Le rôle des signaux de chordine/Bmp dans le développement pharyngé des mammifères et le syndrome |développement de DiGeorge

RÉSULTATS

Défauts de gastrulation chez les souris Chrd-/-

La protéine de liaison à la Bmp sécrétée par Chrd est exprimée dans le nœud de la souris et ses dérivés, la notochorde et l’endoderme pharyngé (Fig. 1 BIS à F). La protéine Chrd contient quatre domaines riches en cystéine (CR), qui sont tous capables de lier les PGB.CR1 et CR3 présentent la plus grande affinité pour la Pgb4 et peuvent antagoniser les signaux de Pgb lors de l’injection d’ARNm dans les embryons de Xénope (Larrain et al., 2000). Pour générer un allèle nul de Chrd, nous avons préparé une construction de ciblage avec des codons d’arrêt de traduction dans les trois trames de lecture possibles au sein de la région peptidique signal. Les codons stop ont été suivis d’un frameshift et de l’insertion, après CR1, de cassettes IRES-lacZ et PGK-neo qui ont ensuite perturbé le gène Chrd (Fig.1G). Les transcrits de cet allèle Chrdtm1DR (ci-après dénommé Chrd-) étaient des embryons inChrd-/- indétectables au stade nodal (Fig. 1J, pointe de flèche).

Les souris Chrd hétérozygotes étaient viables et fertiles et étaient accouplées à des embryons Chrd-/- générateurs de divers stades de développement stages.At au jour E8.5, nous avons observé la présence de nodules de résorption dans l’utérus des femelles enceintes et une petite réduction du nombre attendu d’embryons CHR-/- (50 récupérés, 57 attendus). Les embryons mutants homozygotes quadriotypés ont montré une nette réduction de la taille de la région embryonnaire, accompagnée d’un élargissement de l’allantois avec le respect du reste de l’embryon (Fig.2A, A’). Dans les coupes histologiques, une hypoplasie considérable de la plaque neurale (Fig.2B, B’), absence de somites et de notochorde (Fig. 2C, C’), et l’anabondance de cellules mésodermiques extra-embryonnaires dans l’allantois (Fig. 2D, D’) ont été observés. Les autres mutants (46) étaient morphologiquement indiscernables de leurs congénères hétérozygotes et sauvages. Le phénotype des quatre mutants normaux était similaire, mais moins prononcé, à la ventralisation du mésoderme observée chez les Chrd doubles homozygotes; les Nogmutants (Bachiller et al., 2000) dans lequel, en outre, des troncations antérieures de la plaque neurale étaient également présentes.

Chez le poisson zèbre et le xénope, l’inactivation de la Chrd provoque une expansion du mésoderme ventral et une réduction du mésoderme dorsal et de la plaque neurale (Schulte-Merker et al.,1997). Chez les mammifères, le mésoderme se forme lors de la gastrulation par leingression des cellules épiblastes à travers la strie primitive. Les cellules sortant de l’extrémité postérieure de la strie primitive se déplacent dans la région extra-embryonnaire où elles donnent naissance à une lignée mésodermique (allantois, amnios et îlots sanguins du sac vitellin) équivalente au mésoderme ventral de Xenopus. En revanche, les cellules situées dans des régions plus antérieures du trou restent à l’intérieur de l’embryon proprement dit et produisent le mésoderme paraxial, intermédiaire et latéral du futur tronc. Le phénotype précoce des mutants CHR-/-, dans lequel l’allantois est expansé au détriment du mésoderme embryonnaire, est compatible avec une ventralisation précoce de l’embryon de souris. Ce phénotype doit conduire à la mort des animaux affectés, car aucun mutant homozygote présentant un allantois anormal n’a été récupéré à des stades ultérieurs. Analyse de ce phénotype avec des marqueurs moléculaires n’a pas été réalisée car si peu d’embryons anormaux ont été obtenus.

