Le chromodomaine Chp1 lie la queue H3K9me et le noyau de nucléosome pour assembler l’hétérochromatine

Plasmides et construction de souches

Les mutants Chp1CD pour l’expression et la purification ont été générés par PCR inverse en utilisant les amorces énumérées dans le tableau supplémentaire S2 à partir Plasmide de chromodomaines pET28a Chp1. Des essais de sauvetage de l’hétérochromatine ont été réalisés par introduction de plasmides contenant chp1 wt et de protéine mutante chp1 sous son promoteur endogène dans une souche chp1Δ (SP170, voir Tableau supplémentaire S3). le gène entier chp1 et son promoteur endogène (-949 pb depuis le début de la séquence codante chp1+) ont été clonés dans le plasmide pREP1. des mutants de chromodomaines chp1 ont été générés par PCR inverse en utilisant les amorces énumérées dans le tableau supplémentaire S2 et transformés dans la souche chp1Δ indiquée.

Pour l’intégration génomique, le plasmide pREP1 a été modifié pour remplacer le promoteur nmt1+ par la cassette d’intégration suivante : (SphI) Région au 5′ du gène Chp1 (Chromosome I, 2215500-2215055) (AscI) — Cassette de résistance HphMX6 – (SphI) Promoteur endogène Chp1 (Chromosome I, 2214829-2214664) — Séquence codante Chp1 — (BamHI) Terminateur Chp1 (Chromosome I, 2210976-2210582) (BamHI). La cassette d’intégration (à la fois la cassette chp1+ et la cassette chp1LOOP1B/2B) a ensuite été amplifiée par PCR et transformée par électroporation, en souches SP101, SP170 et SP64. Les cellules ont ensuite été sélectionnées sur des plaques YES + Hygromycine (50 mg ml − 1 Hygromycine). Des colonies uniques ont été isolées, criblées par PCR et séquencées pour l’insertion génomique de la cassette de résistance HphMX6 et des mutations LOOP1B/2B.

Des souches contenant des plasmides ont été cultivées sur un milieu Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu. Toutes les souches et plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans les tableaux supplémentaires S3 et S4.

Purification des protéines

His6-SUMO-Chp1CD et tous les mutants CD ont été exprimés en E. coli BL21 (DE3) (pLys) et purifié par chromatographie d’affinité à l’aide de résine Ni-NTA (GE Healthcare, Fribourg, Allemagne). His6-SUMO-Chp1CD contient un site de clivage de la thrombine entre deux balises.

Au total, 0,2 mM d’IPTG ont été ajoutés pour induire l’expression protéique suivie d’une croissance à 18 ° C O/ N. Les cellules ont été récoltées par centrifugation et remises en suspension dans du tampon de lyse (20 mm d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) pH 7,5, 150 mm de NaCl, 1 mm de dithiothréitol (DTT), 20 mm d’imidazole). Après surgélation, les cellules ont été décongelées et incubées pendant 30 min dans du lysozyme avant sonication (Branson Sonifier 250 – sortie 4, rapport cyclique 40). La suspension a été centrifugée (12000 g, 20 min à 4 °C) et le surnageant ajouté à la résine Ni-NTA pré-équilibré en tampon de liaison (HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mm, DTT 1 mM, imidazole 20 mM) et incubé pendant 30 min à 4 °C sous rotation. La résine est ensuite lavée à 5× avec du tampon de liaison et les protéines sont éluées dans du tampon d’élution (HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mm, DTT 1 mM, imidazole 300 mM). Chp1CD wt et les mutants ont ensuite été dyalisés O/N dans un tampon contenant 20 mm HEPES pH 7,5, 150 mm NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD a ensuite été purifié par filtration sur gel (Superdex 75 pg; GE Healthcare) et dialysé dans un tampon contenant 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mm DTT.

