Lettres oncologiques

Introduction

Le cancer du poumon est le cancer le plus fréquent après le cancer du sein et du côlon dans le monde (1). L’incidence du cancer du poumon est similaire aux taux de mortalité de cette maladie en raison de la mortalité élevée du cancer du poumon. Selon les données disponibles auprès du Centre international de recherche sur le cancer, le nombre annuel de décès par cancer du poumon devrait atteindre environ 10 millions d’ici 2030(2).Le type de cancer du poumon le plus courant histologiquement estl’adénocarcinome, qui représente près de 50% de tous les cancers du poumon (3).

Histologiquement, il existe deux principaux types de cancer du poumon, le carcinome pulmonaire à petites cellules (SCLC) et le carcinome non SCLC (CPNPC). Le SCLC représente environ 20% de tous les cas de cancer du poumon, tandis que le CLC représente près de 80% des cas de cancer du poumon (4). Il existe trois sous-types histologiques de NCSCL: i) carcinome épidermoïde (CSC), ii) adénocarcinome et iii) carcinome pulmonaire à grandes cellules, représentant chacun 25, 40 et 15% du total des cas de CPSCN, respectivement (5).

Malgré la reconnaissance du cancer du poumon comme l’un des types de cancer les plus agressifs, les résultats cliniques progressent lentement, même si un grand nombre de nouveaux médicaments sont disponibles. Les problèmes les plus importants pour cet inconvénient dans la prise en charge clinique du cancer du poumon sont l’indisponibilité de marqueurs tumoraux du sérum validés, utiles à la fois dans le diagnostic et la grossesse de la maladie (6). De nombreux types de tumeurs malignes provoquent des épanchements pleuraux, et les cancers qui métastasent le plus souvent à la plèvre sont les carcinomes pulmonaires et mammaires et les lymphomes. Même si l’examen cytologique de l’effusion pleurale est considéré comme une approche standard pour le diagnostic, sa sensibilité n’est généralement que de 50 à 70% (7,8).

Un certain nombre de marqueurs tumoraux, y compris l’antigène carcinoembryonique (CEA), l’antigène glucidique 125 (CA125) et le CYFRA21-1, un fragment de cytokératine 19 (CK19), ont été évalués comme marqueurs tumoraux meilleurs et plus précis dans le sérum ainsi que dans le liquide pleural dans de nombreuses études (7,8). Il a également été observé qu’une combinaison de deux marqueurs ou plus est plus puissante qu’un seul marqueur. Cependant, le pouvoir de prédiction réel de ces marqueurs n’a pas été évalué dans de nombreuses de ces études, car la présence cytologique de cellules tumorales a été détectée dans les épanchements pleuraux des patients (9-11). De nombreux marqueurs susmentionnés se sont avérés élevés dans les effets pleuraux des patients cancéreux par rapport aux effets pleuraux bénins (7). Les cellules cancéreuses du poumon humain dérivées de l’effusion pleurale se sont avérées plus envahissantes et métastatiques que les cellules cancéreuses des lésions primaires et cette différence peut être liée à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT).

L’EMT, qui joue généralement un rôle important dans la morphogenèse tissulaire embryonnaire et dans la fibrose post-lésion (12,13), est réactivée de manière inappropriée pendant l’allaitement dans certaines conditions pathologiques telles que le cancer et contribue à la métastase tumorale (13). L’EMT est connue pour médier les nombreuses altérations et la modulation du phénotype qui en résulte dans l’architecture tumorale. L’EMT est caractérisée par la perturbation de l’adhésion intercellulaire, une motilité élevée des cellules tumorales, une diminution de la sensibilité à l’anoïkis et à l’apoptose et dans la libération de cellules à partir du tissu épithélial (9-11). Les cellules tumorales libérées, qui sont résistantes aux anoïkis, assument un phénotype de type mésenchymateux susceptible de migration, d’invasion et de dissémination, contribuant toutes à la progression métastatique. Dans de nombreux cas, le degré d’EMT des cellules cancéreuses détermine la gravité du cancer (14). Il a également été démontré que l’EMT était impliquée dans la résistance à l’anoikis, ce qui est essentiel dans l’inhibition des métastases cancéreuses dans diverses tumeurs solides (15).

