L’anaérobe industriel Clostridium acetobutylicum utilise des polykétides pour réguler la différenciation cellulaire

Souches et milieux bactériens

C. acetobutylicum ATCC 824 a été cultivé dans une chambre anaérobie (Produits de laboratoire Coy) contenant une atmosphère de 97% d’azote et 3% d’hydrogène. Le milieu 2xytg67 contenait 16 g/L de tryptone, 10 g/L d’extrait de levure, 5 g/L de NaCl et 10 g/L de glucose (sauf indication contraire) avec un pH ajusté à 5.2 pour les milieux liquides et 5,8 pour les milieux solides (contenant également 15 g/L de gélose). Le milieu de croissance clostridial (CGM) 68 contenait 30 g/L de glucose (sauf indication contraire), 6,25 g/L d’extrait de levure, 2,5 g/L de sulfate d’ammonium, 1,25 g/L de NaCl, 2,5 g/L d’asparagine, 0,95 g/L de phosphate de potassium monobasique, 0,95 g/L de phosphate de potassium dibasique, 0,5 g/L de sulfate de magnésium heptahydraté, 13 mg/L de sulfate de manganèse heptahydraté et 13 mg/L de fer sulfate heptahydraté avec un pH ajusté à 6,4. Le milieu p269 contenait 80 g/L de glucose (sauf indication contraire), 1 g/L d’extrait de levure, 2,2 g/L d’acétate d’ammonium, 0.5 g / L de phosphate de potassium monobasique, 0,5 g / L de sulfate de potassium dibasique, 0,2 g / L de sulfate de magnésium heptahydraté, 1 mg / L d’acide para-aminobenzoïque, 1 mg / L de chlorhydrate de thiamine, 10 µg / L de biotine, 10 mg / L de sulfate de manganèse heptahydraté, 10 mg / L de sulfate ferreux heptahydraté et 10 mg /L de NaCl avec un pH ajusté à 6,4. Le milieu de base clostridial (CBM) 70 contenait 10 g /L de glucose, 0,5 g/L de phosphate de potassium monobasique, 0,5 g/L de phosphate de potassium dibasique, 4 g/L de tryptone, 0.2 g/L de sulfate de magnésium heptahydraté, 10 mg/L de sulfate de manganèse heptahydraté, 10 mg/L de sulfate ferreux heptahydraté, 1 mg/L d’acide para-aminobenzoïque, 1 mg/L de chlorhydrate de thiamine et 2 µg/L de biotine avec un pH ajusté à 6,9. Pour les plaques CGM solides, on a ajouté 15 g/L de gélose. Le CBM-S (utilisé pour les dosages de sporulation liquide) était identique au CBM sauf que 50 g/L de glucose ont été utilisés et que 5 g/L de CaCO3 ont été ajoutés juste avant l’inoculation des cultures. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) a été cultivé en milieu Luria-Bertani (LB) à 37 °C. Pour les souches de Clostridium appropriées, les milieux de culture ont été complétés par de l’érythromycine (Ery ; 40 µg/mL pour les milieux solides, 80 µg/mL pour les milieux liquides) et / ou du thiamphénicol (Th; 5 µg/mL pour les milieux solides et liquides). La kanamycine (Kan; 60 µg/mL) ou le chloramphénicol (Cm; 25 µg/mL) ont été ajoutés aux milieux de culture d’E. coli comme indiqué. Les souches de Clostridium et d’E. coli ont été maintenues sous forme de stocks de glycérol à 20% v/v stockés à -80 °C.

