enzymatique (ELISA) (QuantikineR) pour les cytokines ont été achetés auprès de R& D Systems Inc. (Minneapolis, MN, États-Unis). Ces anticorps ont été utilisés en immunohistochimie à une concentration de 1:200. Les anticorps dirigés contre p-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) et IkB ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, Californie, États-Unis).

Culture et viabilité des cellules

L’établissement et la caractérisation des cellules auditives HEI-OC1 immortalisées sous condition ont été décrits dans notre rapport précédent 1. L’expression de marqueurs spécifiques à l’OHC tels que Math1 et la Myosine 7a suggère que les cellules HEI-OC1 représentent des précurseurs de l’OHC. Les cellules HEI-OC1 ont été maintenues dans du DMEM à haute teneur en glucose (Gibco BRL) contenant 10% de FBS. Pour les expériences décrites ci-dessous, des cellules HEI-OC1 ont été cultivées dans les conditions permissives suivantes : 33 °C et 5% de CO2 dans du DMEM additionné de 10% de FBS. Des cellules (3 × 104 cellules / puits d’une plaque à 24 puits) ont été incubées avec du cisplatine de 20 µM pendant 24 h. Pour déterminer la viabilité cellulaire, du MTT (0,25 mg) a été ajouté à une suspension cellulaire de 1 ml pendant 4 h. Après lavage des cellules et trois lavages avec du PBS (pH 7,4), le produit insoluble du formazan a été dissous dans du DMSO. La densité optique (DO) de chaque puits de culture a ensuite été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) à 590 nm. La DO des cellules témoins a été prise pour indiquer une viabilité à 100%. Pour examiner les effets de diverses cytokines, des anticorps neutralisants contre les cytokines ont été ajoutés aux cultures pendant 30 min, après quoi ils ont été cultivés avec du cisplatine 20 µM pendant 24 h.

Animaux

STAT4−/− (génération N10 de rétrocroisement), STAT6− /− (génération N6 de rétrocroisement) et des souris WT BALB / c ont été achetés au laboratoire Jackson (Bar Harbor, ME, USA). Les souris KO STAT4 et STAT6 homozygotes ont été identifiées par PCR. Les souris KO n’ont montré aucune anomalie de développement. Des expériences ont été réalisées sur des souris âgées de 6 semaines et toutes les souris ont été appariées en fonction de l’âge dans les 3 jours. Des souris ont reçu un régime alimentaire commercial standard alors qu’elles étaient logées à une température ambiante de 20-22 ° C et une humidité relative de 50 ± 5% sous un cycle lumière/ obscurité de 12: 12 h dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes. Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’École de médecine de l’Université de Wonkwang.

Essai de rapport de la luciférase

Des cellules ont été transitoirement transfectées avec le plasmide rapporteur de la luciférase NF-kB à l’aide du réactif de transfection, la Lipofectamine 2000. Après 36 h d’incubation, les cellules ont été traitées par du cisplatine pendant 12 h en présence d’anticorps neutralisants à base de cytokines. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du tampon PBS puis lysées dans du tampon de lyse rapporteur (Promega, Madison, WI, USA). Une aliquote de 20 µl du lysat a ensuite été mélangée à 100 µl de réactif de dosage de la luciférase, après quoi l’intensité lumineuse émise a été mesurée à l’aide d’un luminomètre AutoLumat LB953 (EG et G Berthold, Bad Wildbad, Allemagne). Enfin, l’activité luciférase a été mesurée en triplicate, moyennée, puis normalisée par rapport à l’activité β-galactosidase en utilisant le système de dosage de la galactosidase (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) selon les instructions du fabricant.

Transfection avec des constructions d’ARNsi

Des ARNSI prédéfinis contre des souris STAT4, STAT6 et des ARNSI brouillés témoins ont été achetés à Santa Cruz Biotechnology. Les brins de sens des siRNA contre STAT4 et STAT6 sont les suivants. La construction de siRNA STAT4 est un pool de trois séquences d’ARNsi comme suit: Brin de Sens Duplex 1: 5′-IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA A-3′, Brin de Sens Duplex 2: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA A-3′, et Brin de Sens Duplex 3: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3′ (Numéro d’accession de l’ARNm: NM_011487). La construction de siRNAs STAT6 est un pool de trois séquences d’ARNsi comme suit: Brin de Sens Duplex 1: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Brin de Sens Duplex 2: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG A-3′, et Brin de Sens Duplex 3: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG A-3′ (Numéro d’accession de l’ARNM: NM_009284). Des cellules ont été transitoirement transfectées avec 100 nM de constructions d’ARNsi dans un réactif de transfection d’ARNsi X-tremeGENE (Roche Applied Science, Penzberg, Allemagne) selon le protocole du fabricant. Après incubation à 33 °C et 5% de CO2 pendant 36 h, les cellules ont ensuite été traitées avec du cisplatine pendant 24 h. Les échantillons ont ensuite été préparés et analysés pour analyse de viabilité ou Western blot. L’interférence d’expression a été confirmée par l’analyse immunoblot.

