L’activation de la protéase ClpP résulte de la réorganisation des réseaux d’interaction électrostatique au niveau des pores d’entrée

Mode de liaison d’ACP1 à EcClpP

Pour élucider la base structurelle de l’activation de ClpP par ACP128, les structures de NmClpP et EcClpP (Fig. 1a) en complexe avec des analogues ACP1 ont été recherchés. Bien qu’une structure de NmClpP avec ACP1 lié n’ait pas été obtenue malgré des tentatives répétées, une structure du complexe EcClpP+ ACP1-06 a été déterminée à une résolution de 1,9 Å (Fig. 1b, c, Tableau 1), contenant un tétradécamère dans l’unité asymétrique (Chaînes A-N). La densité électronique des résidus N-terminaux qui forment les boucles axiales d’EcClpP n’est pas claire dans toutes les sous-unités sauf une (chaîne B). Dans les structures précédemment publiées, ces boucles axiales sont très flexibles et sont généralement désordonnées dans le cristal en l’absence d’activateurs ou par préclusion par conditionnement cristallin23. Une densité électronique non ambiguë a été observée pour une seule molécule d’ACP1-06 dans une poche formée de sous-unités D et E, montrant deux configurations différentes du composé (Fig. 2 bis, b). Les deux configurations ont été modélisées dans la densité électronique, dans laquelle la première configuration positionne la partie trifluorométhylpyridine du composé dans une poche hydrophobe (configuration vers le bas), tandis que la seconde la positionne hors de la poche hydrophobe exposée au solvant (configuration vers le haut) (Fig. 2 bis). Les 13 poches hydrophobes restantes présentent une densité électronique ambiguë pour ACP1-06. Nous avons modélisé et raffiné les 14 molécules ACP1-06 dans des configurations ascendantes et descendantes à une occupation de 0,5, ce qui a permis d’améliorer la densité électronique de chaque ligand.

Les modes de liaison d’ACP1-06 (Fig. 2b-d) approchent celles des ADEPs observées dans les structures cristallines de différents CLPP bactériens (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Notez que les composés synthétisés par notre groupe sont numérotés comme ACP1-AA et ADEP-AA, tandis que les composés issus d’études d’autres groupes sont nommés comme dans les articles publiés respectifs. Tous les contacts protéiques avec ACP1-06 sont de nature apolaire, à l’exception de deux liaisons électrostatiques notables qui se produisent entre (1) la chaîne latérale hydroxyle phénolique de Y76 et l’oxygène amide d’ACP1-06, et (2) la chaîne latérale guanidinyle de R206 (l’avant-dernier Arg dans EcClpP) et un oxygène sulfonyle d’ACP1-06 (Fig. 2b). Ces deux dernières interactions sont présentes dans les deux configurations d’ACP1-06. De plus, R206 (Chaîne E) est stabilisé par liaison ionique avec E65 d’une sous-unité adjacente (Chaîne D) (Fig. 3 bis, b).

Dans la configuration descendante, le fragment trifluorométhylpyridine d’ACP1-06 occupe une cavité hydrophobe formée par L62, T93 et F96 (Chaîne D), et Y74, Y76, I104, L203 et L128 (Chaîne E) (Fig. 2b et 3b). Il s’agit de la même cavité occupée par le cycle du résidu Phe exocyclique des différents analogues ADEP cocristallisés avec ClpP, comme dans notre NmClpP+ADEP-0419 (Fig. 2e, f) ou les structures EcClpP+adep140 (fig. 2c, d). En revanche, dans la configuration up, le fragment trifluorométhylpyridine est mis en rotation autour de la liaison C-S et est exposé au solvant tout en établissant des contacts de van der Waals avec Y74, I104, F126 et L203 (Chaîne E) (Fig. 2b et 3b). Le fragment gem-diméthyle s’empile contre le cycle plat de Y74 (Chaîne E), tandis que la chaîne aliphatique étendue se terminant par un cycle phényle ortho-chloro-substitué, se trouve dans un sillon apolaire entre deux hélices de sous-unités adjacentes (Fig. 3b). Cette fente de liaison est formée par L62 (Chaîne D), F63 (Chaîne D), A66 (Chaîne D), L37 (Chaîne E), V42 (Chaîne E) et la partie apolaire de E40 (Chaîne E) (Fig. 2b et 3b).