Construction plasmidique

Oligonucléotides ont été fournis par des technologies d’ADN intégrées (Tableau supplémentaire 5). La polymérase de phusion (NEB) a été utilisée pour toutes les réactions de PCR. Pour isoler l’ADN génomique de C. acetobutylicum ATCC 824, une méthode de lyse alcaline a été utilisée71. C. acetobutylicum a été cultivé pendant une nuit en milieu 2xYTG à phase stationnaire (OD600 > 2,0), puis 10 mL de culture ont été centrifugés à 3500×g pendant 15 min (température ambiante). Le surnageant a été mis au rebut et la pastille cellulaire a été remise en suspension dans un tampon de 5 mL (NaCl 75 mm, EDTA 25 mM pH 8,0, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5). Le lysozyme a été ajouté à une concentration finale de 2 mg / mL et la solution a été doucement mélangée. Le mélange a été incubé à 37 °C pendant 60 min avec un mélange doux effectué toutes les 15 min. Après la période d’incubation, 660 µL de tampon de lyse (NaOH 1 M, 10% p/v SDS) ont été ajoutés et la solution a été soigneusement mélangée. La protéinase K a été ajoutée à une concentration finale de 0,5 mg / mL et la solution a été incubée à 55 ° C pendant 1 h. Après cette période d’incubation, un volume égal de phénol: chloroforme (1: 1) a été ajouté et la solution a été mélangée par inversion pendant 5 min. La solution a ensuite été centrifugée à 3500×g pendant 15 min (température ambiante), et la phase aqueuse supérieure a été éliminée par pipetage. A la phase organique, on ajoute de l’acétate de sodium 3 M (10% v/v en solution finale). Pour précipiter l’ADN génomique, on ajoute 2 volumes d’éthanol et on mélange la solution. L’ADN génomique précipité a été collecté à l’aide d’un crochet en verre et lavé avec de l’éthanol à 70%. L’ADN lavé est ensuite séché sur azote gazeux pendant 15 min, remis en suspension dans du tampon à faible TE (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mm, pH 8,0) et dissous par incubation à 50 °C.

Pour construire le plasmide pKO_mazF_mod (qui servira plus tard de modèle pour pKO_pks), les amorces pKON_Fo et pKON_Ro ont été utilisées pour amplifier par PCR une région de 5,0 kb à partir du modèle pko_mazf15. Cette étape était nécessaire pour supprimer une région de 677 pb du backbone pKO_mazF, que nous n’avons pas pu amplifier via PCR. Le produit PCR de 5,0 kb a été purifié sur gel, digéré aux extrémités 5′ et 3′ à l’aide de PshAI, ligaturé pour former pKO_mazF_mod et transformé en E. coli TOP10. Les clones transformants ont été criblés par digestion par test plasmidique purifié, et le séquençage de Sanger a été utilisé pour confirmer la séquence du clone final de pKO_mazF_mod. Pour construire le plasmide pKO_pks (pour la délétion du gène pks de C. acetobutylicum), une région de 3,8 kb contenant colE1, repL, bgaR et mazF a été amplifiée par PCR à partir de pKO_mazF_mod en utilisant des amorces pKO_F et pKO_R. De plus, les amorces UHR_Fo et UHR_Ro, et DHR_Fo et DHR_Ro ont été utilisées pour amplifier par PCR des régions de 1 kb représentant les régions homologues en amont et en aval (UHR et DHR). flanquant le gène pks (CA_C3355) d’un C. modèle d’ADN génomique ATCC 824 d’acetobutylicum. Le gène de résistance au chloramphénicol/thiamphénicol et le promoteur constitutif (P ptb de C. acetobutylicum) ont été amplifiés par PCR à partir de pKO_mazF_mod en utilisant des amorces CMR_F et CMR_R (région de 1,1 kb). Ces quatre produits de PCR ont été ligaturés par assemblage Gibson et transformés en E. coli TOP10. Les clones transformants ont été criblés par digestion par test plasmidique purifié, et le séquençage de Sanger a été utilisé pour confirmer la séquence du clone pKO_pks final. Pour la construction du plasmide pAN315 (nécessaire à la méthylation des pKO_pks et des pCKO_pks avant la transformation en C. acetobutylicum), une région de 6,4 kb du plasmide pAN172 a été amplifiée à l’aide des amorces pAN1_F et pAN1_R, et une région de 1,0 kb contenant le gène de résistance à la kanamycine du vecteur pCOLA_Duet a été amplifiée à l’aide des amorces KAN_Fo et KAN_Ro. Les produits de PCR extraits en gel ont été ligaturés via un assemblage Gibson et transformés en E. coli TOP10. Les clones transformants ont été criblés par digestion par test plasmidique purifié, et le séquençage de Sanger a été utilisé pour confirmer la séquence du clone pAN3 final. Pour construire le plasmide pCKO_pks (pour l’expression du gène pks sous le promoteur constitutif de la crotonase à partir de C. acetobutylicum), des amorces CPKS_Fo et CPKS_Ro ont été utilisées pour amplifier par PCR le gène pks ATCC 824 de C. acetobutylicum de 5,4 kb (CA_C3355) avec des porte-à-faux appropriés pour l’assemblage Gibson. Le backbone pWIS_empty vector71 (contenant le promoteur crt constitutif en amont du site de clonage multiple) a été amplifié par PCR à l’aide d’amorces pWIS_F et pWIS_R donnant un produit de 5,0 kb. Les deux produits PCR purifiés par gel ont été ligaturés via un assemblage Gibson et transformés en E. coli TOP10. Les clones transformants ont été criblés par digestion par test plasmidique purifié, et le séquençage de Sanger a été utilisé pour confirmer la séquence du clone final de pCKO_pks.