Essais de silençage

Les cellules pour les essais de silençage ont été cultivées à une DO 0,7-1, puis normalisées à une concentration finale de 1×107 cellules ml−1 de culture. Des dilutions en série décuplées ont été effectuées de sorte que la tache de densité la plus élevée contenait 1 × 105 cellules. Des cellules ont été repérées sur des plaques non sélectives (YES) et d’acide 5-fluoro-orotique (5-FOA 1 g l−1 5-FOA). Les plaques ont été incubées à 32 °C pendant 2-3 jours et imagées. Les cellules ont un gène rapporteur ura4 inséré dans des répétitions imr péricentromériques (locus hétérochromatique). Lorsque le gène rapporteur ura4 est réduit au silence, les cellules peuvent se développer sur un milieu contenant du 5-FOA. Lorsque l’hétérochromatine est perdue, le gène rapporteur ura4 est exprimé et les cellules ne peuvent pas se développer sur un milieu 5-FOA.

Détection des taux d’ARN par qPCR (RT-qPCR)

Des cultures de levure (10 ml) ont atteint un OD600 de 0,7 à 1,5. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans 500 µl de tampon de lyse (NaOAc 300 mM pH 5,2, dodécylsulfate de sodium à 1%) et 500 µl de phénol–chloroforme et incubées à 65 °C pendant 10 min avec un mélange constant. La fraction aqueuse a été séparée du phénol-chloroforme par centrifugation (10 min, 20 000 g) et l’éthanol précipité. Les acides nucléiques ont été traités avec de la DNase I (Roche, Bâle, Suisse) pendant 30 min à 37 °C suivi de 15 min à 75 °C d’inactivation thermique. L’ADN complémentaire a été synthétisé en utilisant 100 ng d’ARN et 1 pmol d’oligos d’ADN avec Exposant III (Invitrogen, Darmstadt, Allemagne) en utilisant des conditions standard. Les taux d’ARN ont été quantifiés avec qPCR en utilisant le kit qRT-PCR Dynamo Flash de Biozym et normalisés au gène euchromatique tdh1.

Des tests de déplacement de mobilité électrophorétique de l’ARN

Des tests de déplacement de l’ARN ont été effectués à la suite des conditions précédemment rapportées. Au total, 0.66 pmols d’ARN centromérique 30 nt radiomarqués 32P ont été incubés avec un chromodomaine Chp1 de 10 µM (type sauvage et mutant) dans un tampon contenant 20 mm de Tris-HCl pH 7,5, 100 mm de KCl, 0,5 mm de DTT et 3% de Glycérol. Pour l’ARN EMSA avec 100 transcrits centromériques nt dg, 2 pmol d’ARN radiomarqué 32P ont été incubés avec 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmol de protéine Chp1CD (mutant wt et LOOP1B/2B) dans un volume final de 15 µl. Le peptide H3K9me3 (Eurogentec, Köln, Allemagne) a été ajouté à un peptide 1: 1 Chp1CD-H3K9me, comme indiqué dans. L’incubation a été réalisée pendant 1 h sur glace et des échantillons (volume final de 20 µl) ont ensuite été chargés sur un gel natif Acrylamide-TBE à 10% (rapport Bis-Acrylamide 1:29). Pour les extractions d’ARN in vitro, 1 µg de SUMO-Chp1CD (mutant sauvage et LOOP1B/2B) a été lié à 15 µl de résine Ni-NTA (GE Healthcare) et le nucléosome H3K9ME3 a été ajouté pour assembler le complexe de nucléosome Chp1CD-H3K9ME3 en tampon de liaison (HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 75 mm, DTT 0,5 mM, imidazole 20 mM). Après lavage trois fois avec 50 µl de tampon de liaison, 2 pmols d’ARN dg 100nt marqué au 32P ont été ajoutés et incubés avec la résine de nucléosome Chp1CD sur glace pendant 1 h. La résine a été centrifugée à vitesse lente (60 g, 10 s) et le flux traversant collecté. La résine a été lavée trois fois avec au moins un tampon de liaison 3× (v / v) et le complexe Chp1CD-Nucléosome-ARN a été élué par addition de tampon imidazole 300 mM (HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 75 mm, DTT 0,5 mm, imidazole 300 mM), incubé pendant 1 h sur glace avec un mélange à intervalle de 5 min (fraction liée). Les échantillons ont été chargés sur un gel d’Acrylamide natif à 10% de TBE (rapport Bis-Acrylamide 1:29) et parcourus pendant 2 h à 10 mA à 4 °C. Après exposition nocturne, les gels ont été balayés à l’aide du phosphoimager TyphoonFLA9000.