Mesure des cytokines pro-inflammatoires par ELISA

Pour mesurer la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires à partir des cellules traitées au cisplatine, des surnageants de culture ont été récoltés à chaque instant et les taux de cytokines pro-inflammatoires sécrétées ont ensuite été déterminés par ELISA (kits de cytokines Quantikine; R& Systèmes D Inc.) selon les instructions du fabricant.

Préparation d’extraits cytosoliques et nucléaires

Les cellules ont été lavées avec du PBS glacé, grattées et centrifugées à 1 000×g pendant 5 min à 4 °C. Le culot cellulaire a ensuite été remis en suspension dans 200 µl de tampon de lyse (HEPES 10 mM, pH 7,9, MgCl2 1,5 mm, KCl 10 mm, fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,5 mM, et 0,5 mm de dithiothréitol) puis incubé sur glace pendant 15 min. En fin d’incubation, 10 µl de NP-40 à 10% ont été ajoutés et le tube a été vortexé pendant 10 s. Après centrifugation à 13 000×g pendant 1 min à 4 °C, le surnageant (extrait cytosolique) a été recueilli et stocké à -80 °C, tandis que le culot a été traité pour obtenir les extraits nucléaires. Le culot a ensuite été remis en suspension dans du tampon d’extraction (HEPES 5 mM, pH 7,9, MGCL 2 1,5 mm, fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,5 mm, EDTA 0,2 mm, dithiothréitol 0,5 mm et glycérol 25% (vol/vol)) et incubé pendant 30 min à 4 °C. Des extraits nucléaires ont été isolés par centrifugation à 13 000 g pendant 30 min à 4 °C. Le surnageant a ensuite été retiré et stocké à -80 °C jusqu’à son utilisation pour l’analyse par western blot. Enfin, la concentration en protéines a été déterminée par la méthode Lowry.

Analyse Western blot

L’analyse Western blot a été effectuée comme suit. Brièvement, les cellules ont été récoltées et lavées deux fois avec du PBS glacé. Les lysats fractionnés total et nucléaire/cytosolique ont ensuite été soumis à une électrophorèse sur gels SDS-polyacrylamide à 12% pendant 3 h à 20 mA, après quoi ils ont été transférés sur nitrocellulose. La membrane a ensuite été incubée dans 5% (poids / vol) de protéines de lait séchées dans du PBS contenant 0,05% (vol / vol) de Tween-20 (PBS-T) pendant 1 h, après quoi elles ont été lavées dans du PBS-T, puis ont réagi avec un anticorps primaire (1: 1 000) pendant 1 h. Ensuite, la membrane a été largement lavée avec du PBS-T, puis incubée avec un anticorps anti-IgG de lapin conjugué à HRP (1: 3 000) pendant 1 h. Après des lavages extensifs, des bandes protéiques sur le les membranes ont été visualisées à l’aide de réactifs chimiluminescents selon les instructions du fabricant (Substrat Supersignal; Pierce, Rockford, IL, USA).

Expérience in vivo de l’ototoxicité du cisplatine

Toutes les souris ont été divisées au hasard en deux groupes de six souris chacun. Les animaux du groupe 1, considérés comme un groupe témoin, ont reçu une injection intrapéritonéale de PBS. Les animaux du groupe 2 ont reçu du cisplatine (4 mg/ kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale pendant 4 jours consécutifs. Les animaux ont ensuite été tués sous anesthésie au gaz CO2 le lendemain de l’injection finale de cisplatine, après quoi l’os temporal de l’oreille droite a été retiré.

Mesure de l’ABR

Pour une analyse plus approfondie du seuil auditif, l’ABR a été mesuré avant et 24 h après le traitement final du cisplatine. On a ensuite comparé les variations du seuil d’ABR entre le pré-traitement et le post-traitement. Des souris ont été anesthésiées à l’aide d’un cocktail de kétamine (40 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) et maintenues au chaud avec un coussin chauffant pendant l’enregistrement ABR. Une électrode à aiguille sous-cutanée (active) a été insérée au sommet, tandis que des électrodes de masse et de référence ont été insérées sous-cutanée dans la peau lâche sous les pennes des oreilles opposées. Les stimuli de test consistaient en des éclats de tonalité de phase alternée à des fréquences de 4, 8, 16 et 32 kHz. Les signaux ont été générés à l’aide du logiciel Siggen de Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA). Chaque rafale de tonalité (durée de 1 ms) était fermée à travers une fenêtre de Blackmann et avait un temps de montée-descente de 0,5 ms sans plateau. Les stimuli ont été calibrés avant chaque séance de test, en enregistrant la sortie du haut-parleur avec un microphone placé au niveau de la tête des animaux. Les formes d’onde ABR ont été moyennées en réponse à 300 salves de tonalité à chaque fréquence testée. A chaque fréquence, l’amplitude du signal était automatiquement atténuée par pas de 10 dB à partir de 90 dB SPL jusqu’à ce que les ondes ABR disparaissent dans des traces enregistrées avec des réglages de filtre de 100-3 000 Hz. Le jugement du seuil a été rendu hors ligne par deux observateurs indépendants et aveugles expérimentalement sur la base des enregistrements ABR.

