L’anticorps clivé-Caspase-3 est un marqueur de l’activité DRONC de type Caspase-9 chez la Drosophile

Le marquage par l’anticorps clivé-Caspase-3 persiste chez les doubles mutants dcp-1 drICE

Pour évaluer la spécificité de l’anticorps clivé-Caspase-3 – Anticorps caspase-3, nous avons analysé les disques imaginaires oculaires des larves du troisième stade. Dans les disques imaginaux oculaires de type sauvage, l’anticorps détecte quelques cellules mourantes dispersées dans le disque (Figure 1a). Étonnamment, dans les disques oculaires doublement mutants pour les allèles nuls dcp-1Prev et drICEΔ1 (réf.14, 15), l’anticorps clivé-Caspase-3 marque encore les cellules (Figure 1b). Le marquage dans les mutants doubles dcp-1Prev drICEΔ1 se produit en grappes (Figure 1b), similaire à ce qui a été observé précédemment lorsque la mort cellulaire était bloquée par l’expression de l’inhibiteur de la Caspase-3 P35.3 Ces observations suggèrent que l’anticorps clivé-Caspase-3 détecte toujours un épitope en l’absence des protéines de type Caspase-3 DCP-1 et DRICE. Néanmoins, comme l’apoptose à ce stade ne se produit pas selon un schéma défini, nous étions incertains de la spécificité de ces signaux de marquage.

Par conséquent, nous avons utilisé des transgènes GMR-hid, un modèle apoptotique bien caractérisé5, pour examiner plus en détail la spécificité de l’anticorps clivé-Caspase-3. Grâce à l’expression par GMR du gène pro-apoptotique hid spécifiquement dans la moitié postérieure de l’œil en développement, les transgènes GMR-hid induisent l’apoptose en deux ondes distinctes, comme le montrent l’anticorps Caspase-3 clivé et le marquage tunel28 (Figure 1c, d). Pour évaluer la spécificité de l’anticorps clivé-Caspase-3, nous avons examiné des disques oculaires GMR-hid qui étaient doublement mutants pour dcp-1Prev et drICEΔ1. Conformément aux attentes, la perte de dcp-1Prev et de drICEΔ1 abroge complètement l’apoptose TUNEL-positive dans les disques GMR-hid (Figure 1f). De manière surprenante, cependant, les disques oculaires dcp-1Prev drICEΔ1 à double mutant GMR-hid présentaient toujours une forte immunoréactivité avec l’anticorps clivé-Caspase-3 (Figure 1e). Ainsi, l’anticorps clivé-Caspase-3 ne détecte pas ou non seulement le DRICE et/ou le DCP-1. Nous notons cependant que l’apparence de marquage de l’anticorps clivé-Caspase-3 change en l’absence de DCP-1 et de DRICE (comparer les figures 1c et e). Le signal de marquage n’est plus limité à deux ondes distinctes (Figure 1c), mais remplit tout le compartiment postérieur du disque oculaire et est confiné aux cellules inter-temporales (Figure 1e). Un changement similaire du modèle de marquage a été rapporté pour le marquage des anticorps CM1 lors de l’expression de l’inhibiteur de caspase P35.3 Ce changement du modèle de marquage est probablement dû au fait que les cellules des disques oculaires dcp-1Prev drICEΔ1 à double mutant GMR-hid ne meurent pas (Figure 1f) et maintiennent ainsi l’épitope détecté par l’anticorps clivé-Caspase-3. Cependant, il est important de noter que cette analyse met en évidence la détection d’un épitope en l’absence de protéines de type Caspase-3 DCP-1 et DRICE par un anticorps clivé-Caspase-3.