Immunoprécipitation à la chromatine

Des cultures de levure (100 ml) ont été cultivées à une OD600 de 0,7 et réticulées avec du formaldéhyde à 3% à température ambiante pendant 15 min comme décrit. La réaction est éteinte avec de la glycine 125 mm pendant 10 min à température ambiante. Les cellules ont été remises en suspension dans du tampon de lyse 500 µl (HEPES 50 mM pH 7,5, 1.acétate de sodium 5 M, 5 mm MgCl2, 2 mm d’acide éthylènediaminetétraacétique, 2 mM d’acide éthylèneglycol tétraacétique, 0,1% de NP-40, 20% de glycérol) contenant des inhibiteurs de protéase (comprimés cocktail inhibiteurs de protéase, Roche, Complete, sans acide éthylènediaminetétraacétique). Les cellules congelées ont été lysées à l’aide du batteur à billes MP Biospec. Après lyse, l’extrait a été soniqué 35x pendant 30 s (Biorupteur, Diagénode, Seraing, Belgique) et filé à 13 000 g pendant 15 min pour obtenir le surnageant de chromatine. Pour l’ADN d’entrée, 50 µl du surnageant ont été utilisés. Pour les immunoprécipitations, les surnageants ont été normalisés en fonction de la concentration en protéines et incubés avec un anticorps anti-diméthylé H3K9 ou un anticorps anti-Chp1 (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 et Chp1, Abcam non. Ab18191), immobilisés sur des Dynabeads magnétiques, pendant 2 h à 4°C. Les billes et la protéine immobilisée ont été lavées 5x avec 1 ml de tampon de lyse. Les protéines ont été éluées par incubation avec 150 µl de tampon d’élution (50 mm de Tris-HCl pH 8,0, 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique, 1% de dodécylsulfate de sodium) à 65 °C pendant 15 min. Les réticulations ont été inversées par incubation à 65 °C pendant une nuit, suivie d’une dégradation de l’ARN par la RNase A et d’une dégradation des protéines par la Protéinase K. L’ADN a ensuite été récupéré par extraction phénol–chloroforme et précipitation à l’éthanol et quantifié à l’aide de qPCR. Le gène euchromatique tdh1 a été utilisé pour la normalisation. Les oligonucléotides utilisés dans les essais d’immunoprécipitation à la chromatine sont énumérés dans le Tableau supplémentaire S2.Reconstitution in vitro des nucléosomes

et méthylation (H3K9me3)

Des nucléosomes ont été reconstitués à l’aide d’histones de Xenopus laevis et de la séquence 601 comme décrit précédemment. La méthylation in vitro a été effectuée comme décrit. Le pic à + 42 Da a été observé dans la publication originale et il ne s’agit pas d’une contamination (Matt Simon, communication personnelle et décrit dans).

