Le Clemizole et les modulateurs de la signalisation sérotoninergique suppriment les crises dans le syndrome de Dravet

Résumé

Le syndrome de Dravet est une épilepsie infantile catastrophique avec des crises précoces, un retard du développement du langage et de la motricité, des troubles du sommeil, un comportement de type anxiogène, un déficit cognitif sévère et un risque accru de décès. Elle est principalement causée par des mutations de novo du gène SCN1A codant pour un canal sodique activé par la tension neuronale. Les poissons zèbres avec une mutation de l’homologue SCN1A récapitulent l’activité épileptique spontanée et imitent les mouvements comportementaux convulsifs observés dans le syndrome de Dravet. Nous montrons ici que le criblage phénotypique des banques de médicaments chez les mutants scn1 du poisson zèbre identifie rapidement et avec succès de nouveaux traitements. Nous démontrons que le clémizole se lie aux récepteurs de la sérotonine et que son activité antiépileptique peut être imitée par des médicaments agissant sur les voies de signalisation de la sérotonine, par exemple la trazodone et la lorcasérine. Parallèlement à ces découvertes de poisson-zèbre, nous avons traité cinq patients atteints du syndrome de Dravet médicalement intraitables avec un agoniste des récepteurs de la sérotonine cliniquement approuvé (lorcaserin, Belviq®) et avons observé des résultats prometteurs en termes de réduction de la fréquence et / ou de la gravité des crises. Nos résultats démontrent un chemin rapide de la découverte préclinique chez le poisson zèbre, en passant par l’identification de la cible, jusqu’aux traitements cliniques potentiels du syndrome de Dravet.

Introduction

Les épilepsies infantiles classées comme catastrophiques sont souvent associées à une mutation génétique. Parmi ceux-ci, le syndrome de Dravet a été lié à plus de 600 mutations de novo dans un seul gène, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et coll., 2010). Les enfants atteints du syndrome de Dravet présentent des crises convulsives dès l’âge de 6 mois, un retard de développement du langage et de la motricité, des troubles du sommeil, un comportement anxiogène et un déficit cognitif sévère (Dravet, 2011). Des symptômes de trouble du spectre de l’autisme ont également été rapportés (Li et al., 2011) et le risque de mort subite inexpliquée avec épilepsie (SUDEP) dans cette population est estimé à 15 fois plus élevé que les autres épilepsies infantiles (Kearney, 2013). Les antiépileptiques disponibles n’offrent pas un contrôle adéquat des crises et les procédures neurochirurgicales résectives ne sont généralement pas une option. Les nouveaux traitements du syndrome de Dravet restent un besoin important non satisfait malgré un certain niveau d’efficacité dans des essais cliniques limités pour le cannabidiol (Epidiolex®) et le stiripentol (Diacomit®), qui peuvent être associés à des problèmes de sécurité cognitive ou d’appétit, respectivement (Perez et al., 1999; Chiron et coll., 2000; Detyniecki et coll., 2016; Devinsky et coll., 2016).

Des mutations de SCN1A, un gène codant pour la sous-unité α formant des pores d’un canal sodique voltage-fermé (Nav1.1), ont été identifiées chez près de 85% des patients atteints du syndrome de Dravet (Dravet, 2011). Les canaux Nav1.1 contribuent à la dépolarisation rapide des membranes neuronales observée lors de la génération de potentiel d’action (Hodgkin et al., 1952). Les souris hétérozygotes pour une mutation de perte de fonction dans Nav1.1 développent des crises spontanées et sensibles à la température tôt dans la vie, et meurent prématurément vers le jour postnatal 25 (Yu et al., 2006; Oakley et coll., 2009; Cheah et coll., 2012). Des études d’électrophysiologie aiguë chez ces souris déficientes en Scn1a et chez des souris apparentées suggèrent une réduction de la densité de courant de sodium et une diminution associée de l’activité de tir pour une sous-population de neurones inhibiteurs exprimant le GABA (mais pas de cellules principales excitatrices) aboutissant à une inhibition synaptique réduite et à une hyperexcitabilité du réseau (Yu et al., 2006; Kalume et coll., 2007; Han et coll., 2012). Cette hypothèse d' » interneuronopathie  » est compatible avec d’autres formes d’épilepsies infantiles catastrophiques et a été confirmée chez des souris où le Scn1a a été sélectivement supprimé des sous-populations d’interneurones exprimant la parvalbumine ou la somatostatine (Dutton et al., 2013; Tai et coll., 2014). Des comportements de type autiste ont également été rapportés chez ces souris (Han et al., 2012). Fait intéressant, des études initiales sur des neurones excitateurs et inhibiteurs humains dérivés de la technologie des cellules souches pluripotentes induites de deux patients atteints du syndrome de Dravet ont signalé des déficits en courant sodique activé par la tension pour les deux types de cellules, suggérant soit une compensation homéostatique de la perte précoce de fonction d’un canal sodique spécifique au cerveau critique, soit des mécanismes supplémentaires contribuant au phénotype épileptique observé chez ces patients (Jiao et al., 2013; Liu et coll., 2013).