Les cytokératines (CKs) sont des marqueurs tumoraux courants et sontles principaux éléments structurels du cytosquelette dans les cellules épithéliales, et sur la base des propriétés structurelles CKs, il existe 20 sous-types. Parmi ceux-ci, CK19 est un CK soluble et acide de type I et est exprimé dans la muqueuse épithéliale de l’arbre bronchique et est connu pour être surexprimé dans les tissus du cancer du poumon (16). Il y a une dégradation élevée de la CK19 dansles cellules épithéliales transformées plastiquement en raison de l’activité accrue de la caspase-3, et les fragments protéolytiques, en particulier CYFRA21-1, sont libérés dans le sang. On considère que la CK19 est étroitement associée au cancer du poumon; cependant, certaines études ont rapporté que l’expression de la CK19 était négative dans certains cancers du poumon (9-11). L’expression de CK19 dans certaines lignées de cellules cancéreuses du poumon a été réduite suite à l’EMT induite par le facteur de croissance transformant (TGF)-β (17). Les niveaux circulants de fragments de CK19, y compris CYFRA21-1, reflètent probablement l’étendue de la formation du cytosquelette dans les cellules cancéreuses et peuvent également s’associer au degré de différenciation tumorale vers l’épithélium squameux (16).

Dans la présente étude, des échantillons tumoraux de 111 patients atteints de cancer du poumon ont été utilisés, et l’incidence des expresseurs négatifs de CK19 dans différents types de cancer du poumon a été étudiée, ainsi que si l’induction d’EMT dans les cellules focales primaires influe sur l’expression de CK19. Nous avons également examiné si les cancers du poumon négatifs au KK19 étaient plus invasifs et métastatiques.

Patients et méthodes

Général

Les 111 patients ont été sélectionnés selon la stadification TNM de la 7e version, décrite par le Comité mixte Américain onCancer et l’Union pour la Lutte Internationale contre le cancer en 2007 (9-11). Des patients atteints de cancer du poumon diagnostiqués avec différents types de cancer du poumon au stade IV et traités par des inhibiteurs de la tyrosine kinase ou par une chimiothérapie à base de platine (75 mg / m2) et de docétaxel (75 mg / m2) ont été recrutés dans la présente étude. Les patients ont été admis à l’Hôpital populaire de Subei entre janvier 2013 et décembre 2014.

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Hôpital populaire de Subei. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque participant. Cette étude est conforme au « Code d’éthique de l’Association Médicale Mondiale » (Déclaration d’Helsinki, 1964).Les 111 patients comprenaient 90 hommes (âgés de 44 à 82 ans) et 21 femmes (âgées de 40 à 75 ans). Les caractéristiques des patients sont présentées dans le tableau I. Un total de 56 cas d’adénocarcinome, 21SCC, 32 SCLC et 2 cas de carcinome adénosquamous ont été identifiés.Les patients inscrits correspondaient aux critères suivants: Karnofskyscore avec une espérance de vie > 60 ans de > 3 mois, aucune maladie du système immunitaire, électrocardiogramme normal, fonction hépatique et kidneyée normale, et ne recevant aucun traitement antitumoral dans un délai d’un mois avant l’étude. Les cas traités par inhibiteur de Tyrosine kinase étaient de type adénocarcinome.

Des échantillons de sang ont été prélevés sur tous les patientset les sérums ont été séparés et congelés jusqu’à une analyse ultérieure.Des échantillons d’épanchement pleural ont été prélevés en suivant les procédures approuvées et ont été examinés cytologiquement et traités pour l’immunohistochimie.