Formation et élution in vitro du complexe nucléosomique Chp1CD–H3K9me3 MLA

Au total, 5 µg de Chp1CD ont été liés à 15 µl de résine Ni-NTA dans un tampon de liaison (HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 75 mm, DTT 0,5 mm, imidazole 20 mM) pendant 20 min à 4 °C. La résine a été lavée une fois avec cinq volumes de tampon de liaison et 10 µg de nucléosomes analogues de méthyl lysine (MLA) H3K9me3 ont été ajoutés (les nucléosomes MLA ont été préalablement dialysés en tampon de liaison) dans un volume final de 20 µl et incubés 1 h sur glace avec une remise en suspension constante toutes les 5 min. Après incubation, la résine est centrifugée (60 g pendant 10 s) et l’écoulement est recueilli. La résine a ensuite été lavée trois fois avec cinq volumes de tampon de liaison. Le complexe SUMO-Chp1CD-H3K9me3Nucléosome a été élué par ajout de thrombine (Sigma, Munich, Allemagne) pendant 2 h sur glace dans 20 µl de tampon de liaison. La formation de complexes a ensuite été évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS sur des gels d’acrylamide à 15% et par coloration négative EM.

Essais de liaison aux peptides Chp1CD H3K9me3

Au total, 1 µg de peptide-Histone H3 (1-21)-GGK (Biotine) (Eurogentec) a été incubé avec 15 µl de résine d’agarose streptavidine (Invitrogen) dans des HEPES de 20 mM pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mm DTT. Environ 5 µg de Chp1CD (poids et mutants) ont ensuite été ajoutés dans un volume final de 20 µl et incubés pendant 1 h sur glace dans les mêmes conditions tampons. La résine a été lavée trois fois puis l’efficacité de liaison a été évaluée sur électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS sur gels d’acrylamide à 15%. La quantification de la liaison a été effectuée à l’aide du logiciel ImageJ. La liaison de chaque mutant a été normalisée en poids Chp1CD pour chaque essai.

Thermophorèse à l’échelle microscopique (MST)

Pour la balise MST SUMO a été retirée des constructions Chp1CD avec la protéase Ulp1. Au total, 100 µg de Chp1CD de type sauvage et mutant ont été marqués par fluorescence à l’aide du kit de marquage des protéines Monolithes MO-L003 BLUE-NHS (Réactif aux Amines) selon les instructions du fabricant (Nanotemper Technologies, Munich, Allemagne). Un rapport Fluorescence: Protéines 1: 1 a été estimé à l’aide de la fonction « Protéines et étiquettes » du logiciel Nanodrop1000 et chaque chromodomaine de Chp1 a été exécuté sur un gel d’acrylamide SDS à 15% pour normaliser les concentrations à 0,1 mg ml−1.Des réactions

ont été assemblées dans 20 µl avec 300 ng de Chp1CD fluorescent, et des quantités croissantes de peptide -Histone H3 (1-21)-GGK (Biotine) (Eurogentec) ou de nucléosomes H3K9ME3, dans un tampon contenant 10 mm de Tris-HCl pH 7,5, 150 mm de NaCl, 0,5 mm de TNT et 0,05% de Tween-20. Pour les dosages de liaison aux nucléosomes H3K9ME3, du glycérol a été ajouté à la concentration finale de 10%. Pour les dosages H3K9me3, ces dilutions ont été utilisées pour les mesures: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Pour le dosage du nucléosome H3K9ME3, nous avons utilisé les dilutions suivantes pour les mesures: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 µM, 1,2 µM, 1,4 µM, 1,6 µM, 2,4 µM.

Des essais MST ont été effectués à l’aide de capillaires traités standard (Nanotemper Cat #K002) sur le NT.115 Instrument monolithe. Toutes les mesures ont été effectuées en utilisant 80% de LED et 40% de puissance MST, avec un temps de fonctionnement laser de 30 s et un temps d’arrêt laser de 5 s. Pour chaque expérience, cinq mesures simples ont été effectuées.