Bien que des souris et des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme contribuent à notre compréhension de la physiopathologie sous-jacente du syndrome de Dravet, ces systèmes ne sont pas bien adaptés à l’identification rapide de nouvelles thérapies en raison de la variabilité de ces modèles et de la reproductibilité des mesures quantitatives. Comme les poissons-zèbres sont un système modèle de vertébrés idéal pour effectuer des criblages à base de phénotypes à petites molécules (MacRae et al., 2015), et se prêtant à des manipulations génétiques, nous avons concentré nos efforts sur un mutant canal sodique de poisson-zèbre. Des mutants du poisson-zèbre porteurs d’une mutation fausse-sens de perte de fonction dans l’orthologue SCN1A, scn1Lab, ont été identifiés dans un écran de mutagenèse (Schoonheim et al., 2010). En raison d’une duplication du génome entier ancestral, les mutants scn1Lab du poisson zèbre sont haploinsuffisants pour Nav1.1 et analogues aux souris Scn1a +/− ou aux patients atteints du syndrome de Dravet. Des comportements convulsifs et des épisodes de décharge électrographique interictale brève et de longue durée de type ictal polyspike sont observés chez les larves mutantes dès 3 jours après la fécondation (dpf) avec une progression vers des phénotypes de saisie plus robustes entre 4 et 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et coll., 2016). Les larves mutantes meurent prématurément et présentent des déficits métaboliques (Kumar et al., 2016), et sont résistants à de nombreux médicaments antiépileptiques (DEA) (Dinday et al., 2015). Semblable à la prise en charge clinique du syndrome de Dravet, une certaine atténuation de l’activité épileptique peut être obtenue avec du valproate, des benzodiazépines, des bromures, du stiripentol, ainsi qu’un régime cétogène (Baraban et al., 2013). En utilisant des larves de poisson-zèbre mutantes scn1Lab et une stratégie de criblage basée sur le phénotype en deux étapes, nous avons maintenant criblé plus de 2300 composés. Le clemizole, un antagoniste des récepteurs de l’histamine (H1) de première génération, a été identifié comme un inhibiteur puissant de l’activité grippale comportementale et électrographique (Baraban et al., 2013). Les antihistaminiques, cependant, sont contre-indiqués dans les populations d’épilepsie pédiatrique (Miyata et al., 2011) et l’analogue du récepteur H1 chez le poisson zèbre montre moins de 50 % de similitude avec l’humain (Peitsaro et al., 2007). Ici, nous utilisons des modèles de poissons-zèbres précliniques pour démontrer que le clémizole, mais pas les antihistaminiques, exercent une activité antiépileptique. Sur la base de la liaison au ligand et d’un dépistage ciblé supplémentaire de médicaments chez le poisson zèbre mutant scn1, nous avons identifié plusieurs modulateurs de la sérotonine (5-HT) comme efficaces pour supprimer les crises, y compris deux composés (trazodone et lorcasérine) approuvés par la FDA. La Lorcasérine (Belviq®) a été prescrite dans le cadre d’un programme d’utilisation compassionnelle à des enfants atteints du syndrome de Dravet et a entraîné une réduction de l’activité épileptique chez certains patients. Nous proposons que la modulation de la signalisation 5-HT représente une nouvelle intervention thérapeutique pour cette épilepsie infantile catastrophique.