Dans les structures liées à ACP1-06 et à ADEP1 d’EcClpP, on trouve le pont de sel intrasubunit entre R36 et E40, où la queue aliphatique voisine d’ADEP1 ou le cycle phényle chloro-substitué d’ACP1-06 forme une interaction hydrophobe avec la chaîne latérale d’E40 (Fig. 3b, c). Les deux activateurs sont en outre stabilisés dans le site hydrophobe par deux motifs de liaison hydrogène distincts. Alors que l’ACP1-06 est fixé par une interaction ionique exposée au solvant entre son groupe sulfonyle et le résidu R206 C-terminal (Fig. 3b), ADEP1 est maintenu en place par deux liaisons hydrogène avec le groupe hydroxyle de Y76 isolé à l’intérieur du site hydrophobe (Fig. 3c). Une liaison hydrogène médiée par un solvant entre E65 et le groupe carbonyle de la chaîne latérale N-acyle Phe d’ADEP1 renforce encore son interaction avec EcClpP (Fig. 3c). Cette liaison hydrogène supplémentaire, ainsi que la plus grande taille du cycle depsipeptidique cyclique, qui a une plus grande surface avec laquelle former des interactions de van der Waals par rapport au groupe trifluorométhylpyridine plus petit d’ACP1, peuvent expliquer la liaison généralement plus étroite observée pour les ADEPs qu’ACP1s28.

Dans la structure EcClpP+ ACP1-06, nous avons trouvé une densité électronique inexpliquée dans les 14 sous-unités s’étendant à partir du résidu nucléophile S111 de la triade catalytique, suggérant une modification covalente (Fig. supplémentaire. 1 bis, b). La densité s’étend approximativement à angle droit dans des directions opposées à l’écart des chaînes latérales S111. Malgré des efforts considérables, il n’a pas pu être équipé de manière convaincante de peptides, de produits à base d’acylcétone ou de diverses molécules inhibitrices de la sérine protéase connues.

Mode de liaison de l’ADEP à NmClpP

NmClpP a une pro-séquence plus courte à l’extrémité N, tout en ayant quatre résidus supplémentaires à l’extrémité C par rapport à EcClpP (Fig. 1 bis). Bien que NmClpP ait été exprimé comme une protéine pleine longueur portant une étiquette His6 N-terminale, nous avons observé à plusieurs reprises un manque de liaison à la résine d’acide Ni-nitrilotriacétique. Le séquençage N-terminal de la protéine purifiée a révélé que le NmClpP mature commence au résidu Y6 (Fig. 1a), indiquant une autoprotéolyse pour libérer sa pro-séquence N-terminale (1MSFDN5).

Auparavant, nous avions déterminé la structure de NmClpP avec ADEP-0419. Dans cette étude, nous avons déterminé la structure de l’apo-NmClpP à 2,0 Å et du NmClpP avec l’ADEP-14 lié à 2,7 Å (Fig. 1b, c, Fig. supplémentaire. 1c, Tableau 1). La structure de l’apo-NmClpP contient un tétradécamère dans l’unité asymétrique et ne montre aucune densité claire pour l’une des 14 boucles axiales N-terminales. Une faible densité électronique est observée pour les boucles formées par les résidus G133-G137 dans le brin β8 de la région du manche (Fig. 1 bis). L’unité asymétrique du cristal NmClpP+ADEP-14 contient deux tétradécamères (Fig. 1d). Aucune densité électronique n’a été observée pour les résidus 1 à 22 des 28 sous-unités en raison de l’emballage cristallin (Fig. 1c, Fig. supplémentaire. 1d). En outre, le brin β8 (résidus 130-137; Fig. 1a) n’est que partiellement visible dans toutes les sous-unités. L’ADEP-14 est lié au NmClpP dans une configuration similaire à celle de l’ADEP-04 (Fig. 2e, f et 3e, f). Brièvement, la fraction difluorophényle de l’ADEP-14 occupe une poche hydrophobe formée par Y67, L95, L97 et L119 d’une sous-unité, et V49, L53, T84 et F87 d’une sous-unité adjacente (Fig. 3e). Le cycle à six chaînons du fragment acide pipécolique est exposé au solvant et est stabilisé par le cycle phényle de F117 et les chaînes latérales hydrophobes de L97, L119 et L196 (Fig. 3e). La substitution méthylique supplémentaire sur le résidu allo-thréonine du cycle depsipeptidique (Fig. 1b) est exposé au solvant. Comme l’ADEP-04, l’ADEP-14 est fixé dans la poche hydrophobe hautement complémentaire par deux interactions de liaison hydrogène entre le groupe hydroxyle phénolique de Y67, le groupe amino du résidu difluorophénylalanine et le groupe carbonyle alanine dans le cycle depsipeptidique, et une liaison hydrogène médiée par un solvant avec E56 (Fig. 3e, f). La chaîne latérale de l’acide octadiénoïque de l’ADEP-14 est située dans le canal hydrophobe étroit formé par L53, F54 et S57 d’une sous-unité, et R27, L28, E31, I33, F35 et Y67 de la sous-unité voisine (Fig. 3e).