Létalité périnatale

Seulement 49% (95 sur 194) des animaux Chrd/Chrd attendus ont été récupérés à la naissance, tous présentant le même phénotype entièrement pénétrant. Parmi ceux-ci, la majorité était mort-née, mais quelques-uns ont tenté, sans succès, de gonfler leurs poumons. Extérieurement, les nouveau-nés mutants homozygotes étaient légèrement plus petits que leurs congénères de type sauvage et présentaient une cyanose, une microcéphalie et une réduction de l’oreille externe, qui était anormalement rapprochée de l’œil (Fig. 3A’).Examen histologique (Fig.3B ‘-C’) a révélé l’absence de thymus (t, un dérivé de la troisième poche pharyngée) et du palais secondaire (p), et une hypoplasie de l’oreille interne (ie) chez les mutants. Le lobe antérieur et le pars intermedia de la glande pituitaire (pi), tous deux dérivés de l’ectoderme oral dorsal immédiatement adjacent à la bordure céphalique de l’endoderme antérieur, étaient normaux (Fig. 3C, C’). Ceci a défini la limite rostrale du phénotype dans l’oropharynx, avec des malformations limitées aux dérivés de l’endoderme exprimant le Chrd. La glande thyroïde, qui se forme dans l’endoderme pharyngé ventral au niveau du caecum du foramen, s’est différenciée mais était hypoplasique et de forme irrégulière (th, Fig. 3C’). Les glandes parathyroïdes, dérivées des poches pharyngées 3 et 4, étaient absentes (données non montrées), une observation compatible avec l’hypocalcémie néonatale chez les personnes atteintes du syndrome de DiGeorge (DiGeorge, 1968). Nous concluons que le phénotype des souris mort-nées Chrd-/- récapitule la plupart des caractéristiques décrites chez ces individus.

Défauts squelettiques

Dans les préparations squelettiques d’animaux Chrd-/-nouveau-nés, les os appendiculaires et lombaires étaient normaux, mais la base du crâne et le squelette axial antérieur présentaient de multiples défauts. Les altérations de l’os temporal comprenaient l’absence du squama temporal (st) et le raccourcissement de l’arcade zygomatique (Fig.4A, A’). Nous avons également observé une hypoplasie considérable de l’os hyoïde et des cartilages laryngés thyroïdiens et cricoïdes (Fig. 4B’), et une mâchoire anabnormalement petite (Fig.4C’). À la base du crâne, l’alisphénoïde (as) semblait normal, mais dans la ligne médiane, les os basioccipitaux (bo) et basisphénoïdes (bs) étaient fusionnés et le présphénoïde (ps) était hypoplasique (Fig. 4D, D’). Consistantavec les résultats histologiques, les étagères palatines n’ont pas réussi à s’étendre médialement pour former le palais secondaire. Dans l’oreille, l’anneau tympanique et la capsule oticétaient réduits et mal formés (Fig.4D’). Des malformations squelettiques ont également été observées dans les régions cervicales et thoraciques de la colonne vertébrale. Les corps vertébraux (vb) étaient plus petits chez les nouveau-nés Chrd-/- (Fig. 4E’), avec une ossification retardée et la perte occasionnelle d’autres éléments des vertèbres tels que les apophyses épineuses, les arcs neuraux et l’arcade antérieure de l’atlas (Fig. 4E ‘ Etfig. 5A’).

Les défauts squelettiques des mutants Chrd étaient déjà détectables dans les condensations d’cartilage à E14.5 (Fig.5A, A’). Les cartilages basioccipitaux et basisphénoïdes étaient fusionnés, et le centre d’ossification du basioccipital était plus étroit et s’étendait dans le basisphénoïde (Fig.5B, B’). La notochorde antérieure, qui était présente dans la ligne médiane du basioccipital de type sauvage, était absente chez les mutants Chrd (Fig. 5B, B’). L’absence de notochorde antérieure a été confirmée par l’examen histologique de la région cervicale à E14.5 (Fig.5F’).