Matériaux et méthodes

Entretien du poisson zèbre

Surveillance des saisies

À 5 dpf, des larves individuelles de poisson zèbre ont été placées dans un seul puits d’une microplaque claire à fond plat de 96 puits contenant des milieux embryonnaires. Les larves ont été sélectionnées au hasard car la détermination du sexe n’est pas possible à ce stade. Des microplaques ont été placées à l’intérieur du dispositif de suivi de mouvement DanioVision et acclimatées pendant 20 min à température ambiante. Des tracés de locomotion ont été obtenus pour chaque puits pendant une période d’enregistrement de 10 min à l’aide d’un système DanioVision exécutant le logiciel EthoVision XT (DanioVision, Noldus Information Technology); les paramètres de détection de seuil pour identifier les objets plus sombres que l’arrière-plan ont été optimisés pour chaque expérience. La notation des crises a été réalisée à l’aide de l’échelle en trois étapes suivante établie pour les crises induites par le pentylènetétrazole (Baraban et al., 2005): Stade 0, pas ou très peu d’activité de nage; Stade I, augmentation, brefs épisodes d’activité de nage; Stade II, comportement de nage circulaire rapide de type « tourbillon »; et Stade III, convulsions paroxystiques de type clonus du corps entier et brève perte de posture. Les poissons sauvages sont normalement notés au stade 0 ou I. Les graphiques ont été analysés pour la distance parcourue (en millimètres) et la vitesse moyenne (en millimètres par seconde). Comme indiqué précédemment (Winter et al., 2008; Baraban et coll., 2013), les changements de vitesse étaient l’analyse la plus sensible du comportement des crises.

Pour les études d’électrophysiologie, les larves de poisson-zèbre ont été brièvement paralysées par de l’α-bungarotoxine (1 mg / ml) et immobilisées dans de l’agarose à 1,2%; des enregistrements de potentiel de champ local ont été obtenus à partir de structures du cerveau antérieur en utilisant une technique à une seule électrode, comme décrit précédemment (Baraban et al., 2005; Hong et coll., 2016). Des séances d’enregistrement du potentiel de champ local incorporé à l’agarose de 10 à 30 min ont été obtenues pour chaque poisson à 1 kHz. Le système iZAP (Hong et al., 2016) a été utilisé pour la surveillance non invasive à long terme du poisson zèbre en l’absence d’agent paralysant. Le système piège de manière autonome plusieurs larves de poisson zèbre sous plusieurs électrodes de surface intégrées dans les chambres microfluidiques. Les larves de scn1Lab ont été surveillées en continu pendant 5 h. Le potentiel de champ électrique a été enregistré à 1 kHz en continu, sauf des pauses de 2 à 3 min pour le changement de milieu pour le traitement et le lavage des composés. Les données enregistrées ont été analysées à l’aide de MATLAB pour les graphiques de potentiel de champ et l’analyse de fréquence.

Criblage de la bibliothèque de composés

Les composés pour le criblage des médicaments ont été achetés auprès de Selleck Chemicals et ont été fournis sous forme de solutions DMSO de 10 mM. La Bibliothèque de Ligands de canal ionique de Selleck (Catalogue # L2700), la Bibliothèque de composés GPCR (Catalogue #L2200) et une bibliothèque de modulation 5-HT personnalisée ont été utilisées pour le criblage. Les composés de bibliothèque sont énumérés dans le tableau supplémentaire 1. Dans tous les écrans de la bibliothèque de médicaments, les composés ont été codés et des expériences ont été effectuées par des chercheurs aveugles à la nature du composé. Des enregistrements de base du comportement de locomotion ont été obtenus à partir de mutants dans des milieux embryonnaires, comme décrit ci-dessus; un deuxième tracé de locomotion a ensuite été obtenu après un changement de solution vers un composé test et une période d’équilibre de 20 min. Les composés pour les études de locomotion ont été dissous dans des milieux embryonnaires et ont été testés à une concentration de 250 µM, avec une concentration finale de DMSO de 2,5%.