La liaison à l’ACP1 et à l’ADEP entraîne des effets allostériques distincts sur le baril de ClpP

En utilisant des structures de formes liées à l’apo et aux composés d’EcClpP et de NmClpP (Fig. 1c), nous avons sondé les effets allostériques qui se produisent lors de la liaison de l’activateur. Comme le montre la Fig. 2, la liaison de l’activateur agit comme un coin provoquant le déplacement latéral de deux sous-unités adjacentes. L’étendue du changement conformationnel global causé par la liaison ACP1-06 (rmsd = 0,84 Å par rapport à apo-EcClpP) est similaire à celle de l’ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å par rapport à l’apo-NmClpP), mais moins que pour l’ADEP-14 (rmsd = 2,47 Å par rapport à l’apo-NmClpP). Fait intéressant, le sens de déplacement est différent entre les deux classes d’activateurs (Fig. 2 et Films supplémentaires 1 à 4). Entre les deux ADEPs, l’ADEP-14 provoque une perturbation structurelle globale plus importante du cylindre NmClpP (comparer les films supplémentaires 3 contre 4). La liaison à l’ADEP entraîne une expansion de la surface apicale de NmClpP accompagnée d’une constriction au niveau de la région équatoriale. Le pivot pour ce mouvement se trouve dans la zone de poignée composée de l’hélice aE et du brin β8. Ce phénomène est observé dans toutes les structures ClpP liées à l’ADEP connues à ce jour, avec des degrés de compactage variables du cylindre clpp15, 18, 19, 23, 40. En revanche, la liaison ACP1-06 à EcClpP provoque un mouvement vers l’intérieur de toutes les sous-unités entraînant un serrage du cylindre ClpP (film supplémentaire 1). Ainsi, les structures montrent que les ACP1s et les ADEPs activent la ClpP en induisant des effets allostériques distincts.

Dans les structures EcClpP et NmClpP liées à l’activateur, les liaisons électrostatiques de l’interface anneau-anneau qui stabilisent le tétradécamère restent conservées malgré les changements de conformation (Fig. supplémentaire. 3). De plus, nonobstant le changement structurel global lors de la liaison de l’activateur, les triades catalytiques Ser-His-Asp d’EcClpP et de NmClpP conservent des géométries catalytiquement compétentes car seuls des changements mineurs du squelette de Ca se produisent près du site actif (Fig. supplémentaire. 1 bis à c). L’analyse de toutes les structures liées à l’ACP1 et à l’ADEP existantes de ClpP montre que la liaison au composé entraîne également la contraction de la région équatoriale (fig. 4).

Nous avons quantifié le compactage du cylindre ClpP lors de la liaison ACP1 ou ADEP en mesurant les volumes des chambres catalytiques respectives (Fig. 4). La liaison à l’ACP1-06 provoque une diminution d’environ 5% du volume de la chambre catalytique par rapport à l’apo-EcClpP. La liaison de l’ADEP1 à EcClpP entraîne une diminution similaire du volume de la chambre catalytique. Ceci est également observé pour d’autres structures ClpP liées à l’activateur telles que le NmClpP lié à l’ADEP-14, le BsClpP lié à l’ADEP et le complexe hétérooligomère MtClpP1P2 lié à l’ADEP (Fig. supplémentaire. 4).