Les os affectés par la mutation Chrd ont des origines très différentes. Le basioccipital est purement d’origine somitique; des parties de thebasisphénoïde proviennent de l’ossification endochondrale du mésenchyme céphalique; thepalatine provient de l’ossification intramembraneuse du mésenchyme dérivé de la crête neurale; les capsules otiques se différencient d’un mélange de cellules de crête neurale mésodermique paraxiale; et l’hyoïde est strictement dérivée de la crête neurale (Le Douarin et Kalcheim, 1999). Au milieu d’une telle diversité de lignées, le principe unificateur du phénotype semble être la localisation de structures malformées dans la proximité du mésendoderme axial exprimant le Chrd (Fig. 1E). Cette interprétation est compatible avec la dégénérescence prématurée observée de l’antériornotochorde chez les animaux Chrd-/- et avec l’exigence de signaux dérivés de la plaque préchordale et du mésendoderme pour le développement du squelette de la tête (Belo et al., 1998; Couly et coll., 2002; David et coll.,2002).

Anomalies cardiovasculaires de type DiGeorge

La cyanose observée à la naissance peut être un signe de dysfonctionnement cardiaque. Pour approfondir cette question, des dissections à différents stades du développement embryonnaire ont été effectuées. À E14.5, le cœur des animaux de CHR-/-a montré un seul vaisseau, au lieu de deux normalement, dans le tractus de sortie cardiaque (Fig. 5D, D ‘, E, E’).Cette affection est connue chez l’homme sous le nom de truncus artériosus persistant et constitue une malformation importante chez les personnes atteintes du syndrome de DiGeorge. L’absence de séparation entre l’aorte ascendante et le tronc pulmonaire peut augmenter la charge de travail du ventricule droit provoquant son hypertrophie, ainsi que la vasodilatation, l’œdème et l’hémorragie observés chez les embryons E14.5 (Fig. 5C’). En tant que syndrome d’inDiGéorge, les défauts du système cardiovasculaire s’étendaient au-delà du tractus d’écoulement et incluaient les grands vaisseaux dérivés des archartères pharyngées (Fig. 6). Chez les nouveaux-nés mutants, les artères carotides communes ont directement rejoint le tronc articulaire, ce qui a entraîné l’absence de l’artère brachio-céphalique et d’une partie de l’arc aortique (Fig. 6 BIS à C).Les artères pulmonaires proviennent directement du tronc proximal de l’artère artérielle, ce qui entraîne l’absence de tronc pulmonaire commun (Fig. 6 BIS à C). De plus, des défauts de latéralité ont été observés, avec une rotation anormale à droite de l’aorte de 40% des mutants (Fig. 6, comparer 6avec 6F). Lorsque des dissections ont été effectuées à partir de la partie postérieure, on peut voir que, selon la latéralité de l’aorte descendante, les artères sous-clavières droites ou gauches ont adopté une position rétrooesophagienne anormale (Fig. 6D-F). Des effets similaires ont été décrits chez des embryons de poussins avec des ablations de cellules de la crête neurale (Kirby et al., 1983), et inmice portant des suppressions dans la région congénique de DiGeorge (Lindsay et al., 1999; Merscher et coll., 2001) oumutations dans Tbx1 et Fgf8 (Abu-Issa et al., 2002; Frank et coll., 2002; Jerome et Papaioannou, 2001; Lindsay et coll., 2001; Vitelli et coll., 2002b).

À la naissance, seulement 49% des mutants homozygotes Chrd attendus ont été découverts. Cependant, 48 des 56 embryons Chrd-/- attendus (86%) étaient encore vivants dans des portées disséquées à E14.5, une fréquence non significativement différente de celle observée à E8.5 (88%). La forte augmentation de la létalité après E14.5 coïncide avec la manifestation complète du phénotype cardiovasculaire et suggère que le dysfonctionnement circulatoire est une cause importante de létalité des embryons Chrd / Chrd pendant la gestation tardive.