Pour construire le plasmide pET24b_pks, le gène pks ATCC 824 de C. acetobutylicum de 5,4 kb (CA_C3355) a été amplifié à partir de l’ADN génomique de C. acetobutylicum à l’aide des amorces PKS_Fo et PKS_Ro. Le vecteur pET24b doublement digéré (digéré EcoRI/ XhoI) a été ligaturé avec un produit PCR pks doublement digéré (digéré EcoRI / XhoI), et le produit de ligature a été transformé en E. coli TOP10. Les clones transformants ont été criblés par digestion par test plasmidique purifié, et le séquençage de Sanger a été utilisé pour confirmer la séquence du clone final de pET24b_pks.

Électro-transformation de C. acetobutylicum

Avant la transformation en C. acetobutylicum, le vecteur pKO_pks a été co-transformé avec pAN3 en E. coli TOP10 par électroporation. Cette procédure a permis la méthylation des pKO_pks nécessaires pour surmonter le système natif de restriction-modification actif chez C. acetobutylicum 72. Purification plasmidique de E. une culture liquide de coli pKO_pks/pAN3 a été réalisée, et le mélange plasmidique résultant a été utilisé pour des électroporations de C. acetobutylicum en utilisant la méthode précédemment publiée72 que nous détaillons ici. Pour préparer des cellules électrocompétentes, une seule colonie de C. acetobutylicum provenant d’une plaque de 2xYTG (âgée de plus d’une semaine) a été choquée par la chaleur à 80 °C pendant 10 min et utilisée pour inoculer 10 mL de MCG. Après une nuit d’incubation à 37 °C et avoir atteint la phase mi-exponentielle (OD600 0,4–0,9), une culture de 6 mL a été utilisée pour inoculer 54 mL de 2xYTG frais. Cette sous-culture a été incubée à 37 °C jusqu’à atteindre OD6001.2 (~5 h), point auquel la sous-culture a été centrifugée à 3500×g pendant 20 min (4 °C). Après élimination du surnageant, la pastille cellulaire est remise en suspension dans 20 mL de tampon d’électroporation glacé (EPB; saccharose 270 mM, NaH2PO4 5 mM, pH 7,4). Les cellules remises en suspension ont été centrifugées à 3500×g pendant 10 min (4 °C), le surnageant a été jeté et la pastille de cellules a été remise en suspension dans 20 mL d’EPB glacé. Après une granulation finale par centrifugation à 3500×g pendant 10 min (4 °C), le surnageant a été jeté et le culot a été remis en suspension dans 2,3 mL d’EPB glacé. Cette remise en suspension finale a été utilisée comme stock de cellules électrocompétentes. Des électro-transformations ont été réalisées en mélangeant d’abord (sur glace) 500 µL de cellules compétentes et ~20 µL de solution d’ADN plasmidique (1-5 µg au total) à transformer. Le mélange est transféré dans une cuvette d’électroporation de 0,4 cm et laissé incuber sur glace pendant 15 min. Les électroporations ont été effectuées avec les paramètres suivants: tension, 2000 V; capacité, 25 µF; résistance, Ω infini. Après électroporation, les échantillons ont été remis en suspension dans 1 mL de 2xYTG et transférés dans un tube contenant 9 mL de 2xYTG. Après mélange par inversion, on a laissé les cultures récupérer à 37 °C pendant 4 h. Les cultures de récupération ont été centrifugées à 3500×g pendant 15 min (température ambiante), et le surnageant a été jeté. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans 500 µL de 2xYTG et 100 µL ont été plaqués sur des plaques solides de 2xYTG complétées par l’antibiotique approprié. La plaque a été incubée à 37 ° C pendant 2-3 jours et les colonies transformantes ont été soumises à une vérification par PCR.