L’activation de ClpP entraîne la réorganisation du réseau de liaisons électrostatiques au niveau des pores axiaux

Dans la structure de l’apo-NmClpP, deux liaisons électrostatiques près du pore axial stabilisent l’interface de deux sous-unités adjacentes quelconques (Fig. 3d, Fig. supplémentaire. 5). Premièrement, le groupe carboxylate E58 chargé négativement d’une sous-unité forme une paire d’ions avec le groupe guanidinium R27 chargé positivement de la sous-unité adjacente. Deuxièmement, les groupes hydroxyle S57 et carboxylate E31 de deux sous-unités adjacentes forment une liaison hydrogène. Lors de la liaison ADEP, ces deux liaisons non covalentes se rompent, tandis que la liaison ionique entre R27 et E31 de la même sous-unité est raccourcie, c’est-à-dire renforcée (Fig. 3e, f). Dans apo-EcClpP, une seule liaison ionique entre E67 et R36 relie deux sous-unités adjacentes, car le résidu équivalent à S57 de NmClpP est une alanine dans EcClpP et est donc incapable de former une liaison hydrogène avec E40 (Fig. 3 bis). Comme dans le NmClpP, la liaison d’ACP1 ou d’ADEP1 à EcClpP élimine la liaison ionique intersubunit E67-R36 et donne lieu à une liaison ionique intrasubunit plus forte entre R36 et E40 (Fig. 3b, c, Fig. supplémentaire. 5).

Pour vérifier davantage ces observations, nous avons conçu des mutants ponctuels NmClpP et EcClpP qui conduisent à la perte des liaisons électrostatiques intersubunitaires ci-dessus. Comme le montre la Fig. 4a, alors que le NmClpP WT était incapable de dégrader la caséine protéique, le mutant NmClpP E58A s’est avéré dégrader la caséine à un taux plus élevé que le mutant E31A. Fait important, le double mutant E31A + E58A avait une activité encore plus élevée que les mutants simples. Le degré d’activation du double mutant NmClpP est similaire à celui observé en présence d’ADEPs de 1 µM ou d’ACP1s de 10 µM (Fig. 4 bis). Un comportement similaire a été observé pour EcClpP avec des mutations similaires (E40A et E67A; Fig. 4b). Le double mutant EcClpP respectif n’est pas soluble et n’a pas pu être testé.

Par la suite, nous avons déterminé les structures de rayons X des mutants NmClpP E58A et NmClpP E31A+ E58A (tableau 1). Les sites catalytiques des deux mutants ne sont pas perturbés (Fig. 1e). Dans le mutant unique NmClpP E58A, la mutation abolit la liaison ionique intersubunit E58–R27 et donne lieu à une interaction intrasubunit R27–E31 plus forte, tandis que la liaison hydrogène entre S57 et E31 reste (Fig. 4c). Un « effet de coin » similaire est ainsi observé dans la structure, comme le montre le changement de conformation global subtil du squelette Ca du mutant NmClpP (rmsd = 0,33 Å par rapport au NmClpP en POIDS) (Film supplémentaire 5). La mutation de E31 et E58 en alanine pour générer le double mutant NmClpP E31A + E58A (rmsd = 0,29 Å par rapport au poids NmClpP) abolit les deux interactions électrostatiques intersubunitaires stabilisantes, ainsi que la liaison ionique intrasubunitaire R27-E31 présente dans le mutant unique NmClpP E58A (Fig. 4d et Film supplémentaire 6) et en NmClpP lié à l’ADEP (Fig. 3e, f). Ainsi, le double mutant NmClpP E31A + E58A est différent du NmClpP lié à l’ADEP avec la liaison ionique intrasubunit éliminée mais est néanmoins une protéine activée avec une activité protéolytique intrinsèque comparable à celle du ClpP activé par de petites molécules (Fig. 4 bis). Comme le NmClpP lié à l’ADEP, les mutants simples et doubles NmClpP ont des volumes de chambre catalytique réduits en raison du compactage du baril de ClpP (Fig. supplémentaire. 4).