Immunohistochimie

Des échantillons de tissus tumoraux (foyers primaires) ont été traités pour l’immunohistochimie pour la détection de CK19, E-cadhérine etvimentine. Des échantillons de tissus de foyer primaire ont été fixés dans du formol etembedés dans des blocs de paraffine. Des coupes multiples (4 µm) de chaque échantillon ont été utilisées pour l’analyse immunohistochimique. Les échantillons ont été conservés avec de l’hématoxyline et de l’éosine. Des anticorps anti-CK19, anti-E-cadhérine et anti-vimentine ont été achetés auprès de TIYO Biotechnology Corporation (Shanghai, Chine). Anticorps polyclonal de lapin anti-CK19 (numéro de catalogue Z98123) a été utilisé à une dilution de 1:50; polyclonal anti-E-cadhérine CK19 pour lapin (no de catalogue. L’anticorps Z86603) a été utilisé à une dilution de 1:100; et l’anticorps polyclonal anti-vimentine CK19rabbit (no de catalogue. Z40651) a été utilisé à une dilution de 1:500, suivie d’une incubation avec des anti-IgG conjugués à la peroxydase de raifort (Beijing CellChip Biotechnology Co.,Ltd., Beijing, Chine) à une dilution de 1:100. Le développement de la couleur a été effectué en utilisant un substrat de 3,3′-diaminobenzidine.

L’apparition de particules de bronzage dans la membrane cellulaire et le cytoplasme a été considérée comme positive pour CKl9, E-cadhérine etvimentine, respectivement. Les résultats immunohistochimiques ont été confirméspar deux pathologistes utilisant une méthode en double aveugle.

Analyses de marqueurs

Un analyseur automatique d’immunoessai par chimiluminescence Cobas de Roche E601 (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse) a été utilisé pour mesurer le CEA sérique, le CA125, l’énolase spécifique au neurone (NSE), l’α-foetoprotéine (AFP) et le CYFRA21-1 dans les sérums et les effusions pleurales des patients. CYFRA21-1 > 3,3 ng / ml, NSE > 15,2 ng / ml, CEA > 5,0 ng / ml, CA125 > 35,0 ng / ml et AFP > 7 ng / ml ont été considérés comme des valeurs positives.

EMT induite par le TGF-β1 dans des cellules tumorales pulmonaires

Des cellules tumorales ont été isolées à partir de tissus de foyer primaire prélevés chez les patients. Les cellules primaires ont été isolées du tissu tumoral primaire et de l’épanchement pleural du même patient et ont été cultivées. Les cellules ont été isolées en deux étapes : i) centrifugation par milieu de séparation des lymphocytes (gravité spécifique de 1.077), suivie d’une culture dans un milieu RPMI-1640 contenant 20% de sérum fœtal bovin (Beijing LabLead Biotechnology Corporation, Beijing, Chine) pendant 2 jours. ii) Par la suite 40/20% de Percoll (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, Chine) a été utilisé comme deuxième étape de centrifugation pour séparer les cellules. Les cellules collectées ont été à nouveau cultivées dans un milieu de culture inRPMI-1640 contenant 20% de sérum fœtal bovin, et incubées à 37°C sous atmosphère de CO2 à 5% jusqu’à confluence de 70 à 80%. Les cellules ont été traitées avec du TGF-β1 (acheté à Shanghai Kexing Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine) à 5 ng/ml pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été lavées et traitées. Une analyse immunohistochimique de l’E-cadhérine, de la CK19 et de la vimentine a été réalisée avant et après le traitement par TGF-β1, comme décrit ci-dessus. La présence ou la présence de ces marqueurs a été notée comme positive ou négative, respectivement.

L’analyse statistique

P < 0,05 a été considérée statistiquement significative.