Délétion du gène pks et complémentation génétique

KO ciblé du gène pks (ca_c3355) en C. l’acétobutylicum ATCC 824 a été obtenu en utilisant la méthode précédemment publiée15. En détail, 5 µg de mélange plasmidique pKO_pks/pAN3 méthylé ont été transformés en C. acetobutylicum selon la méthode décrite ci-dessus. Après récupération en milieu liquide 2xYTG pendant 4 h, les pastilles cellulaires ont été collectées par centrifugation (3500×g, 15 min, température ambiante), remises en suspension dans 0,5 mL de liquide frais 2xYTG, et 100 µL de la culture cellulaire remise en suspension ont été plaqués sur des plaques solides 2XYTG + 5 µg/mL Th + 40 mm de β-lactose. Dans ces conditions de placage, seules les cellules ayant subi l’événement de recombinaison homologue à double croisement souhaité sont censées survivre. La contre-sélection du squelette vectoriel est assurée par le promoteur inductible au lactose (P bmaL), qui pilote le gène de toxine mazF sur le squelette vectoriel pKO_pks. Après ce procédé de placage, environ 10 colonies ont été observées sur les plaques Β-lactose 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 mM. De ces 10 colonies, quatre ont été restreintes deux fois et soumises à une vérification PCR des colonies. Quatre séries d’amorces ont servi de base à la vérification par PCR des colonies, comme détaillé dans la Fig. 2.

Pour générer la souche de complémentation génétique pks, l’électroporation de ∆pks C. acetobutylicum avec un mélange plasmidique pCKO_pks/pAN3 a été réalisée comme décrit ci-dessus. Après électroporation et récupération, les cultures ont été plaquées sur un milieu solide 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL Ery. Après deux réticulations sur des milieux solides 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL Ery, les colonies potentielles hébergeant des pCKO_pks ont été criblées par PCR des colonies à l’aide des amorces pCKO_F et pCKO_R.

Analyse métabolomique LC-HRMS

Pour des comparaisons métabolomiques non ciblées de C. acetobutylicum de type sauvage et dekspks, des colonies individuelles de chaque souche ont été choquées par la chaleur à 80 ° C pendant 10 min et utilisées pour inoculer 10 mL de CGM liquide (30 g/L de glucose). Après une incubation d’une nuit (stagnante) jusqu’à atteindre OD600 ~ 1,0, ces cultures ont été utilisées pour inoculer 10 mL de CGM liquide (80 g / L de glucose) avec un inoculum à 10% pour la repiquage. Après ~ 5 h (OD600 ~ 1.0) de croissance stagnante, les sous-cultures ont été utilisées pour inoculer des fermentations en flacon quadruple (70 mL de MCG, 80 g/L de glucose + 5 µL d’Antimousse 204, 3% d’inoculum) agitées via des barres d’agitation magnétiques. Du carbonate de calcium (6 g/L) a été ajouté au milieu de fermentation pour tamponner le pH. Toute la culture a été réalisée à 37 °C. Environ 5 µg/mL de Th ont été inclus dans toutes les cultures dekspks à l’exception de la culture de fermentation finale, car certains antibiotiques sont connus pour perturber les phases de fermentation ABE. Des échantillons de bouillon de fermentation (1 mL) de chaque réplication ont été prélevés pendant la phase stationnaire précoce et extraits avec 3 mL de méthanol chloroforme 2:1. Les mélanges ont été vortexés, séparés par centrifugation (2700×g, 10 min) et la couche inférieure riche en chloroforme a été transférée dans un flacon en verre. Ces extraits organiques ont été séchés à l’azote gazeux, remis en suspension dans 100 µL de méthanol et 10 µL ont été injectés sur un instrument LC-MS QTOF de masse précise Agilent Technologies 6520 équipé d’une colonne Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Un gradient linéaire de 2 à 98% de CH3CN (vol/vol) en 40 min dans H2O avec 0,1% d’acide formique (vol/vol) à un débit de 0,5 mL/min a été utilisé. La plateforme d’analyse métabolomique XCMS16 (Scripps Research Institute) a été utilisée pour comparer les métabolomes de souches sauvages et de souches de pks ∆ sur la base des données quadruplées du LC-HRMS. Pics MS uniques à ∆pks (Fig. 1a) ont été identifiés en utilisant les paramètres suivants : valeur p < 0,01, changement de pli > 10,0, intensité maximale > 5000.