L’immunoréactivité de l’anticorps clivé-Caspase-3 dépend des composants de l’apoptosome DRONC et ARK

Il existe deux possibilités pour lesquelles l’anticorps clivé-Caspase-3 marque les cellules mutantes doubles dcp-1 drICE, bien qu’elles ne soient pas apoptotiques. Premièrement, l’anticorps peut ne pas détecter d’épitope apoptotique ; ou deuxièmement, l’anticorps peut détecter un épitope apoptotique généré en amont ou en parallèle du DCP-1 et du DRICE. Pour distinguer ces possibilités, nous avons examiné les disques oculaires GMR-hid mutants pour les composants de l’apoptosome DRONC et ARK, qui agissent en amont de DRICE et DCP-1. Dans les disques oculaires GMR-hid mutants dronc et ark, les étiquettes des anticorps TUNEL et clivés-Caspase-3 sont bloquées (Figure 1 g, h; Figure 3a, b). Ces données confirment que l’anticorps clivé-Caspase-3 détecte bien un épitope apoptotique chez la Drosophile. De plus, comme il ne détecte pas l’épitope apoptotique chez les mutants dronc et ark, mais pas chez les mutants doubles dcp-1 drICE, il est plus précis de considérer l’anticorps clivé-Caspase-3 comme un marqueur de l’activité DRONC, plutôt que de l’activité caspase effectrice, dans les cellules de Drosophiles mourantes.

L’ETD tripeptidique est l’épitope apoptotique détecté par l’anticorps clivé-Caspase-3

L’épitope détecté par l’anticorps clivé-Caspase-3 dépend de l’activité du DRONC. Il est possible que l’anticorps reconnaisse directement le DRONC activé. Alternativement, il est également possible que l’anticorps clivé-Caspase-3 détecte un épitope généré par le clivage d’un substrat inconnu par le DRONC actif, indépendamment du DRICE et du DCP-1.

Pour distinguer ces deux possibilités, nous avons aligné les résidus de la cystéine catalytique (Cys163) sur le site de clivage à Asp175 de la Caspase-3 humaine (peptide Caspase-3) avec les régions correspondantes des caspases de la Drosophile (Figure 2a ; voir aussi réf. 3). Les résidus les plus C-terminaux du peptide de la Caspase-3, ETD, sont conservés dans DRICE et DCP-1 (Figure 2a). Semblable à la Caspase-3, c’est le site de clivage pour l’activation d’au moins DRICE, 29 et éventuellement de DCP-1. Il est intéressant de noter que le peptide N-terminal, deux tiers du peptide Caspase-3, présente la plus grande similitude avec le DRONC ; six résidus sur neuf sont conservés (Figure 2a). Cette partie du peptide Caspase-3 est moins bien conservée dans DRICE, DCP-1 et les caspases de Drosophile restantes. Bien que le clivage entre les grandes et les petites sous-unités de DRONC ne soit pas nécessaire à son activité, 30,31 et ne puisse pas se produire in vivo, nous avons considéré la possibilité que des anticorps dirigés contre la partie N-terminale du peptide Caspase-3 puissent détecter directement le DRONC actif dans les cellules mourantes.

Nous avons utilisé des peptides bloquants pour évaluer quels épitopes du peptide Caspase-3 sont détectés par l’anticorps clivé-Caspase-3 dans les cellules de Drosophiles mourantes. Les séquences des peptides bloquants sont représentées sur la Figure 2b et soulignées sur la figure 2a. Le peptide bloquant A (TETD) est dérivé du DRICE et du DCP-1 et le peptide bloquant B (CRGDEYDLG) correspond à la région de similitude la plus élevée dans le DRONC (Figure 2a, b). Le peptide C est un peptide témoin correspondent aux résidus immédiatement adjacents au peptide B dans le DRONC (Figure 2a, b). Le peptide D est un autre peptide témoin, qui est très similaire au peptide A et est dérivé du prodomaine de DRONC en position 113. Si la prodomaine de DRONC est clivée à ce site, elle exposera l’ESD à son extrémité C, qui est très similaire à l’extrémité C du peptide Caspase-3 (ETD, peptide A) et peut donc être détectée par l’anticorps clivé-Caspase-3.

Les peptides bloquants ont été mélangés à l’anticorps clivé-Caspase-3 60 min avant incubation avec les disques imaginaux oculaires. Les résultats des expériences de blocage sont résumés à la Figure 2b, et pour les peptides A et B représentés à la figure 2c-f. Le peptide A est suffisant pour bloquer toute l’immunoréactivité de l’anticorps clivé-Caspase-3 dans les disques oculaires GMR-hid et dcp-1 drICE à double mutant GMR-hid (Figure 2c, d). En revanche, le peptide B n’abroge pas l’immunoréactivité de l’anticorps dans ces disques (Figure 2e, f). Les peptides témoins C et D ne parviennent pas non plus à bloquer l’immunoréactivité de la Caspase-3 clivée (Figure 2b ; données non représentées).