Les critères pour une désignation de coup positif étaient les suivants : (i) une diminution de la vitesse moyenne de ≥40 %; et (ii) une réduction du comportement de saisie au stade 0 ou au stade I dans la parcelle de locomotion pour au moins 50 % des poissons testés. Chaque composé d’essai classé comme « hit positif » dans le test de locomotion a été évalué pour sa toxicité par visualisation directe sur un stéréomicroscope après une exposition au médicament de 90 min. Chez au moins 50 % des poissons testés, la toxicité (ou la mortalité) a été définie comme l’absence de battements ou de mouvements du cœur visibles en réponse à une stimulation externe. L’hyperexcitabilité a été définie comme un composé provoquant une augmentation ≥40 % de la vitesse de nage et/ou une activité grippale de stade III chez au moins 50 % des poissons testés. Les résultats positifs identifiés dans l’écran de locomotion primaire ont été confirmés à l’aide de la méthode de dépistage de locomotion dans un deuxième essai avec une couvée indépendante de poisson zèbre. Les composés ont ensuite été achetés séparément de Sigma-Aldrich et testés une troisième fois en utilisant la méthode de dépistage de la locomotion sur une couvée indépendante de poisson zèbre. Les médicaments qui réduisaient la vitesse de nage moyenne au-dessus du seuil et qui étaient non toxiques dans les trois essais de locomotion indépendants ont été analysés plus en détail à l’aide du test électrophysiologique. Dans les études d’électrophysiologie, les médicaments ont d’abord été confirmés à une concentration de 250 µM à l’aide du test de locomotion, puis le même poisson zèbre a été évalué à l’aide d’un enregistrement de potentiel de champ local. Tout le dépistage a été effectué avec des composés codés et analysés par des enquêteurs en aveugle à l’identité du composé.

Analyse phylogénétique

L’analyse phylogénétique des séquences de protéines HTR2 humaines et HTR2 du poisson zèbre a été réalisée avec le logiciel PhyML selon les paramètres de test du rapport de vraisemblance de type SH (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Les séquences de protéines ont été dérivées de HTR2A humain d’Ensembl (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) et du poisson zèbre htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b ( ENSDART00000104569), htr2cl1 (ENSDART00000024191) séquences.

Analyse quantitative en temps réel de l’expression de l’ARNm

Les niveaux d’expression des gènes htr2 du poisson zèbre ont été examinés à l’aide d’ARN mis en commun à partir de 25 têtes ou queues de 5 larves mutantes homozygotes de type sauvage dpf ou scn1Lab, et de cerveaux disséqués à partir de poissons zèbres mâles adultes de type sauvage individuels. L’ARN total a été extrait à l’aide du réactif TRIzol® (Invitrogen), selon le protocole du fabricant et traité avec de la DNase I (Invitrogen). L’ARNm purifié a été rétrotranscrit en ADNc à l’aide du Système de synthèse Premier brin SuperScript®III (Invitrogen) avec un mélange d’oligo (dT) 20. Les niveaux d’expression des gènes htr2 du poisson zèbre et du facteur d’élongation de la traduction eucaryote 1 alpha 1, comme 1 (eef1a1l1) ont été déterminés à l’aide d’une machine de PCR en temps réel StepOne™ (Applied Biosystems). Des réactions ont été réalisées en volumes de 20 µl sur plaques à 96 puits à l’aide de SYBR®Green Master Mix (Applied Biosystems), avec une amorce de 250 nM et 3 µl d’ADNc. Les séquences oligonucléotidiques sont énumérées dans le Tableau complémentaire 2. Les données ont été analysées à partir de trois expériences indépendantes. Les données ont été exprimées en valeurs Ct et utilisées pour déterminer les valeurs ΔCt.