Une telle réorganisation du réseau de liaison est observée pour toutes les structures ClpP activées disponibles dans l’APB, que ce soit en présence d’activateurs de petites molécules ou en raison de mutations spécifiques (Fig. 6). Par exemple, la liaison d’activateur de petites molécules à B. subtilis ClpP (BsClpP), à S. aureus ClpP (SaClpP), à M. tuberculosis ClpP (MtClpP) et à Homo sapiens ClpP (HsClpP) abolit une ou deux liaisons électrostatiques intersubunitaires près du pore axial, et donne lieu à une interaction ionique intrasubunitaire plus forte (Fig. supplémentaire. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. Dans MtClpP2, la liaison ionique intersubunit équivalente à l’interaction E58–R27 dans NmClpP n’existe pas18. Le résidu équivalent pour E58 de NmClpP est L66 dans MtClpP2 et ne peut pas participer à une interaction ionique avec K35 de MtClpP2 (équivalent à R27 de NmClpP). Au lieu de cela, une liaison hydrogène intersubunit entre S65 et E39 stabilise l’interface (Fig. 6g, h). La liaison ADEP à MtClpP2 rompt la liaison hydrogène S65-E39 et renforce la liaison ionique intrasubunitaire entre K35 et E3918.

Il est intéressant de noter que même la variante SaClpP Y63A activée 41, avec la mutation d’activation trouvée au centre du site hydrophobe, et donc non équivalente aux mutations d’activation de NmClpP présentées ici, soutient notre modèle proposé de réorganisation du réseau de liaison hydrogène autour du pore axial lors de l’activation de ClpP (Fig. supplémentaire. 6f). Dans la structure du mutant SaClpP Y63A, la distance entre la paire d’ions intersubunit (Q54–R23) est augmentée, tandis que le pont de sel intrasubunit (R23–D27) est renforcé (Fig. supplémentaire 6d, f). Nous avons également généré la mutation équivalente Y63A dans EcClpP et NmClpP. Le mutant NmClpP Y67A était insoluble, tandis que l’EcClpP Y76A avait une activité légèrement supérieure à celle du mutant E40A, mais inférieure à celle du mutant E67A (Fig. 4b).

L’activation de ClpP entraîne une réduction de l’hétérogénéité structurale des boucles axiales N-terminales

Comme indiqué ci-dessus, dans la boucle axiale ordonnée du complexe NmClpP + ADEP–04 formant la spire en épingle à cheveux β1-β2, la liaison ADEP libère R27 d’une liaison ionique intersubunitaire avec E58 et renforce la liaison ionique intrasubunitaire avec E31 de l’hélice aA (Fig. 5 bis). Par conséquent, R27 forme une liaison ionique avec D23 du brin β1 de la boucle axiale. Cette interaction stabilisatrice est observée dans toutes les structures liées à l’activateur de ClpP où les boucles axiales sont ordonnées (Fig. 5 bis à e).

Pour la structure EcClpP+ACP1-06, les boucles axiales (résidus 14-31) sont partiellement ordonnées dans le cristal avec seulement 1 boucle axiale sur 14 formant la spire en épingle à cheveux β1–β2 (Fig. 1c – la commande complète semble en partie empêchée par les effets d’emballage en cristal). Dans la boucle axiale ordonnée de la sous-unité A, la libération de R36 de la liaison ionique intersubunitaire avec E67 lui permet de former une liaison ionique intrasubunitaire plus forte avec E40 de l’hélice aA (Fig. 5f). Cependant, il n’y a pas d’interaction ionique stabilisante entre E22 du brin β1 et R36 de l’hélice aA, probablement due à un ordonnancement partiel (Fig. 5f). Une liaison hydrogène supplémentaire entre D32 du brin β2 et S21 de l’hélice aA ancre la boucle axiale au domaine de coeur EcClpP (Fig. 5f). De même, les boucles axiales de la structure Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4 ne sont que partiellement commandées21. La liaison hydrogène conservée entre le résidu Arg de l’hélice aA et un résidu chargé négativement du brin β1 n’est pas visible dans les boucles axiales EfClpP partiellement ordonnées, bien que EfClpP ait des résidus potentiels de formation de liaison hydrogène sur le brin β1 (T6), et sur les brins de connexion de boucle β1 et β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