Préparation de surface de l’organe des explants Corti

Toutes les souris ont été tuées le lendemain de l’injection finale de cisplatine. L’os temporal a été disséqué et fixé dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 16 h à 4 ° C, et rincé avec 0,1 M de PBS. L’os temporal a été décalcifié avec 10% d’EDTA dans le PBS pendant 3 jours. La cochlée a été soigneusement disséquée. Ensuite, la strie vascularis et le ligament spiral ont été disséqués, laissant l’organe de Corti. Le tour moyen de la cochlée a été immergé dans de la phalloïdine marquée TRITC (Sigma P1951, 1:100) dans du PBS pendant 20 min. Après trois lavages au PBS, l’échantillon a été examiné au microscope à fluorescence à l’aide de filtres appropriés pour le TRITC (excitation: 510-550 nm, émission: 590 nm).

Coloration immunohistochimique et dosage de TUNEL

L’os temporal retiré a été fixé dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 16 h puis décalcifié avec de l’EDTA à 10% dans du PBS pendant 2 semaines, après quoi il a été déshydraté et incorporé dans de la cire de paraffine. Des sections de 5 µm ont été deparaffinisées dans du xylène et réhydratées par des concentrations graduées d’éthanol. Pour l’étude d’immunohistochimie, un kit d’immunohistochimie (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, USA) a été utilisé et les procédures ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant. La peroxydase endogène est ensuite bloquée par du peroxyde d’hydrogène à 3% pendant 5 min à température ambiante (TA). Après lavage des coupes dans du PBS, la liaison non spécifique a été bloquée par de l’albumine sérique bovine à 1% pendant 1 h. Des anticorps primaires (dilués au 1: 200) ont ensuite été ajoutés aux lames, après quoi l’incubation s’est déroulée pendant 1 h. Après des lavages répétés avec du PBS, les coupes ont été incubées avec un anticorps secondaire biotinylé pendant 30 min puis recouvertes pendant 30 min d’un anticorps secondaire contenant de la peroxydase de raifort. Enfin, les coupes ont été colorées dans une solution de substrat fraîchement préparée (3 mg de 3-amino-9-éthylcarbazole dans 10 ml de tampon acétate de sodium (pH 4,9), 500 µl de diméthylformamide, peroxyde d’hydrogène à 0,03%) pendant 5 min. Les noyaux des cellules immunosolées ont ensuite été contre-colorés avec l’hématoxyline de Mayer (Sigma-Aldrich Co.). Des cellules apoptotiques ont été détectées in situ à l’aide du test TUNEL (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Allemagne). Brièvement, une section a été deparaffinisée et réhydratée. Après incubation avec 20 µg /ml de protéinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne), la peroxydase endogène a été bloquée en incubant les échantillons dans du H2O2 à 2% dans du méthanol pendant 30 min à TA. Ensuite, les coupes de tissus ont été lavées dans du PBS et incubées avec une solution de marquage pendant 1 h à 37 ° C. Les noyaux ont ensuite été contre-colorés avec de l’iodure de propidium (0,5 µg/ml, Sondes moléculaires) pendant 10 min à TA. Après des lavages avec du PBS, l’échantillon a été examiné au microscope à fluorescence.

Amplification de la transcriptase inverse-PCR

Pour la PCR cochléaire, l’os temporal de l’oreille gauche a été rapidement récolté et immergé dans du RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) jusqu’à une utilisation à -20 °C. Ensuite, des cochlées entières ont été disséquées et utilisées pour extraire l’ARN total par l’utilisation de TRIzol (Invitrogen) selon les protocoles du fabricant. Après extraction de l’ARN total à l’aide de Trizol (Invitrogen), l’ADNc simple brin a été synthétisé à partir de l’ARN total. Ensuite, la PCR avec l’ADN polymérase Taq (Takara, Takara Shuzo, Japon) a été réalisée en soumettant les échantillons à 30 cycles de 95 ° C pendant 40 s, 58 ° C pendant 40 s et 72 ° C pendant 50 s. Dix microlitres des produits de PCR ont ensuite été séparés sur gel d’agarose à 1,2% et visualisés sous lumière UV. Les séquences des amorces utilisées pour l’amplification par PCR étaient les suivantes: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, inverse, 5′ – IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3′).

Analyse statistique

Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois, et toutes les valeurs rapportées représentent les moyennes ± SD des analyses triples. L’analyse statistique multivariée a été réalisée par analyse de la variance et des tests de Duncan, à l’aide du logiciel statistique SPSS 11 (Chicago, IL, USA). L’ANOVA bidirectionnelle et / ou l’ANOVA unidirectionnelle ont été utilisées pour déterminer la signification des résultats. Les résultats statistiques ont été examinés par un biostatisticien de niveau master. Valeurs de P < 0.05 étaient considérés comme statistiquement significatifs.