Études sur l’homme

Après l’identification réussie des composés de notre modèle de poisson zèbre et la prise en compte de la pharmacocinétique, Belviq® (lorcaserin) a été prescrit aux enfants dans le cadre d’un protocole d’utilisation compassionnelle à l’Hôpital pour enfants du Colorado (IND 125307). Les enfants qualifiés pour l’utilisation de Belviq® s’ils présentaient une mutation SCN1A ou un diagnostic clinique de syndrome de Dravet et ont échoué à au moins deux médicaments, y compris le stiripentol dans certains cas et à l’exclusion des bloqueurs des canaux sodiques. Les enfants devaient subir un électrocardiogramme et un échocardiogramme au départ et tous les 6 mois pendant l’utilisation du produit. En outre, ils devaient avoir des visites de suivi tous les 3 mois pour assurer une croissance adéquate, ainsi que pour évaluer les effets secondaires supplémentaires. Des tests de laboratoire étaient nécessaires tous les 6 mois pour inclure des tests hématologiques, des tests de la fonction hépatique et des tests de la fonction rénale. La dose de Belviq® a été initiée à 2,5 mg au coucher et a augmenté progressivement chaque semaine au besoin jusqu’à une dose maximale de 10 mg deux fois par jour ou de 0,3 mg/kg/jour — selon la première éventualité.

L’approbation du conseil d’examen institutionnel a été obtenue pour la collecte rétrospective de données, y compris une renonciation au consentement. Les données ont été extraites d’un examen rétrospectif des dossiers médicaux électroniques de l’Hôpital pour enfants du Colorado, notamment l’âge, les types de crises et la fréquence avant et après l’utilisation de Belviq®, les événements indésirables, la dose de Belviq® et l’utilisation concomitante de médicaments.

Analyse statistique

Les données sont présentées comme la moyenne ± erreur-type de la moyenne (MEB), sauf indication contraire. Pour la comparaison entre deux groupes, le test t de Student a été utilisé. Lorsque la variance n’avait pas de distribution normale, le test U de Mann-Whitney non paramétrique a été utilisé. ANOVA unidirectionnelle après le test de comparaison multiple de Dunnett pour analyse par rapport à un échantillon témoin ou des comparaisons multiples par paires de Holm-Sidak entre les moyennes. Les différences considérées comme statistiquement significatives sont indiquées par des astérisques (*P < 0,05; **P < 0,01).

Résultats

Effet du clémizole sur le comportement de convulsions chez le poisson zèbre

Nous avons traité des larves mutantes scn1Lab (5 dpf) avec du clémizole à des concentrations comprises entre 30 et 400 µM, puis nous avons surveillé l’effet sur le comportement de convulsions spontanées à l’aide d’un logiciel de suivi automatisé de la locomotion. Sur la base de 250 essais répétés de contrôle de la locomotion chez des mutants scn1Lab non traités, une réduction de la vitesse de nage moyenne ≥40% (> 1,5 × SD) par rapport à la valeur initiale a été fixée comme seuil pour une suppression positive du comportement épileptique. Clémizole (Fig. 1A) ont présenté une activité antiépileptique à 300 et 400 µM (exposition de 30 min) et à 100 µM (exposition de 90 min) (Fig. 1B); les expositions prolongées étaient toxiques aux concentrations les plus élevées. Pour déterminer si le clémizole peut supprimer le comportement de convulsions spontanées chez un deuxième mutant scn1 de poisson zèbre, nous avons sélectionné des larves mutantes scn1Laa (5 dpf) dans le test de suivi de la locomotion. Les larves sont identifiées comme étant des convulsions de stade III (par exemple, convulsions de tout le corps, activité de nage à grande vitesse et brève perte de posture; Fig. 1C) ont été confirmés comme présentant des décharges électrographiques avec des composants de type interictal et ictal dans des enregistrements de terrain ultérieurs du cerveau antérieur (Fig. 1D). La vitesse de nage moyenne des larves identifiées comme étant des poissons-zèbres mutants S3 ou  » putatifs scn1Laa  » était significativement plus élevée que pour les témoins frères ou toutes les larves testées (Fig. 1E); les mutants ont été confirmés comme homozygotes scn1Laa par PCR post hoc. Nous avons ensuite testé des médicaments précédemment démontrés pour supprimer les crises spontanées dans le syndrome de Dravet et les mutants scn1Lab (stiripentol de 250 µM et diazépam de 250 µM) ainsi que la lamotrigine de 250 µM (un DEA pouvant aggraver les crises dans le syndrome de Dravet). Comme prévu, le stiripentol et le diazépam, mais pas la lamotrigine, ont significativement supprimé le comportement de convulsions chez les larves mutantes de scn1Laa ; le clémizole de 250 µM a également été efficace dans ce test (Fig. 1F). Ensemble, ces études démontrent que le clémizole peut supprimer le comportement épileptique de deux lignées différentes de poissons zèbres mutants scn1.