Résultats

Caractéristiques des patients

Les 111 patients comprenaient 90 hommes et 21 femmes, avec une distribution d’âge similaire (40-80 ans). Les patients ont été diagnostiqués avec un cancer du poumon de stade IV. Histologiquement, la majorité des cas étaient de type adénocarcinome, suivis de la SCLC et de la CSC, tant chez les patients masculins que féminins (TableI). Il n’y a eu que deux cas de carcinome adénosquamous dans cet échantillon de patient. La majorité des patients ont reçu une chimiothérapie basée sur une chimiothérapie à base de platine et de docétaxel, tandis que ceux présentant des mutations du gain de fonction des récepteurs du facteur de croissance épidermique ont reçu un traitement par inhibiteur de la tyrosine kinase (TKI) (Gefitinib). Seul un petit nombre de patients (5 hommes et 1 femme) n’ont pas reçu ces traitements en raison de contraintes financières.

L’histologie du tissu tumoral primaire

Les tissus tumoraux de 111 patients ont été examinés immunohistochimiquement pour l’expression de CK19. Bien qu’une expression élevée de la CK19 ait été observée dans certains cancers du poumon, une perte de la CK19 est fortement associée à l’EMT (17). Dans la présente étude, l’expression de CK19 était absente dans de nombreuses tumeurs SCLC, > 50% chez les hommes et 100% chez les femmes. En tant que tel, l’expression de CK19 a été significativement diminuée dans les tumeurs SCLC par rapport à d’autres cancéreux pulmonaires (Fig. 1). Parmi lesadénocarcinomes, environ 31% des tumeurs de patients masculins étaient négatives pour CK19, ce qui était beaucoup plus faible chez les femmes (7%).Dans l’ensemble, les tissus tumoraux SCLC ont montré une probabilité plus élevée de caractéristiques EMT (tableau I). Il y a eu une réduction apparente de la proportion de tumeurs primaires exprimantes négatives CK19 ainsi que des cellules d’épanchement pleural après Tkithérapie, par rapport aux tumeurs patientes non traitées ou traitées par chimiothérapie, dans tous les types de cancer du poumon (Fig. 2).

Niveaux de CYFRA21-1

Épanchement sérique et pleural Les niveaux de CYFRA21-1 sont considérés comme des marqueurs importants de la malignité pour de nombreux types de cancer, en particulier pour le cancer du poumon. Étant donné que CYFRA21-1 est un afragment de CK19, nous avons examiné les niveaux d’effusion sérique et pleurale de CYFRA21-1 en fonction de la perte d’expression de CK19 dans les cellules d’épanchement pleural. Les résultats ont montré que lorsque CK19 était fortement exprimé dans le foyer primaire et les cellules d’épanchement pleural, les niveaux de CYFRA21-1 étaient élevés et lorsque l’expression de CK19 était perdue dans les tumeurs primaires et / ou les cellules d’épanchement pleural, les niveaux de CYFRA21-1 diminuaient significativement dans tous les types de cancer (Fig. 3). De plus, les taux de CYFRA21-1 étaient beaucoup plus élevés dans le sérum et l’épanchement pleural des patients atteints de tumeurs CCC-19 positives par rapport à d’autres types de tumeurs (Fig. 2). Les taux élevés de CYFRA21-1 dans les sérums des patients atteints de CSC et l’épanchement pleural reflètent probablement la forte présence de CK19 dans les tumeurs positives (Fig. 1). Les résultats suggèrent également que les taux de CYFRA21-1 dans le sérum n’étaient que marginalement élevés chez les cancéreux pulmonaires par rapport aux taux de base bénins (1,3–2,6 ng/ml), à l’exception du CSC, où l’augmentation était bien supérieure à la plage normale (Fig. 3). Cependant, les niveaux de CYFRA21-1 étaient très élevés au-dessus de la plage bénigne (6,5–35 ng / ml) (18) dans l’épanchement pleural des patients cancéreux pulmonaires, suggérant que la mesure de l’épanchement pleural de CYFRA21-1 est un marqueur tumoral optimal.

