Les mécanismes de réarrangement chromosomique dans le génome humain

Les DSB pathologiques sont définis arbitrairement comme des DSB qui ne servent aucun but physiologique et peuvent conduire à un dysfonctionnement cellulaire.

Cassures aléatoires de l’ADN dues aux rayonnements ionisants ou aux radicaux libres oxydants

Dans de nombreux réarrangements chromosomiques, les DSB d’un ou des deux gènes semblent être situés de manière aléatoire dans de grandes régions de plusieurs kilobases. Le positionnement aléatoire et l’absence apparente de propension à la séquence suggèrent des mécanismes DSB non spécifiques à la séquence tels que les radicaux libres oxydatifs, les rayonnements ionisants ou, plus rarement, l’hydrolyse spontanée du squelette de l’ADN.

Environ la moitié des rayonnements ionisants naturels de l’environnement provient de métaux lourds naturels de la terre, tels que l’uranium, le thorium et même le potassium. L’autre moitié des rayonnements ionisants émane d’un rayonnement cosmique qui n’est pas entièrement bloqué par l’atmosphère. Au total, environ 3 x 108 particules de rayonnements ionisants traversent chacun de nous toutes les heures, produisant des radicaux libres hydroxyles à partir de l’eau dans leur sillage. Ce tractus de radicaux libres hydroxyles provoque des dommages en grappe sur l’ADN, brisant ainsi les deux brins d’ADN.

Environ 0,1% de l’oxygène que nous respirons est converti en radicaux libres. Cela génère 3 x1022 radicaux libres par heure en chacun de nous, et ces radicaux libres nocifs sont répartis dans les 1014 cellules du corps humain. Les radicaux libres causent principalement des dommages à l’ADN à un seul brin, mais deux événements de ce type à proximité peuvent entraîner un DSB.

Action de RAG sur des sites RSS cryptiques à des emplacements hors cible d’une manière spécifique à la séquence: ruptures de type V(D) J

La séquence de consensus heptamère / nonamère RSS n’est en aucun cas unique aux loci Ig et TCR, et le complexe RAG peut couper sur des sites qui diffèrent considérablement du consensus de 16 pb. Le motif minimal pour l’entaille de CHIFFON est uniquement CAC. Ainsi, le complexe RAG peut agir sur des sites de locus de récepteur non antigénique de type RSS, appelés RSS cryptiques (CRSS). Cela se produit dans de nombreux réarrangements observés dans le lymphome lymphoblastique aigu à cellules T humaines. Dans ces cas, au lieu du complexe RAG appariant un 12-RSS avec un 23-RSS, un 12-RSS se couple avec un 23-cRSS ou un 23-RSS se couple avec un 12-cRSS. Nous appelons ces ruptures de type V(D)J parce qu’elles se produisent via le même mécanisme que la recombinaison normale de V(D)J, indépendamment du fait que l’un des sites est en dehors des locus habituels des récepteurs antigéniques (c’est-à-dire qu’il est hors cible).

Action de CHIFFON au niveau des structures de bulles d’ADN et d’autres régions d’hétérologie d’une manière spécifique à la structure

En plus de son mode de coupe spécifique à la séquence, le complexe de CHIFFON peut également s’entailler d’une manière spécifique à la structure au niveau des sites de transition de l’ADNDSD à l’adNSS, tels que ceux qui se produisent aux bords des structures d’ADN de bulles ou même des non-appariements à base unique. Une telle activité du complexe RAG peut être due au fait que le complexe RAG est habitué à créer des structures en épingle à cheveux, ce qui implique une distorsion substantielle de l’ADN. Par conséquent, toute région d’inadéquation ou de glissement est une cible potentielle pour l’entaille par le complexe RAG dans les cellules lymphoïdes.