Anomalies pharyngées

Pour déterminer l’apparition du phénotype pharyngé, nous avons disséqué des femelles enceintes issues d’accouplements hétérozygotes à différents moments après le coitum. À E9.0, à un stade où la Chrd est exprimée dans l’endoderme pharyngé, les embryons Chrd-/- pourraient être identifiés par une indentation dans la région du cou (Fig.7A’, flèche). Les vésicules otiques des mutants ont été réduites à la moitié de leur diamètre normal (Fig.7A’, pointes de flèches) et le deuxième arc pharyngé (hyoïde) étaitmissing. Les arcs pharyngés de trois à six ne se sont jamais formés chez les embryons mutants (Fig. 7B’ et données non montrées). Les structures manquantes ou mal formées sont soit des précurseurs directs, soit jouent un rôle inductif lors du développement de nombreux organes défectueux à la naissance chez la souris Chrd-/-. Comme la plupart des anomalies phénotypiques observées chez les mutants nouveau-nés ont leur origine embryologique dans l’endoderme pharyngé et la région péripharyngée, nous avons analysé l’expression d’un certain nombre de gènes connus pour avoir des rôles de développement importants dans les maladies héréditaires humaines.

Nous avons d’abord examiné l’expression de Pax3, un facteur de transcription exprimé dans la crête neurale, le tube neural dorsal et les somites (Goulding et al., 1991). Inhumains, PAX3 est muté dans des maladies de la crête neurale désignées par le syndrome de Waardenburg de types 1 et 3 (Strachan et Read, 1994) et est un co-régulateur, avec SOX10, du gène microphtalmie orMITF (Bondurand et al., 2000), le facteur de transcription muté dans le syndrome de Waardenburg de type 2a chez l’homme (Tassabehji et al.,1994). La mutation de Pax3 chez la souris splotch (Sp2H) entraîne des malformations cardiaques, y compris un tronc artériel persistant, ainsi qu’une malformation du thymus, de la thyroïdeet des glandes parathyroïdes (Conway et al.,1997). Nous avons constaté que l’expression de Pax3 était indiscernable entre les embryons mutants et de type sauvage à E7.5 (non représenté), mais à E10.5, des différences significatives ont été observées. Les cellules de crête Pax3-positives qui migrent à travers les arcs pharyngés 3, 4 et 6 (Fig. 7C, pointes de flèches) étaient faiblement détectables chez les animaux Chrd-/- (Fig. 7C’). Ces cellules neuralcrest peuplent le septum séparant l’aorte de l’artère pulmonaire dans le tractus de sortie, ou région conotruncal, du cœur (Li et al., 2000). L’incapacité de la crête neurale cardiaque à atteindre le cœur explique l’absence de perception des voies de sortie et le phénotype cardiovasculaire subséquent observé chez les mutants de l’inChrd. Fait intéressant, l’expression de Pax3 dans d’autres tissus tels que le composant mandibulaire (md) de la première arcade pharyngée, les dermomyotomes (dm) et les précurseurs de myoblastes des membres antérieurs (fl) n’ont pas été affectés (Fig. 7C’).