En plus des interactions électrostatiques conservées, des contacts hydrophobes étendus avec le domaine de tête ClpP stabilisent les boucles axiales. Dans EcClpP+ ACP1-06, les résidus N-terminaux non polaires du brin β1 et de la bobine structurée précédente participent aux interactions hydrophobes avec les résidus apolaires de l’hélice aA de la même sous-unité, et sur les faces hydrophobes des hélices aA’ et aB’ d’une sous-unité voisine (Figure supplémentaire. 7 bis). Les résidus apolaires sur les hélices aA, aB’ et β3′ constituent un patch hydrophobe continu sur la circonférence du pore axial (Fig. supplémentaire. 7b) 15.

Pour obtenir une image plus claire de l’hétérogénéité conformationnelle des boucles axiales ClpP, des expériences de RMN méthyl-TROSY ont ensuite été réalisées. Initialement, une seule mutation de la cystéine a été introduite dans les boucles axiales du NmClpP (T10C). Une protéine uniformément deutérée a été produite et a ensuite réagi avec le 13C-méthyl-méthanethiosulfonate (MMTS). Il en résulte la fixation d’un seul groupe visible RMN 13CH3–S sur la chaîne latérale de la cystéine, conduisant à la formation d’un résidu de S-méthylthio-cystéine (MTC) 42. Cette méthode fournit un moyen facile de surveiller la structure et la dynamique de grands complexes en solution. La surveillance des corrélations RMN de la sonde de spin attachée sous des formes libres, liées à l’activateur ou mutées de l’enzyme fournit une lecture de la conformation en solution des pores axiaux.

Initialement, des expériences témoins ont été réalisées pour s’assurer que l’introduction de la fraction T10MTC ne perturbe pas la structure du NmClpP. En bref, les corrélations de cohérence quantique multiple hétéronucléaire 1H–13C (HMQC) de WT et de T10MTC NmClpP marquées 13CH3 au niveau de la chaîne latérale des résidus ILVM dans un fond autrement entièrement deutéré ont été comparées et se sont avérées pratiquement identiques. Par la suite, des corrélations HMQC 1H–13C de NmClpP T10MTC ont été obtenues dans différents états (Fig. 6 bis). La forme apo (contours bleus) présente un grand nombre de corrélations, indiquant des boucles axiales structurellement hétérogènes. Addition d’un excès molaire double d’ADEP-28 (activité donnée à la Fig. 4a) par rapport à la ClpP monomère, le nombre de corrélations (contours rouges) a considérablement diminué, ce qui indique une rigidification ou un ordre structurel. En revanche, la liaison ACP1-17 (excès molaire double par rapport au ClpP monomère; activité donnée à la Fig. 4a) entraîne des modifications indétectables des corrélations observées (contours verts), ce qui implique que les boucles axiales ne sont pas affectées.

Cette approche a également été exploitée pour surveiller l’effet de l’activation des mutations (Fig. 4a, b) sur les boucles axiales. Dans ces expériences, les mutations activatrices ont été introduites en arrière-plan de la mutation T10C (marquage). Comme le montre la Fig. 6a, les corrélations du mutant NmClpP T10MTC/E31A (contours rouges) sont légèrement moins hétérogènes que la forme pseudo-WT, tandis que celles du mutant NmClpP T10MTC/E58A (contours orange) sont pratiquement inchangées. La présence simultanée des deux mutations activatrices (NmClpP T10MTC/ E31A + E58A) a un effet beaucoup plus dramatique que les mutations simples et supprime un grand nombre de corrélations correspondant aux boucles axiales (contours noirs). Ceci est cohérent avec l’observation selon laquelle le mutant double est plus actif que les mutants simples (Fig. 4 bis).