Fermentations de bioréacteurs

Pour comparer les profils de fermentation ABE de type sauvage et ∆pks C. des fermentations à l’acétobutylicum, bioréacteurs ont été réalisées dans des Bioréacteurs DASGIP (4 × GPI 100 Cuves, système Biobloc DASGIP) avec des volumes de travail de 500 mL. Des cultures nocturnes (10 mL de MCG, 30 g/L de glucose, stagnantes, 34 ° C) inoculées avec des colonies individuelles de C. acetobutylicum choquées par la chaleur ont été cultivées jusqu’à atteindre OD600 ~ 1. Un inoculum à 10% a ensuite été utilisé pour démarrer une sous-culture (30 mL de milieu P2, 80 g / L de glucose, stagnant, 34 ° C), et la sous-culture a été incubée jusqu’à atteindre OD600 ~ 1. Les sous-cultures de 30 mL ont ensuite été transférées de manière aseptique dans des Bioréacteurs individuels DASGIP préchargés avec 500 mL de milieu P2 (80 g/L de glucose, 100 µL d’Antimousse 204, 34 °C). Les fermentations ont été autorisées pendant 54 h avec échantillonnage périodique pour les mesures de densité optique, l’analyse des produits de fermentation et la quantification des composés 1, 2 et 3. La température a été maintenue à 34 °C tout au long de la fermentation, l’agitation a été assurée par agitation à 200 tr/min, et le pH a été maintenu au-dessus de 5,0 par addition automatique de 3 M de NH4OH. Pour maintenir des conditions anaérobies, de l’azote gazeux exempt d’oxygène a été pulvérisé à une vitesse de 2 sL/h pendant toute la durée de la fermentation. Pour la quantification des composés 1, 2 et 3, 1 mL de bouillon de fermentation a été mélangé à 3 mL d’acétate d’éthyle, vortexé, séparé par centrifugation (2700×g, 10 min, température ambiante) et la couche organique supérieure isolée. La couche organique a été séchée par évaporation rotative, remise en suspension dans 200 µL de méthanol et 20 µL ont été injectés sur un instrument LC-MS Quadripolaire Agilent Technologies 6120 (avec DAD) équipé d’une colonne Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Un gradient linéaire de 2 à 98% de CH3CN (vol/vol) en 40 min dans H2O avec 0,1% d’acide formique (vol/vol) à un débit de 0,5 mL/min a été utilisé. Les composés 1, 2 et 3 ont été identifiés par absorption UV (240 nm) comme le montre la Fig. 1b, et ont été quantifiées par la zone de crête intégrée (absorbance à 240 nm).

Procédures analytiques de fermentation

Un spectrophotomètre a été utilisé pour déterminer les densités cellulaires en mesurant la densité optique à 600 nm (OD600). Un système Shimadzu Proéminence UFLC équipé d’une colonne Biorad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm) a été utilisé pour analyser C. bouillon de fermentation à l’acétobutylicum pour la concentration de glucose et de produits de fermentation (acétate, butyrate, lactate, acétone, butanol et éthanol). Des échantillons de bouillon de fermentation (1 mL) ont d’abord été granulés par centrifugation à 10 000×g pendant 3 min, puis filtrés du surnageant à l’aide d’un filtre seringue PVDF de 0,22 micron. Des échantillons de surnageant filtré (20 µL) ont été injectés sur le système UFLC avec une phase mobile d’acide sulfurique 0,01 N s’écoulant à 0,7 mL/min, température de la colonne de 35 °C, et ont été chromatographiés pendant 35 min. Les analytes ont été détectés à l’aide d’un détecteur d’indice de réfraction (utilisé pour quantifier les concentrations de glucose, d’acétate, de lactate, de butanol et d’éthanol) et d’un détecteur à diodes (utilisé pour quantifier les concentrations de butyrate (208 nm) et d’acétone (265 nm)).