Étude du mécanisme d’action du clémizole

Le dépistage secondaire de médicaments utilisant des mutants scn1Lab

Criblage tertiaire pour identifier des composés de plomb prometteurs pour la clinique

5- Expression des récepteurs HT chez les larves de poisson zèbre

Comme le clémizole a une affinité de liaison significative avec HTR2A et HTR2B, et que la trazodone et la lorcasérine sont des modulateurs de signalisation 5-HT, nous avons cherché à confirmer l’expression de ces récepteurs chez le poisson zèbre. L’alignement de la séquence protéique des récepteurs HTR2 humains et du poisson zèbre a révélé une conservation évolutive avec les orthologues du poisson zèbre, Htr2aa et Htr2ab présentant tous deux une identité protéique de 59,3% avec le HTR2A humain; et un seul orthologue HTR2B, Htr2b montrant une identité protéique de 62,0%. La quantification du niveau d’expression de htr2 à l’aide de têtes ou de queues isolées de larves mutantes de type sauvage ou de type scn1Lab de 5 dpf a révélé une expression enrichie de htr2a et de htr2cl1 dans la tête. Des résultats similaires ont été obtenus à partir de cerveaux de poissons-zèbres sauvages adultes, car les larves mutantes ne survivent pas jusqu’à l’âge adulte (fig. 4).

Réduction de la fréquence des crises chez les patients atteints du syndrome de Dravet

Le syndrome de Dravet est une épilepsie infantile catastrophique et un trouble rare (http://www.rarediseases.org/) avec des résultats débilitants, notamment une épilepsie intraitable, un développement cognitif sévèrement limité et un risque de SUDEP. Nos données précliniques confirment que la modulation de la signalisation 5-HT peut supprimer les crises associées aux mutations de perte de fonction du SCN1A. Étant donné que les modulateurs 5-HT identifiés sont des composés approuvés par la FDA avec des profils de sécurité connus, le traitement avec ces médicaments réutilisés pourrait modifier la fréquence des crises chez les enfants atteints du syndrome de Dravet. Cette approche translationnelle cible des maladies rares et dévastatrices pour lesquelles des essais cliniques à grande échelle ne sont pas réalisables (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

Car le clémizole n’est pas actuellement fabriqué ou disponible en formulation de qualité clinique et la trazodone peut agir comme agoniste ou antagoniste des récepteurs 5-HT, selon la concentration (Maj et al., 1979; Marcoli et coll., 1998), nous avons choisi d’évaluer Belviq® (lorcaserin) dans le cadre d’un programme d’utilisation compassionnelle hors étiquette chez une petite population d’enfants atteints du syndrome de Dravet. Il a été démontré que ces enfants étaient résistants à au moins cinq DEA approuvés. Cinq enfants (âge moyen: 11,8 ans; intervalle: 7-18 ans) hétérozygotes pour une délétion dans SCN1A ont été traités de manière prospective avec Belviq® et suivis longitudinalement à l’Hôpital pour enfants Colorado (Aurora, CO). Le protocole de traitement a été approuvé par le Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB), et les parents de patients atteints du syndrome de Dravet ont consenti par écrit à la participation de leur enfant. Nous avons passé en revue rétrospectivement le nombre de crises atoniques, myocloniques et tonico-cloniques généralisées (CTG) rapportées dans le journal, les effets secondaires et les DEA simultanés.

Les caractéristiques cliniques des enfants atteints du syndrome de Dravet traités par Belviq® sont résumées dans le tableau 1. Il n’y a pas eu de décès parmi les cinq patients traités par Belviq®, et Belviq® a été bien toléré sans effets indésirables graves entraînant l’arrêt du traitement. Pendant le traitement de Belviq® hors étiquette, un patient n’a pas eu de crise convulsive pendant 3 semaines, un patient n’a pas eu de crise convulsive pendant 2 semaines et un troisième patient a eu 1 à 2 jours sans crise convulsive par semaine. Les cinq patients présentaient une réduction du nombre total de crises. Les crises tonico-cloniques généralisées ont été significativement réduites chez les patients 1, 2 et 3. En effet, le patient 2 a connu une réduction de 90% des crises tonico-cloniques généralisées sans avoir besoin de médicaments de secours. Deux patients restent sous Belviq® sans augmentation de la fréquence des crises et, comme prévu, l’effet indésirable le plus fréquent observé a été une diminution de l’appétit. Un patient a repris le médicament une deuxième fois avec une amélioration provisoire pendant une courte période de temps, puis a diminué.