Les données ont été analysées avec le logiciel GraphPad Prism version 6.00 (Logiciel GraphPad, San Diego, CA, États-Unis) et le logiciel SigmaPlot version 13.0 (Logiciel Systat, San Jose, CA, États-Unis). Pour les tests de liaison peptidique, les courbes montrant une tendance sigmoïde distincte, nous avons ajusté l’équation Sigmoïdale asymétrique logistique à cinq paramètres de Richards et calculé automatiquement le Kd. Pour les tests de liaison au nucléosome H3K9ME3, comme la tendance des données brutes n’était plus sigmoïde pour toutes les protéines analysées, une équation polynomiale du troisième ordre (cubique) a été utilisée pour ajuster et comparer les points de données brutes du Chp1CD de type sauvage et des différents mutants. Kd a été calculé sur la base de la fonction « Interpolation » du logiciel GraphPad prism, en utilisant la valeur liée/ non liée à 50% sur l’axe y.

Digestion de la trypsine des nucléosomes

Des nucléosomes sans queue ont été préparés par incubation de nucléosomes reconstitués avec une résine TPCK-Trypsine immobilisée (Thermoscientifique) pendant 2 h à température ambiante dans un tampon contenant 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mm DTT. La digestion tryptique génère des bandes d’histones très définies et elle a été caractérisée en détail où la trypsine coupe exactement.

Des essais de liaison aux nucléosomes avec des mutants Chp1CD

Des essais de liaison aux nucléosomes de type sauvage et mutant Chp1CD ont été effectués comme décrit précédemment pour la formation du complexe nucléosomique MLA Chp1CD-H3KC9me3 dans des HEPES de 20 mM pH 7,5, 100 mm KCl, 0,5 mm DTT, 40 mm imidazole. Les résines et les intrants ont été exécutés sur des gels d’acrylamide 15% d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS-polyacrylamide. Tous les échantillons ont ensuite été analysés par immunoblot avec une histone anti-H3 (AbCam, Cambridge, Royaume-Uni, 1:1000), ou un anticorps anti-H3K9me3 (AbCam, 1:1000), une IgG-HRP anti-chèvre (BioRad, 1:3000) une IgG-HRP anti-lapin (BioRad, Munich, Allemagne, 1:3000).

Microscopie électronique à taches négatives

Après élution de la thrombine, 3 µl du complexe nucléosomique Chp1CD–H3KC9me3 ont été repérés sur une grille de cuivre déchargée par lueur (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Allemagne) recouverte d’un film de carbone de 1 nm pendant 45 s. Après un lavage rapide à l’eau, la grille a été incubée pendant 15 s dans 2% des cellules. Acétate d’uranyle. Des images de taches négatives ont été recueillies au microscope électronique à transmission FEI Morgagni.

Cryo-EM sur le complexe de nucléosomes Chp1CD-H3KC9me3

Des grilles Cryo-EM (grilles à revêtement de carbone trouées, couche de carbone Cu 300 Mesh R3/3 +1 nm, Quantifoil) ont été préparées à l’aide d’un Vitrobot Mark IV (Société FEI). Les données Cryo-EM ont été collectées à l’aide d’un microscope électronique à transmission Titan-Krios (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) à 200 keV et d’un grossissement de 113 000× au plan du CCD à l’aide d’une caméra CMOS F816 (TVIPS GmbH, Gauting, Allemagne), ce qui donne une taille de pixel d’image de 1,2 Å par pixel à l’échelle de l’objet (la taille de pixel du CCD était de 13,6 µm). Pour la collecte automatisée des données, le logiciel EM-TOOLS a été utilisé et les données ont été collectées dans une plage de défocalisation de 10 000 à 40 000 Å.