Ensuite, nous avons effectué des hybridations in situ avec Sox10, un génémuté chez des individus atteints du syndrome de Waardenburg de type 4 (Pingault et al., 1998) quiest exprimé dans la crête neurale et les cellules de Schwann. À E7.5, l’expression deox10 était la même chez les embryons Chrd-/- et dans leurs congénères de type sauvage (données non présentées). À E9.5, l’expression de Sox10 dans les ganglions de la racine dorsale (drg) du tronc était normale (Fig. 7B, B’), mais la répartition des cellules gliales exprimant Sox10 a révélé des défauts spécifiques dans l’organisation du système nerveux périphérique dans la région du cou et de la tête des mutants (Fig.7B’). En particulier, les ganglions sensoriels crâniens ont été marquésabnormalités. Les ganglions du trijumeau (tr) et du vestibulo-cochléaire (vc), correspondant respectivement aux nerfs crâniens V et VIII, ont été localisés plus rapprochés dans les embryons Chrd-/- que dans les congénères de type sauvage. De plus, des projections nerveuses anormales reliant les deux d’entre elles ont été observées (fig. 7B’, pointe de flèche). Les ganglions géniculés (g), pétrosaux (p) et nodeux (n), correspondant aux nerfs crâniens VII, IX et X, ont été les plus touchés, montrant soit une réduction extrême de la taille, soit une absence totale. Ces trois ganglions sont originaires des placodes épibranchiaux et sont connus pour nécessiter des signes inductifs de l’endoderme antérieur pour leur bon développement (Begbie et al., 1999). L’absence de ganglions dérivés du placode épibranchial indique que la protéine sécrétée est nécessaire à l’activité du signal inductif libéré par l’endoderme pharyngé.

Pax9 est un facteur de transcription nécessaire au développement de l’endoderme pharyngé et de ses dérivés chez la souris (Peters et Balling, 1999; Peters et al., 1998). À E9.5, l’expression de Pax9 dans l’endoderme pharyngé des embryons CHR-/- était plus faible que chez leurs congénères de type sauvage (pe, Fig.7D, D’). L’expression de Pax9 a révélé que la taille et la forme du pharynx étaient altérées chez les mutants Chrd, les poches pharyngées étant réduites à un seul gonflement dans la région la plus antérieure (Fig. 7E, E’). L’hypoplasie du pharynx a été confirmée par des coupes histologiques d’embryons E14.5, dans lesquels l’endoderme antérieur apparaissait sous la forme d’un tube mince décrivant une lumière agréablement diminuée (ph, Fig.5F, F’). La réduction de l’endoderme pharyngé a également été observée dans les renversements de Xenopus Chrd (Oelgeschläger et al.,2003). Les régions non pharyngées dans lesquelles l’ARNm Pax9 est exprimé normalement, telles que les sclérotomes somitiques (sc) et le mésenchyme facial (fm), n’ont pas montré de différences dans la distribution ou l’abondance des transcrits (Fig.7F, F’).

Nous concluons de ces études que les altérations de l’expression de Pax3, Sox10 etpax9 sont limitées à une zone très limitée de domaines d’expansion larges, suggérant que l’absence de la protéine sécrétée Chrd perturbe spécifiquement les voies de régulation locales agissant dans la région périphérique entourant l’endoderme exprimant le Chrd.

L’expression de Tbx1 et de Fgf8 nécessite de la chordine

Pour étudier l’interaction de Chrd avec des gènes connus pour provoquer des phénotypes de type Digeorge ou DiGeorge chez la souris, nous avons analysé l’expression de TBX1 et de Fgf8 dans des embryons mutants de Chrd. Tbx1 est un membre de la famille des facteurs de transcription T-box (Papaioannou et Silver, 1998). Il cartographie la microdélétion DGS/VCF 22q11 chez l’homme et il a récemment été démontré qu’elle provoque un phénotype de type DiGeorge lors de l’inactivation chez la souris (Jerome et Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et coll., 2001; Vitelli et coll., 2002a). L’expression de Tbx1 a été altérée dans les embryons CHRD-/-. Chez les animaux sauvages de type E7.5, Tbx1est exprimé dans le foregut (futur endoderme pharyngé) et le mésoderme de la tête (Fig. 8 BIS). À ce stade, les litières mutantes ont montré une nette réduction des niveaux d’expression de Tbx1 dans les mêmes zones (Fig.8A’). La réduction de l’ARNm Tbx1 était également claire dans la région pharyngée des embryons homozygotes Chrd à E8.0, E8.5 et E9.0 (Fig.8B’, C’, D’). Les sections histologiques transverses ont montré qu’au niveau cellulaire, l’abondance des transcripts Tbx1 a été considérablement réduite dans l’endoderme, à la fois dans le pharynx et au niveau du diverticule hépatique (Fig.8F-H’) La diminution de la concentration d’ARNM Tbx1 était également évidente dans le mésoderme, y compris la tête, le mésoderme splanchnique (pointes de flèches) et le mésoderme automatique (flèches) dans la région péripharyngée (Fig.8F’, G’, H’). De plus, l’expression Tbx1 à E9 dans le noyau mésodermique de la première arcade pharyngée était différente, s’étendant à la majeure partie de l’arcade, et les transcriptions Tbx1 étaient absentes de la vésicule otique (Fig.8D-D’).