Transposition médiée par RAG en tant que mécanisme de réarrangement chromosomique

De 1998 à 2007, plusieurs laboratoires ont proposé que le complexe RAG puisse insérer les extrémités émoussées contenant du RSS de la recombinaison V(D)J, appelées extrémités de signal, dans de nouveaux emplacements du génome. Ceci est appelé transposition de CHIFFON, et se produit à un niveau bas en utilisant une forme tronquée des protéines de CHIFFON appelées chiffons de base (examinés dans). Cependant, les efforts pour trouver des événements de transposition RAG in vivo ont montré que ceux-ci étaient beaucoup moins fréquents que l’intégration aléatoire de l’ADN. Enfin, il n’existe aucun exemple de tumeurs malignes lymphoïdes humaines (ou tout autre type de tumeur maligne) où le génome a été modifié par une insertion transpositionnelle en CHIFFON d’extrémités de signal (ou toute autre variante apparente d’une telle transposition).

Action de l’AID à des emplacements hors cible

Comme mentionné dans la discussion ci-dessus sur la recombinaison des commutateurs de classe, l’AID peut convertir C en U ou en méthyle C ou T dans n’importe quelle région de l’adNSS. Cela semble se produire non seulement au niveau des séquences de commutation et des domaines variables des loci Ig, mais également à certains endroits pathologiques, tels que certains oncogènes comme le c-myc. Lorsqu’elles sont ciblées par l’AIDE, ces régions peuvent subir des mutations ponctuelles ou des DSB. L’action d’aide au niveau de la région de commutation de l’ISFH pendant la CSR et l’action d’AIDE indépendante au niveau du gène c-myc pour créer un DSB sont considérées comme la base des deux DSB initiateurs dans les translocations de c-myc chez la souris et chez l’homme. On pourrait considérer les ruptures de ce type comme des ruptures de type CSR (comme mentionné ci-dessus dans la discussion sur la recombinaison des commutateurs de classe) ou des ruptures de type SHM, où SHM se réfère à des événements initiés par l’AIDE du type similaire à ce qui se produit normalement dans l’hypermutation somatique.

Action combinée putative d’AID et de RAGs aux sites CpG: Ruptures de type CpG

Récemment, nous avons signalé que les DSB à certains loci dans les translocations au stade pro-B / pré-B – la bcl–2 de t (14; 18), la bcl-1 de t (11; 14) et l’E2A de t (1; 19) – ont une forte propension à se produire au niveau de la séquence dinucléotidique CpG.

La translocation bcl-2 est la translocation la plus fréquente dans le cancer, survenant dans > 90% des lymphomes folliculaires et un tiers des lymphomes diffus à grandes cellules. Cinquante pour cent des ruptures au niveau du gène bcl-2 se produisent dans la région du point d’arrêt majeur (MBR), qui est un point chaud de 175 pb dans l’exon 3′ most de la région codant pour le 3’UTR. Deux points chauds moins fréquemment utilisés sont situés à 18 et 29 kb plus distaux du gène bcl-2, la région de cluster intermédiaire (icr) de bcl-2 de 105 pb et la région de cluster mineur (mcr) de bcl-2 de 561 pb, respectivement. N’importe lequel des sites CpG dans l’une de ces trois zones de translocation bcl-2 peut être une cible pour un ORD. Treize pour cent des ruptures de translocation bcl-2 sont situées dans l’icr et 5% dans le mcr.

L’utilisation de CPG s’applique également au cluster de translocation majeure bcl-1, qui est l’emplacement impliqué dans la translocation t(11; 14). La translocation bcl-1 se produit dans presque tous les lymphomes à cellules du manteau, 30% des ruptures se produisant au niveau du cluster de translocation majeur (MTC) bcl-1 de 150 pb.

Des ruptures de type CpG se produisent également dans une troisième tumeur maligne lymphoïde, la t(1;19) dans un faible pourcentage des ALL pré-B, une translocation qui se produit entre le gène Pbx1 et le gène E2A. Les ruptures au niveau du gène E2A se produisent dans une zone de seulement 23 pb, et ces DSB sont également regroupés de manière significative autour des sites CpG. Les trois translocations impliquant la bcl-2, la bcl-1 et l’E2A se produisent au stade pro-B/pré-B du développement des lymphocytes B.