Discussion

Le clémizole, un antihistaminique de première génération découvert dans les années 1950 (Zierz et al., 1952), a été identifiée comme une thérapeutique potentielle pour le traitement du syndrome de Dravet en utilisant le poisson-zèbre mutant scn1Lab pour cribler des bibliothèques de médicaments réutilisés (Baraban et al., 2013; Dinday et coll., 2015). Ici, nous avons confirmé une activité antiépileptique pour le clémizole en utilisant un deuxième modèle de mutant de poisson zèbre scn1. Malheureusement, le clémizole est rapidement métabolisé chez la souris avec une demi-vie plasmatique de < 10 min (comparativement à 3,4 h chez l’homme) (Nishimura et al., 2013), limitant son évaluation dans les modèles murins. Utilisé avec succès comme antihistaminique (Zierz et al., 1952; Jacques et coll., 1960) avec des études aiguës et chroniques signalant une faible toxicité (Finkelstein et al., 1960), le clemizole n’est plus fabriqué et n’est actuellement pas disponible pour une administration clinique hors étiquette. Faute de moyens pour évaluer efficacement le clémizole dans les modèles de rongeurs précliniques, nous avons utilisé le poisson-zèbre pour l’engagement de cibles (récepteurs 5-HT) et l’identification de médicaments apparentés (trazodone et lorcasérine) avec des profils de sécurité appropriés facilitant une traduction rapide vers une application clinique. L’utilisation compassionnelle et la prescription non indiquée sur l’étiquette de Belviq® (lorcaserin) à des patients atteints du syndrome de Dravet intraitables sur le plan médical sont également décrites.

Les antagonistes des récepteurs H1 antihistaminiques sont normalement contre-indiqués chez les populations de patients pédiatriques (Miyata et al., 2011) et le dépistage de ces médicaments a confirmé leur incapacité à supprimer (et dans certains cas à exacerber) les crises chez le poisson zèbre scn1. Les données de liaison ont révélé une affinité de la clémizole jusqu’alors inconnue pour les récepteurs HTR2A et/ou HTR2B. Un criblage phénotypique ultérieur de banques ciblées a identifié deux composés modulant la 5-HT, la trazodone et la lorcasérine, capables de supprimer les crises comportementales et électrophysiologiques d’une manière comparable au clémizole. Belviq® (lorcaserin) est un agoniste HTR2C approuvé par la FDA et prescrit pour la gestion chronique du poids (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (trazodone) est également un antidépresseur approuvé par la FDA couramment prescrit pour les troubles du sommeil (Mendelson, 2005). Il est fréquemment classé comme antagoniste inverse de HTR2A et de HTR2C et inhibiteur de l’absorption de 5-HT (Stahl, 2009). Cependant, des études chez le rat suggèrent que la trazodone, ou son métabolite méta-chlorophénylpipérazine (mCPP), peut agir comme agoniste du HTR2C à des concentrations plus élevées (Maj et al., 1979; Marcoli et coll., 1998). Il a notamment été démontré précédemment que le traitement chronique à la trazodone était protecteur contre les convulsions induites par électroconvulsions chez la souris (Chavan et al., 2010; Borowicz et coll., 2012), à l’appui de nos données du poisson zèbre mutant scn1Lab. Une action médiée par les récepteurs 5-HT pour le clémizole est également cohérente avec un récent criblage phénotypique où les modulateurs de la signalisation sérotoninergique (y compris le clémizole) se sont révélés être un traitement efficace dans un modèle préclinique de la maladie de Machado-Joseph (Teixeira-Castro et al., 2015); et des études suggèrent ici que le clémizole et la trazodone justifient un développement ultérieur pour les tests hors étiquette chez les patients atteints du syndrome de Dravet.