Isolement de l’ARN et analyse de l’ARN-Seq

Des échantillons (10 mL) de bouillon de fermentation ont été prélevés en triplicat biologique à partir de fermentations bioréacteurs de C. acetobutylicum de type sauvage et ∆pks 26 h après l’inoculation. Les échantillons ont été centrifugés (4000×g, 10 min, 4 °C) et les pastilles ont été remises en suspension et stockées dans un Réactif cellulaire RNAprotect (Qiagen). L’ARN total a été extrait à l’aide d’un Mini Kit Rneasy (Qiagen) selon les instructions du fabricant. Un traitement à la DNase sur colonne a été effectué à l’aide de la DNase I (sans RNase) (NEB). Le contrôle de la qualité de l’ARN, la construction de la bibliothèque et le séquençage de la bibliothèque ont été effectués par le Laboratoire de génomique fonctionnelle QB3 de l’Université de Californie-Berkeley et le Laboratoire de séquençage génomique Vincent J. Coates. La qualité et la concentration de l’ARN ont été évaluées à l’aide d’une nanochip sur un bioanalyseur Agilent 2100. Les ARNR bactériens 16S et 23S ont été éliminés à l’aide d’un kit RiboZero (Illumina). L’ARN messager résultant (ARNm) a été converti en une bibliothèque d’ARN-Seq à l’aide d’un kit de construction de bibliothèque d’ARNm-Seq (Illumina). Le séquençage de la bibliothèque d’ARN a été effectué sur un Illumina HiSeq4000 avec des lectures à une extrémité de 50 pb. Des lectures de séquençage (50 pb) ont été traitées et mappées au génome de C. acetobutylicum ATCC 824 (accession NCBI NC_003030.1 et NC_001988.2) à l’aide de l’atelier de génomique CLC 9.0 avec des paramètres par défaut. Les lectures qui ne s’alignaient pas uniquement sur le génome ont été rejetées. Les différences d’expression génique entre C. acetobutylicum de type sauvage et ∆pks ont été calculées à l’aide du même logiciel. Les gènes ont été considérés comme exprimés différentiellement avec une valeur de p < 0,003 (basée sur un test t non apparié, n = 3) et | un changement de pli normalisé | > 2,0. Des corrections de taux de fausses découvertes aux valeurs p ont été calculées dans l’atelier de génomique CLC 9.0 à l’aide d’une méthode publiée73. Les résultats de l’analyse ARN-Seq sont présentés dans les Données supplémentaires 1. Une analyse de ficelle30 a été effectuée pour déterminer les interactions protéine–protéine putatives entre les gènes exprimés différentiellement révélés par l’analyse ARN-Seq.

Essais de comparaison des phénotypes

Des essais de sporulation liquide ont été réalisés avec des modifications mineures 74. Des échantillons ont été prélevés sur des cultures biologiques liquides triplicatées après 5 jours d’incubation (30 mL de CBM-S, 37 °C). Les échantillons de 20 µL ont été soumis à un choc thermique (80 °C, 10 min), des dilutions (101-106) ont été repérées sur des plaques de 2xYTG et des colonies ont été dénombrées après 30 h d’incubation (37 °C) pour calculer le nombre d’unités formant colonie résistantes à la chaleur (ufc/mL). Pour la complémentation chimique dekspks dans le dosage de sporulation liquide, du clostriénose purifié (concentration finale 3,5 µM) a été complété dans des cultures CBM-S de Cpks C. acetobutylicum au moment de l’inoculation. Comme le composé 3 a été ajouté sous forme de solution concentrée dans le méthanol, le volume équivalent de méthanol (60 µL) a été ajouté à toutes les autres cultures de dosage de sporulation liquide (pks sauvages et non complétés) pour contrôler cet effet.