Au total, 2 480 micrographies pour le complexe Chp1CD–H3KC9me3 et 991 micrographies pour le contrôle du nucléosome H3KC9me3, respectivement, ont été sélectionnées pour l’analyse d’une seule particule à l’aide du progiciel Xmipp (Figure supplémentaire S9A). Quelques milliers de particules ont été cueillies manuellement et soigneusement nettoyées du bruit. Ces particules ont ensuite été utilisées pour le prélèvement de particules semi-automatique et automatique dans XMIPP. La fonction de transfert de contraste a été déterminée par CTFFIND3. Des particules individuelles sélectionnées ont été converties en formats d’ARAIGNÉE et de RELION pour une analyse plus approfondie (Figure supplémentaire S9B). Les moyennes de classes bidimensionnelles ont été générées avec le progiciel RELION (Figure supplémentaire S9C). Les moyennes des mauvaises classes ont été supprimées de l’analyse ultérieure des données. Les améliorations tridimensionnelles ont ensuite été effectuées avec les logiciels SPIDER et RELION.

La classification non supervisée des particules a été effectuée par ensemencement aléatoire avec les cartes de densité complètes sans classification ciblée dans le progiciel SPIDER. Les tentatives d’utilisation d’une classification ciblée ont entraîné un fort biais et un surajustement du bruit dans les régions d’intérêt. Par conséquent, nous n’avons pas utilisé de classification ciblée pour réduire les biais. Dans la classification initiale effectuée dans SPIDER, les classes C0–C6 et N0–N5 ont été rétroprojetées en utilisant des angles des cartes C0 et N0 et ces classes n’ont pas été complètement affinées. Ici, nous voulions juste sélectionner des classes qui avaient une densité supplémentaire liée au nucléosome. Des cartes générant des particules avec différentes densités de Chp1CD ont été séparées et classifiées. Environ 20 séries de classifications d’ensemencement aléatoires ont été effectuées jusqu’à ce que nous ayons partitionné les particules en cinq groupes différents (Figure supplémentaire S3). Les classes C11 à C15 ont été affinées avec le progiciel RELION. Les raffinements finaux des complexes nucléosomiques Chp1CD-H3K9ME3 (classe C15) et le contrôle des nucléosomes ont été effectués avec le progiciel RELION. Pour le raffinement final, la référence a été filtrée à ~ 50 Å (filtre RELION). La référence que nous avons utilisée n’avait aucune des caractéristiques observées dans les reconstructions raffinées (la double hélice d’ADN n’est pas résolue, le sillon majeur n’est pas visible, les hélices α ne sont pas résolues). Cela n’indique aucun biais de référence dans notre structure. La résolution du contrôle des nucléosomes a atteint 7,3 Å en utilisant l’auto-affinage en symétrie RELION et C2 (coupure FSC 0,143 de deux cartes raffinées indépendamment). Le complexe nucléosomique Chp1CD-H3K9ME3 a été affiné à 10 Å (coupure FSC de 0,143 de deux cartes raffinées indépendamment) sans application de symétrie.

La résolution locale a été calculée à l’aide du logiciel ResMap (volume unique final, minRes = 7, maxRes = 14, automask). La résolution moyenne déterminée par Resmap est de 9,4 Å pour le complexe nucléosomique Chp1CD-H3K9ME3, confirmant indépendamment la résolution moyenne précédemment déterminée de 10 Å (FSC 0,143) (Figure 1c). Pour le complexe nucléosomique Chp1CD-H3K9ME3, la résolution locale pour le nucléosome est de 9-10 Å et pour le ligand ~ 10 Å (Figure 2a). La distribution de l’angle d’Euler pour les reconstructions finales est illustrée à la fois pour le nucléosome et le complexe nucléosomique Chp1CD-H3K9ME3 (Figure supplémentaire S9D). Toutes les orientations sont présentes avec une préférence pour les vues de dessus et de côté.

Des modèles moléculaires ont été construits à l’aide d’un progiciel Chimera utilisant un montage rigide de structures cristallines. L’ajustement dans la densité a été effectué avec les options Chimera « Ajustement dans la carte » et « Ajustement dans les segments » avec seulement des ajustements manuels mineurs. La segmentation et la visualisation de toutes les cartes cryo-EM ont également été effectuées avec le logiciel Chimera.