Nos résultats s’ajoutent également à un nombre croissant de preuves suggérant une modulation de la signalisation sérotoninergique en tant que puissant inhibiteur de l’activité épileptique, en particulier dans les épilepsies infantiles catastrophiques comme le syndrome de Dravet. Récemment, 7 des 10 patients traités à faible dose par la fenfluramine, un bloqueur de recapture de 5 HT, se sont déclarés indemnes de convulsions pendant 1 an (Ceulemans et al., 2016). Un léger épaississement d’une ou deux valves cardiaques a été rapporté chez deux de ces patients, ce qui concorde avec une relation possible entre l’utilisation de la fenfluramine et l’hypertension pulmonaire (Douglas et al., 1981; Ceulemans et coll., 2016). Chez l’homme, HTR2A et HTR2C sont exprimés dans le SNC, tandis que l’expression de HTR2B est enrichie dans le cœur (Lambe et al., 2011; Meltzer et coll., 2013). Plus précisément, HTR2C est exprimé sur une sous-population d’interneurones inhibiteurs (Liu et al., 2007) et l’activation de ces récepteurs par 5-HT augmente l’inhibition synaptique médiée par le GABA (Boothman et al., 2006), c’est-à-dire le mécanisme d’action antiépileptique sous-jacent de nombreux médicaments antiépileptiques couramment prescrits. En effet, la plupart des études précliniques suggèrent que l’activation des récepteurs HTR2A et/ ou HTR2C a des effets antiépileptiques (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et coll., 2015), qui est un mécanisme d’action raisonnable reliant le clémizole, la lorcasérine, la trazodone et le bloqueur de recapture de 5 HT, la fenfluramine (Dinday et al., 2015; Ceulemans et coll., 2016). Fait intéressant, l’expression de htr2b dans le cerveau du poisson zèbre était relativement faible, suggérant en outre que ces médicaments exercent potentiellement une activité antiépileptique via l’activation des récepteurs HTR2A ou HTR2C. Fait intéressant, des études chez des mouches Drosophiles porteuses de la mutation humaine K1270T SCN1A dans le gène du canal para-sodique ont montré qu’une supplémentation avec un précurseur de 5-HT (5-hydroxytryptophane) sauve le phénotype de saisie induite par la chaleur (Schutte et al., 2014). De plus, une étude récente utilisant des mutants scn1Lab a évalué 13 composés de signalisation 5-HT et a également suggéré un rôle antiépileptique potentiel pour les modulateurs de la signalisation 5-HT (Sourbron et al., 2016). Cependant, ces dernières études sur le poisson-zèbre ont utilisé un protocole fondamentalement différent (exposition au médicament de 24 h par rapport à une exposition de 30 à 90 min) qui n’avait pas été précédemment validé comme identifiant avec succès les DEA utilisés dans le syndrome de Dravet (benzodiazépines, valproate, stiripentol, bromures et régime cétogène). De plus, les concentrations de médicaments environ 10 fois plus faibles que nous démontrent leur efficacité chez le poisson zèbre (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et coll., 2015), et signalant une action antiépileptique pour l’hallucinogène TCB-2 (Fig. 5), suggère que la comparaison directe des données provenant de laboratoires utilisant différentes procédures doit être interprétée avec prudence.

Dans l’ensemble, nous concluons que le poisson zèbre mutant est un modèle approprié pour le dépistage rapide et la découverte de nouveaux DEA qui, avec des profils d’innocuité appropriés, peuvent directement éclairer les soins cliniques pour les populations de patients à risque telles que le syndrome de Dravet.

Abréviations

Abréviations
• 5- HT

  sérotonine

• DAE

  antiépileptique

• dpf

  jours après la fécondation

• GPCR

  Récepteur couplé aux protéines G

• iZAP

  plateforme d’analyse intégrée du poisson zèbre

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Baraban, Brian Grone et Matthew Dinday en particulier, pour leur contribution utile discussions au cours de ces études.

Financement

Le C.S.B reconnaît le financement de NINDS R01 subvention no. NS079214, Prix Catalyseur UCSF et Fonds Sabbatique du Centre Raymond & Beverley Sackler.

Matériel supplémentaire

Du matériel supplémentaire est disponible sur Brain online.