Pour les dosages de sporulation solide, une méthode décrite antérieure75 a été utilisée avec quelques modifications. En détail, des colonies individuelles sous choc thermique (80 ° C, 10 min) ont été cultivées en milieu liquide (10 mL de MCG, 37 ° C) pendant 24 h. Les cultures ont été diluées par un facteur 106 et plaquées sur du MCG solide. L’échantillonnage a été effectué 1, 2, 3, 4 et 6 jours après le placage initial. Pour l’échantillonnage, trois colonies individuelles ont été combinées et complètement remises en suspension dans 60 µL de MCG liquide. 20 µL du mélange de colonies remis en suspension ont ensuite été soumis à un choc thermique (80 °C, 10 min), des dilutions (101-106) ont été repérées sur des plaques de 2xYTG, et les colonies ont été dénombrées après 30 h d’incubation (37 °C) pour calculer le nombre d’unités formant colonie résistantes à la chaleur (ufc/colonie). Tous les échantillons ont été réalisés sous forme de triplés biologiques.

Des dosages d’accumulation de granulose ont été effectués par coloration à l’iode53. Des cultures liquides en phase moyenne log (OD600 ~ 0,6) (P2, 37 ° C) ont été plaquées sur milieu solide 2xYTG avec des taux de glucose élevés (50 g /L) pour permettre la production de granulose. Les plaques ont été incubées à 30 °C pendant 4 jours, puis elles ont été colorées par exposition à un lit de cristaux d’iode pendant 10 min. On a ensuite laissé les plaques se dessécher pendant 10 min avant l’imagerie. Pour la complémentation chimique de ∆pks dans le test d’accumulation de granulose, du clostriénose purifié (concentration finale en plaques de 4,0 µM) a été incorporé dans des plaques solides de 2xYTG avant le placage de la culture de ∆pks. Comme le clostriénose a été ajouté aux plaques de 2xYTG sous forme de solution concentrée dans le méthanol (mélangé dans le milieu fondu avant la solidification), le volume équivalent de méthanol (6 µL) a été ajouté à toutes les autres plaques de 2xYTG utilisées dans les essais d’accumulation de granulose pour contrôler cet effet.

Des colonies individuelles de C. acetobutylicum cultivées sur des plaques CBM pendant 48 h (37 °C) ont été vues et imagées à l’aide d’un microscope à dissection Leica MZ16 F équipé d’une caméra Leica DFC300 FX.

Des essais d’épandage d’huile ont été effectués comme précédemment décrit76,77, 78. En détail, un bécher en verre de 400 mL (diamètre intérieur de 7,5 cm) a été rempli de 300 mL d’eau, et une gouttelette de 10 µL d’huile de lampe à paraffine a été ajoutée et laissée se répandre en un film mince à la surface de l’eau pendant une période de 5 min (~ 25 mm de diamètre). Des solutions de surfactine, de clostriénose purifiée et d’un tampon de phosphate de potassium témoin ont été préparées au pH et à la concentration indiqués (préparées dans un tampon de phosphate de potassium de 10 mM). Environ 10 µL d’échantillon ont été soigneusement ajoutés au centre du film d’huile et l’effet sur le film d’huile a été observé. On s’attend à ce que les échantillons ayant une activité tensioactive forment des zones de compensation circulaires stables dans le film d’huile, avec une activité tensioactive plus puissante correspondant à des zones de compensation plus grandes (ou une dispersion complète du film d’huile pour une activité tensioactive très élevée). Des tests d’effondrement de gouttes ont été effectués77,79, 80. Des micro-puits circulaires (diamètre intérieur de 8 mm) dans le couvercle en polystyrène d’une plaque de 96 micro-puits (12,7 × 8,5 cm) ont été recouverts d’une fine couche d’huile de lampe à paraffine en ajoutant 2,0 µL d’huile de lampe à paraffine dans chaque puits et en laissant la gouttelette se répartir uniformément sur le micro-puits pendant une période de 1 h. Des échantillons de surfactine, de clostriénose purifiée et de phosphate de potassium témoin ont été préparés comme pour les essais d’épandage d’huile. Environ 5 µL d’échantillon ont été soigneusement ajoutés au centre du micro-puits. Après 5 min, la forme et le degré d’étalement de la gouttelette ont été observés. Alors que l’on s’attend à ce que les contrôles tampons forment des billes stables à la surface des micro-alvéoles, on s’attend à ce que les échantillons contenant du tensioactif s’effondrent et se répandent sur la surface des micro-alvéoles, avec une activité tensioactive plus puissante correspondant à un degré plus élevé de propagation des gouttelettes.