Ces données démontrent que l’anticorps clivé-Caspase-3 détecte spécifiquement l’épitope ETD dans les cellules apoptotiques. Parmi les caspases de Drosophiles, cet épitope n’est présent que dans DRICE et DCP-1, ce qui rend très probable que l’anticorps détecte bien ces caspases effectrices. En revanche, le fait que les peptides dérivés du DRONC B, C et D ne bloquent pas l’immunoréactivité suggère qu’il est peu probable que l’anticorps détecte directement le DRONC actif. Par conséquent, comme l’anticorps clivé-Caspase-3 ne perd pas d’immunoréactivité chez les mutants doubles dcp-1 drICE (Figure 1e), il détecte au moins une autre protéine, ce qui expose l’épitope ETD de manière DRONC-dépendante.

L’activation de la DCP-1 indépendamment de l’ARK restaure l’immunoréactivité de la Caspase-3 clivée

L’analyse présentée à la figure 2 suggère, mais ne prouve pas, que l’anticorps de la Caspase-3 clivée détecte bien la DCP-1 et le DRICE clivés. Pour tester directement cette possibilité, nous avons exprimé un transgène GMR-ΔN-dcp-1 en arrière-plan mutant ark. ΔN-dcp-1 n’a pas le prodomain N-terminal de DCP-1. On pense que ΔN-DCP-1 appauvri en prodomaine favorise facilement l’autotraitement, et une expression cohérente sous contrôle GMR induit un phénotype d’ablation oculaire.32 Ce phénotype d’ablation oculaire est causé par l’induction de l’apoptose (Figure 3c, d). Comme mentionné ci-dessus, les clones mutants d’ark en arrière-plan GMR-hid ne parviennent pas à induire une apoptose TUNEL-positive (Figure 3b) et l’anticorps clivé-Caspase-3 n’a aucune immunoréactivité chez les clones d’ark (Figure 3a), ce qui suggère que ni DCP-1, ni DRICE, ni les substrats inconnus de DRONC ne sont clivés chez les clones mutants d’ark. Par conséquent, nous avons testé si l’expression de ΔN-Dcp-1 en l’absence d’activité des apoptosomes, c’est-à-dire dans les clones ark, peut restaurer le marquage des anticorps clivés-Caspase-3. Par rapport aux tissus de type sauvage (marqués par la GFP sur la Figure 3c, c’), le nombre de cellules positives à la Caspase-3 clivée est fortement réduit chez les clones mutants ark (Figure 3c, c’) suggérant que l’activation de ΔN-DCP-1 dépend au moins partiellement de l’apoptosome. Cependant, environ 50% des clones mutants ark (n = 32) en arrière-plan GMR-ΔN-Dcp-1 contiennent des cellules immunoréactives clivées-Caspase-3 (flèches de la figure 3c, c’). Il est peu probable qu’il s’agisse d’un artefact de marquage, car ces cellules sont également positives au TUNEL (Figure 3d, d ‘). Par conséquent, étant donné que DRONC est inactif en arrière-plan mutant ark suggérant que le signal de marquage de la Caspase-3 clivée n’est pas causé par le substrat DRONC inconnu, cette analyse démontre que l’anticorps de la Caspase-3 clivée détecte bien la DCP-1 clivée. Il est également possible que l’anticorps clivé-Caspase-3 détecte le DRICE clivé dans cette expérience, car le DCP-1 peut traiter protéolytiquement le DRICE, au moins in vitro.29, 32 Une analyse similaire avec DRICE n’a pas pu être réalisée car GMR-drICE et GMR-ΔN-drICE ne provoquent pas de phénotype d’ablation oculaire.32 Néanmoins, que le DCP-1 clive le DRICE in vivo ou non, compte tenu de la similitude de séquence du DCP-1 et du DRICE à l’extrémité C de la grande sous-unité et des données de blocage peptidique de la figure 2, cela suggère que l’anticorps peut également détecter le DRICE clivé.