D’autres marqueurs sériques

Des marqueurs de malignité tumorale comprenant CA125, CEA, NSE et AFP ont été mesurés dans les sérums de quelques-uns des patients et il y avait une variation considérable entre les patients et les niveaux.Ainsi, pour les patients atteints d’ADC, la moyenne de CA125, CEA, NSE et AFPwas 23.6±10.9, 48.3±39.7, 10.1±2.4, et 2,1±0,6, respectivement. Pour les patients atteints de CSC, la moyenne de CA125, CEA, NSE et AFP était de57.1±31.5, 5.6±2.7, 20.8±2.5, et 2,6±0,4 respectivement Aucun des marqueurs n’était significativement différent de la plage normale (Fig. 4).

L’induction de la TEM dans les cellules focales primaires par le TGF-β1

Le TGF-β1 lorsqu’il est incubé avec des cellules tumorales pulmonaires à foyer primaire a créé des changements pertinents pour la TEM, dans de nombreux cas. Ainsi, dans près de 40% des tumeurs d’adénocarcinome, des foyers primaires positifs à CK19 ont été induits à perdre l’expression de CK19 et à subir une EMT byTGF-β1. Cette proportion de tumeurs était de 28% pour le CSC et de 50% pour le SCLC (Fig. 5). Ainsi, les foccellules primaires de SCLC sont inductibles pour subir l’EMT par le TGF-β1 plus facilement. Comme mentionné ci-dessus, les cellules primaires de SCLC montrent un niveau plus élevé d’EMT même sans induction par TGF-β1 (TableI).

Un autre ensemble de marqueurs importants de l’EMT est la perte d’E-cadhérine et le gain d’expression de la vimentine. L’E-cadhérine a été trouvée négative dans près de 37,5% des cellules tumorales primaires de l’adénocarcinome, 52,3% des cellules tumorales du CSC et 22% des cellules tumorales du SCLC (Fig. 6), avant de traiter avec du TGF-β1. Par contre, l’expression de la vimentine dans ces tumeurs était positive dans 23,2% des cellules tumorales de l’adénocarcinome, 33,3% des cellules tumorales du CSC et 31,3% des cellules tumorales du SCLC (Fig. 7). Suite au traitement des cellules de foyer primaire de la tumeur pulmonaire par le TGF-β1, la perte d’expression de l’E-cadhérine a toujours été associée à une augmentation de l’expression de l’invimentine (Fig. 8). Le pourcentage de tumeurs SCC qui ont montré cette réponse au TGF-β1 (changement de 40% de l’expression de l’E-cadhérine et de 57% de l’expression de la vimentine) est plus élevé que celui de l’adénocarcinome et de la SCLC (Fig. 6).

Discussion

L’état d’expression comparatif de la CK19 dans les tissus cancéreux primaires et dans les épanchements pleuraux peut être utile pour évaluer la capacité métastasante de ces cellules cancéreuses. Ainsi, si les cellules d’épanchement pleural du patient ont un niveau plus élevé d’expression négative de CK19 par rapport aux tissus cancéreux primaires du même patient, on suppose que l’expression négative de CK19 est associée à une invasion et à des métastases (19). Ainsi, dans la présente étude, une grande proportion de patients atteints de tumeurs SCLC présentaient un tissu tumoral sans expression de CK19 et les cellules d’épanchement pleural de ces patients présentaient un manque d’expression de CK19, indiquant un degré élevé de métastase dans ce type de cancer du poumon, qui est une caractéristique typique de la SCLC (20). Plusieurs causes de perte de l’expression de CK19 ont été suggérées, notamment une altération de l’expression et une dégradation protéolytique accrue (21).