Purification et analyse in vitro de la protéine PKS

Pour purifier la protéine PKS marquée His6 pour une analyse in vitro, pET24b_pks a été transformé en E. coli BAP1. Une seule colonie a été inoculée dans 10 mL LB + 50 µg / mL de kanamycine (Kan) pour une croissance nocturne à 37 ° C. Environ 7 mL de culture nocturne ont été utilisés pour inoculer 700 mL LB + 50 µg / mL de Kan, et la culture a été agitée à 240 tr / min et 37 ° C jusqu’à atteindre OD600 de 0,5. Après glaçage de la culture pendant 10 min, l’isopropyl thio-β-d-galactoside (IPTG) a été ajouté à une concentration finale de 0.1 mM pour induire l’expression protéique, et la culture a été incubée à 16 ° C pendant 16 h. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5500×g, 4 °C, 20 min), remises en suspension dans 25 mL de tampon de lyse (HEPES 25 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M, imidazole 5 mM), et lysées par homogénéisation sur glace. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (17 700×g, 4 °C, 60 min) et de la résine d’agarose Ni-NTA a été ajoutée au surnageant (culture 2 mL/L). Le mélange a été nuté à 4 °C pendant 1 h, chargé sur une colonne à flux gravitaire, et la protéine PKS a été éluée avec des concentrations croissantes d’imidazole dans le Tampon A (HEPES 20 mM, pH 8,0, 1 mm DTT). La protéine PKS purifiée a été concentrée et le tampon échangé en Tampon A + 10% de glycérol à l’aide d’un concentrateur centrifuge Vivaspin. Des aliquotes de protéines PKS purifiées ont été aliquotées et surgelées dans de l’azote liquide. Le rendement protéique approximatif était de 5 mg/L (203 kDa).

Un essai de charge PKS avec substrat marqué au 14C contient, dans un volume total de 15 µL, 4 mm d’ATP, 2 mm de MgCl2, 1 mm de TCEP, 0.CoA de 5 mM, acide 2-14C-malonique (0,1 µCi), MatB de 10 µM, PKS de 17 µM et HEPES de 50 mM, pH 8,0. Après 2 h d’incubation à 25 °C, les échantillons ont été trempés en ajoutant un volume égal de tampon d’échantillon 1× SDS. Après analyse SDS-PAGE avec un gel TGX à 4-15% (Critère), le gel a été séché pendant 2 h à 50 °C et exposé sur un écran phosphoreux de stockage (20 × 25 cm; Dynamique moléculaire) pendant 5 jours. La protéine radiomarquée a été imagée sur un phosphorimager Typhoon 9400 (mode Phosphore de stockage, résolution de 50 µm; Amersham Biosciences).

Pour des dosages de produits in vitro (50 µL) de la protéine PKS, 8 µM de PKS ont été incubés avec du malonyl-CoA (2 mM) dans du tampon phosphate (100 mM, pH 7,0) à température ambiante pendant 2 h pour générer le composé 4, identifié par comparaison à un étalon chimique. Du NADPH (2 mM) a été ajouté au test pour générer les composés 5 et 6, qui ont tous deux été identifiés par comparaison avec des étalons chimiques. Après incubation, les mélanges de dosage ont été extraits deux fois avec 100 µL d’acétate d’éthyle à 99% / acide acétique à 1% (v/v). Les extraits organiques ont été séchés et remis en suspension dans 100 µL de méthanol, et 10 µL ont été injectés sur un instrument LC-MS Quadripolaire Agilent Technologies 6120 (avec DAD) équipé d’une colonne Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Un gradient linéaire de 2 à 98% de CH3CN (vol/vol) en 40 min dans H2O avec 0,1% d’acide formique (vol/vol) à un débit de 0,5 mL/min a été utilisé. L’analyse LC-HRMS des extraits de dosage a été réalisée sur un instrument LC-MS QTOF de masse précise Agilent Technologies 6520 équipé d’une colonne Agilent Eclipse Plus C18 (4.6 × 100 mm) en utilisant le même gradient de solvant et le même débit décrits ci-dessus.

Disponibilité des données

Les données RNA-seq générées dans cette étude ont été déposées dans ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) sous le numéro d’accession E-MTAB-6019. Toutes les autres données pertinentes sont disponibles auprès des auteurs sur demande.