La bcl-2 MBR est réactive avec une sonde chimique pour l’étranglement simple appelée bisulfite. Comme le MBR bcl-2, ce MTC bcl-1 est relativement petit (150 pb) et présente une réactivité similaire au bisulfite. Ces zones hautement réactives au bisulfite sont riches en séries de Cs. Sur la base du dichroïsme circulaire, de la cristallographie aux rayons X, de la RMN et du sondage chimique, de telles séries de Cs ont tendance à adopter une structure d’ADN intermédiaire entre l’ADN de forme B et l’ADN de forme A, appelée intermédiaire B / A. La structure intermédiaire B/ A a une cinétique d’ouverture plus rapide, ce qui explique peut-être en partie l’augmentation observée de la réactivité du bisulfite. Ces régions d’ADN inhabituelles peuvent être plus sujettes à des événements de glissement, peut-être induits par la réplication ou la transcription de l’ADN. Cela peut alors expliquer leur vulnérabilité dans les essais de recombinaison minichromosomale.

Les Cs des CPG à l’intérieur ou directement adjacents à ces zones intermédiaires B /A courent un risque accru de subir une désamination. Cette désamination ne s’applique pas à tous les Cs de la région, mais uniquement aux Cs qui se trouvent dans les sites CpG. La seule caractéristique distinctive de tels Cs dans les CPG est qu’ils peuvent être méthylés par l’ADN méthyltransférase. Lorsque les Cs ordinaires se désaminent, ils deviennent U, ce qui entraîne une inadéquation U: G. Mais lorsque le méthyl Cs se désamine, ils deviennent T, ce qui entraîne une non-concordance T: G. La réparation des discordances U:G est très efficace, mais la réparation des discordances T:G n’est pas efficace. En fait, la réparation de l’inadéquation T: G est si inefficace qu’elle représente environ la moitié des mutations ponctuelles du gène p53 dans un large éventail de cancers humains. Ces sites de non-concordance T: G se trouvent toujours sur les sites CpG.

Qu’est-ce qui cause la rupture sur ces sites de non-concordance T:G? Fait intéressant, cette désamination à ces points chauds de translocation lymphoïde semble se produire au stade pré-B de la différenciation. C’est le stade de développement des lymphocytes B où la recombinaison D à J se produit le plus vigoureusement. Étant donné que les translocations bcl-2 et bcl-1 se produisent à ce stade, il semble probable que ce soit le stade de la translocation. Nous avons montré que le complexe RAG peut provoquer un DSB sur des sites de petites structures à bulles, et même des incompatibilités de paires de bases simples. (Comme mentionné ci-dessus, cette action du complexe RAG reflète son activité nucléase spécifique à la structure, peut-être une caractéristique qui reflète les actions spécifiques à la structure du complexe RAG lors de l’étape de formation d’épingle à cheveux de la recombinaison V(D)J.) Par conséquent, nous avons proposé que le complexe RAG fabrique les DSB aux sites de non-concordance T: G.

Si le complexe RAG provoque les DSB aux sites CpG, alors pourquoi de telles ruptures de type CpG ne se produisent-elles pas dans les cellules pré-T, qui expriment également le complexe enzymatique RAG? La lignée des cellules B exprime une cytidine désaminase pour la recombinaison par commutation de classe et l’hypermutation somatique. Comme mentionné ci-dessus, cette enzyme est appelée désaminase induite par l’activation (AID). L’AID est exprimée dans les cellules B mais pas dans les autres cellules somatiques. L’AID est le plus fortement exprimé dans les cellules B lorsqu’elles se trouvent dans les centres germinaux. Cependant, un faible niveau d’expression de l’AIDE a été décrit dans les cellules pré-B. De plus, on pense que les cellules B qui sortent de la moelle osseuse, appelées cellules B de transition, expriment également une AIDE. Par conséquent, il y a une période de temps où les cellules B terminent la recombinaison V(D)J et commencent à exprimer l’AID lorsque l’AID et le complexe RAG sont présents dans les cellules B. Il a été démontré que l’AID est capable de désaminer le méthyle C en T. Par conséquent, nous proposons que l’AID est probablement responsable de la mutation de meC en T aux sites CpG dans les cellules B précoces. L’inadéquation T: G résultante est ensuite coupée par le complexe RAG, ce qui donne un DSB. Ce modèle explique trois pics de translocation situés dans le MBR bcl-2, tous centrés sur des sites CpG.