Fgf8 est un facteur de croissance sécrété exprimé dans une variété de tissus, y compris l’endoderme pharyngé et le mésoderme voisin (Crossley et Martin, 1995; MacArthur et al., 1995).Au début du développement, le Fgf8 est nécessaire à la gastrulation (Sun et al., 1999) et l’établissement de l’axe de symétrie gauche/droite (Meyers et Martin, 1999). Les stades Atlater de Fgf8 sont nécessaires pour le membre (Lewandoski et al., 2000; Moon et Capecchi, 2000) etcraniofaciale (Trumpp et al., 1999) développement. Des expériences récentes ont montré que les souris dont l’activité réduite du Fgf8 présente un spectre de défauts cardiovasculaires et pharyngés imitant étroitement le syndrome de DiGeorge (Abu-Issa et al., 2002; Frank et coll., 2002). En outre, l’expression de Fgf8 est abolie dans l’endoderme pharyngé des mutants TBX1-/- et les deux gènes interagissent génétiquement pendant la différenciation des artères de l’arc pharyngé (Vitelli et al., 2002b). AtE9, l’expression de Fgf8 chez les mutants Chrd est normale dans l’isthme du cerveau postérieur, la proéminence frontonasale et la queue. Cependant, dans l’endoderme pharyngé, les niveaux de transcription de Fgf8 sont considérablement réduits (Fig. 8E’). La réduction de l’expression de Tbx1 et de Fgf8 dans les embryons Chrd-/- suggère que les deux gènes agissent en aval de la Chrd dans la même voie de régulation. Ces expériences ne permettent pas de déterminer si le Chrdis est nécessaire au maintien ou à l’induction de Tbx1 et de FGF8 dans le pharynx et les tissus voisins.

Pour tester si le Chrd peut induire Tbx1 et Fgf8, nous avons injecté l’ARNm du Chrd (50 pg) dans la région ventrale des embryons de Xenopus au stade à quatre cellules. Les explants de la zone marginale ventrale (VMZ) ont été disséqués au début de la gastrula, cultivés jusqu’à ce que les embryons frères atteignent le stade précoce de la neurula et analysés par RTPCR. Les ARNm Tbx1 et FGF8 ont été exprimés à des niveaux élevés dans les embryons entiers et les explants de la zone dorsalmarginale (DMZ) à ce stade, et à des niveaux faibles dans les explants VMZ (Fig. 8I, voies 1-3). Lors de la microinjection, l’ARNm du Chrd a augmenté les taux de Tbx1 et de FGF8 dans VMZ (Fig. 8I, voie 4). L’hybridation in situ d’embryons de Xénope micro-injectés a confirmé que les transcrits Tbx1 induits par l’ARNM du Chrd étaient situés dans l’endoderme pharyngé (données non présentées). Nous concluons que thatChrd, un antagoniste de la Bmp, peut induire l’expression Tbx1 et Fgf8 chez les embryons de Xénope, et est nécessaire à l’expression complète de ces gènes dans la région pharyngée de l’embryon de souris.