L’activation de ClpP entraîne une réduction de l’hétérogénéité conformationnelle de la région du manche

La même approche basée sur la RMN a été utilisée pour sonder l’effet de la liaison et des mutations de l’activateur sur la région du manche. Un mutant I144MTC (helix aE) de NmClpP a été préparé et étudié par RMN sous des formes liées à apo, ADEP-28 et ACP1-17. La forme apo (contours bleus, Fig. 6a) présente une paire de pics, indiquant que la région du manche est associée à une paire de conformations coexistantes, comme on le voit dans nos travaux précédents sur EcClpP4. Fait intéressant, l’ajout d’ACP1 et d’ADEP entraîne la disparition de l’un des pics. Étant donné que le site de liaison de l’activateur est distal de la sonde de spin RMN, il apparaît que la liaison ACP1 ou ADEP sélectionne allostériquement pour l’une des conformations dans la région du manche. Alternativement, les activateurs peuvent être capables de lier les deux formes mais d’induire un changement à un seul état.

Expériences d’échange d’aimantation avec des périodes de retard de mélange de 100, 200, 300, 400, 500, et 600 ms à 40 °C ont été incapables de détecter une interconversion entre les conformères observées pour la région de la poignée pour WT NmClpP. Cela indique que le processus d’échange est trop lent pour être caractérisé par RMN.

SAXS démontre des changements conformationnels de ClpP induits par l’activateur dans la solution

Pour sonder davantage l’état oligomère et les changements structurels lors de la liaison au composé, les échantillons apo-NmClpP et NmClpP + ADEP-04 ont été caractérisés par SAXS (Fig. 6b-g et Fig. supplémentaires. 8). Les courbes finales fusionnées sont représentées à la Fig. 6b, et les profils SAXS obtenus ressemblaient à ceux de structures creuses 43. Aucun changement significatif n’a été constaté en termes de pliage global (fig. 8), le rayon de giration (Rg) et l’état oligomère lorsque l’ADEP-04 a été ajouté au NmClpP (Fig. supplémentaire. 8c). Afin d’analyser plus en détail les profils SAXS NmClpP et de générer des structures ab initio de solution, le programme GNOM a été utilisé pour construire des fonctions de distribution de distance par paires, p(r). L’Apo-NmClpP p(r) a révélé un décalage subtil vers la droite et une dimension maximale plus grande (Dmax) par rapport au NmClpP lié à l’ADEP-04 (Fig. 6c et Fig. supplémentaires. 8c). Par la suite, des modèles d’atomes fictifs (DAM) ont été générés à l’aide des données SAXS pour analyser visuellement les structures de la solution NmClpP (Fig. 6d-g). Dix modèles ont été générés pour l’apo-NmClpP et le NmClpP lié à l’ADEP-04, et les plus probables ont été choisis. Ces modèles ont montré que, globalement, les deux structures de solution NmClpP sont similaires (cylindres creux). Cependant, en superposition avec les structures cristallines correspondantes, des différences qui concordent avec les structures à haute résolution ont été facilement observées (Fig. 6d, e). Une mesure des hauteurs axiales des dix barrages pour le NmClpP lié à l’apo et à l’ADEP-04 a donné des valeurs de 93,0 ± 5,4 Å pour la forme apo et de 103,5 ± 6,1 Å pour la forme liée à l’ADEP-04. Pour corroborer davantage cette observation, les cartes de probabilité moyennes des barrages et les cartes d’occupation des DAS les plus élevées (Fig. 6f, g) ont été analysés. Les hauteurs axiales ont montré une augmentation d’environ 10 Å pour le NmClpP lié à l’ADEP-04 par rapport à l’apo-NmClpP. De plus, le NmClpP lié à l’ADEP-04 présentait une circonférence de pores axiale plus grande que l’apo-NmClpP (Fig. 6 f, g). Ainsi, malgré la faible résolution de la technique SAXS, les résultats suggèrent que la liaison de l’ADEP-04 au NmClpP n’affecte pas l’état oligomère du NmClpP mais provoque une expansion des pores axiaux et une occupation accrue aux parties supérieure et inférieure du BARRAGE NmClpP + ADEP-04 (Fig. 6e, g) par rapport à l’apo-NmClpP. Cela reflète probablement les changements conformationnels conduisant à la diminution de l’hétérogénéité de la structure des boucles axiales N-terminales de NmClpP observées par rayons X et RMN.