Étant donné que CYFRA21-1 est un fragment de CK19, les taux sériques et d’épanchement pleural de CYFRA21-1 sont considérés comme des marqueurs importants de la malignité pour de nombreux types de cancer, en particulier pour le cancer du poumon (7,21). Cependant, il est difficile d’être certain que le diagnostic du cancer est basé sur les niveaux de CYFRA21-1 circulantil y a des cas de cancer du poumon où les niveaux de CYFRA21-1 diminuent alors qu’il y a une augmentation dans d’autres cas (7,21).Cependant, d’après les présentes conclusions, les niveaux sériques de CYFRA21-1 ont diminué avec la possibilité accrue d’EMT, telle que détectée par la perte d’expression de CK19 dans les épanchements pleuraux par rapport au tissu tumoral primaire correspondant. Ainsi, les niveaux sériques de CYFRA21-1salong avec le statut d’expression de CK19 des cellules cancéreuses provenant des épanchements primaires et pleuraux peuvent identifier positivement la capacité d’invasion et de métastase des cellules cancéreuses du poumon. D’autres marqueurs, dont le CA125, le CEA, l’AFP et le NSE, qui sont couramment utilisés pour le diagnostic du cancer, n’étaient pas cohérents dans cette évaluation.

La capacité métastasante est conférée aux cellules cancéreuses primaires par l’intermédiaire de l’EMT et l’un des principaux facteurs pouvant induire l’EMT est le TGF-β1. Bien que le TGF-β1 fonctionne normalement comme inhibiteur de la prolifération des cellules épithéliales, en raison des voies de signalisation altérées dans de nombreuses cellules cancéreuses, le TGF-β1 agit pour améliorer la prolifération des cellules cancéreuses, y compris les cellules cancéreuses du poumon (22). En plus d’améliorer la croissance des cellules cancéreuses, le TGF-β1 est connu pour favoriser l’EMT dans les cellules cancéreuses et contribuer ainsi à l’invasion et aux métastases des cellules cancéreuses. Il a été suggéré qu’aux premiers stades du développement tumoral primaire dans les tissus épithéliaux, le TGF-β1 agit comme un inhibiteur de la croissance tumorale via l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose (23,24).Cependant, au fur et à mesure de la progression tumorale, au cours des derniers stades de développement tumoral, il y a soit une inactivation de la voie de signalisation du TGF-ß1, soit une régulation aberrante du cycle cellulaire et les cellules cancéreuses deviennent résistantes à l’inhibition de la croissance par le TGF-β1 (23,24). Dans ces conditions, le TGF-β1 est utilisé comme promoteur de croissance par les cellules cancéreuses (25). L’expression de l’ARNm et de la protéine ofTGF-β1 était très élevée dans de nombreux types de cancer, y compris ceux du pancréas, du côlon, de l’estomac, du poumon, de l’endomètre, de la prostate, du sein, du cerveau et des os (26).

Considérant que la propension à subir une TEM est améliorée en présence d’une cytokine telle que le TGF-β1, connue pour être élevée chez les patients atteints de cancer du poumon, nous avons examiné l’émtinductibilité des cellules focales primaires, ex vivo, par le TGF-β1.Selon le marqueur EMT utilisé, les tumeurs SCLC et SCC avaient une plus grande capacité à subir une EMT induite par le TGF-β1. Les foyers primaires de SCLC sont inductibles pour subir l’EMT par TGF-β1 plus facilement, si nous envisageons la perte de l’expression de CK19. Il y a en fait un degré plus élevé d’EMT, en termes d’absence de CK19 dans les cellules tumorales primaires du SCLC. Par contraste, les cellules primaires tumorales du CSC répondent par la perte d’expressions E-cadhérine et de vimentine élevées. La régulation à la baisse de l’E-cadhérine, associée à la régulation à la hausse de la N-cadhérine caractérise le processus EMT et ces changements dans l’expression de ces protéines sont associés à l’acquisition d’une résistance à l’apoptose et à l’anoïkis (27,28).

En résumé, les résultats de la présente étude suggèrent que l’invasion et les métastases des cellules tumorales pulmonaires peuvent être évaluées en ayant une image complète du sérum CYFRA21-1 avec le statut d’expression de CK19 des cellules de foyer primaire et l’effusion pleurale. Cette évaluation peut être encore améliorée en examinant la propension des cellules de foyer primaire isolées à subir l’EMT induite par le GF-β1 en culture cellulaire.

Remerciements

Les auteurs souhaitent souligner l’aide technique du Dr Yong Chen et du Dr Jixin Jiang.

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