Autres causes de DSB pathologiques de mécanisme inconnu

Certaines translocations sont fortement associées au traitement par inhibiteur de la topoisiomérase de type II. Après une telle thérapie, certains patients développent des tumeurs malignes secondaires avec ces translocations caractéristiques. Les topoisomérases en général font des ruptures simples ou doubles brins afin d’enrouler ou de dérouler l’ADN, elles ont donc une activité nucléase dans le cadre de leur fonction. Après avoir enroulé ou déroulé l’ADN, ils referment normalement la ou les cassures. Il a été proposé que l’interruption ou la prévention du resealing puisse entraîner des ruptures stables observées dans les réarrangements chromosomiques.

Certains DSB apparaissent à des sites proches de répétitions d’ADN directes ou inversées. De telles répétitions peuvent donner lieu à des structures d’ADN glissées contenant des régions d’ADN simple brin, qui peuvent être des cibles de clivage. Le meilleur exemple en est la translocation constitutionnelle t(11; 22) (q23; q11), qui contient un palindrome riche en AT de plusieurs centaines de bases, avec un potentiel de formation cruciforme.

Combinaison de plusieurs mécanismes DSB dans un réarrangement

Étant donné que deux DSB sont nécessaires pour générer une translocation, les deux ruptures ne sont souvent pas liées l’une à l’autre. Dans les translocations bcl-2 et bcl-1, par exemple, la rupture au locus IgH est une rupture de type V(D)J générée par l’action spécifique à la séquence du complexe RAG lors de la recombinaison V(D)J. (On pourrait considérer cela comme un échec dans l’achèvement du processus normal de recombinaison V(D)J.) L’ORD au locus bcl-2 ou bcl-1 est une rupture de type CpG qui a été proposée pour être due à l’action séquentielle de l’AIDE et à l’activité d’entaillage spécifique à la structure du complexe RAG.

Même dans un locus donné, il peut y avoir un large éventail de mécanismes DSB. Les loci SCL et LMO2 supportent principalement les DSB de type V(D)J, mais un tiers ou plus des DSB sont incompatibles avec les exigences de séquence pour les DSB de type V (D) J, et ceux-ci peuvent être dus à des dommages causés par les radicaux libres, les rayonnements ionisants ou les défaillances de la topoisomérase. Différents loci au sein d’une même cellule sont donc sujets à différents types de mécanismes ORD.

DSB induits par la réplication

Pendant la réplication de l’ADN, des délétions peuvent survenir en raison du glissement du brin de synthèse sur le brin modèle. Les réarrangements chromosomiques qui se produisent à des points chauds spécifiques, que ce soit dans le cancer des cellules somatiques ou pendant la gamétogenèse / les divisions de développement initiales en tant que translocations constitutionnelles, sont appelés translocations récurrentes qui peuvent être observées chez de nombreux patients. Les translocations non récurrentes sont celles qui se produisent à différents endroits d’un patient à un autre, mais qui modifient ou inactivent un gène responsable d’une maladie. Contrairement aux translocations récurrentes dont nous avons discuté dans cancer ci-dessus, les mécanismes qui provoquent l’échange de brins dans les translocations non récurrentes semblent impliquer un changement de modèle lors de la synthèse d’ADN réplicatif. Ces commutateurs de matrice peuvent se produire dans de petites régions d’homologie de séquence d’ADN, telles que 5 pb. Cette commutation de modèle a été appelée réplication induite par la rupture par microhomologie (MMBIR) ou Décrochage de fourche et commutation de modèle (FoSTeS). Pour les jonctions de translocation non récurrentes qui impliquent plusieurs longues séquences provenant de régions du génome normalement séparées les unes des autres, plusieurs événements de commutation de modèles ont été proposés comme mécanisme.