La microdélétion du chromosome Y chez un père et ses quatre fils infertiles

Résumé

Les microdélétions de Yq sont associées à une azoospermie et à une oligozoospermie sévère. En général, les hommes avec des délétions sont stériles et, par conséquent, les délétions ne sont pas transmises aux fils à moins que la fécondation in vitro (FIV) et l’injection intracytoplasmique de sperme (ICSI) ne soient effectuées. Nous rapportons une famille inhabituelle caractérisée par plusieurs membres atteints d’infertilité et de microdélétion Yq. Des antécédents reproductifs complets, des analyses de sperme et des échantillons de sang ont été obtenus auprès des membres de la famille concernés. La préparation et la quantification de l’ADN ont été effectuées à l’aide de kits commerciaux. Un total de 27 paires d’amorces basées sur des sites marqués de séquences spécifiques aux loci de la région de microdélétion Y ont été utilisées pour le criblage. Des taches méridionales utilisant des ADNC délétés dans l’azoospermie (DAZ) et le motif de liaison ribosomique (RBM) ont ensuite été analysées pour confirmation. Le proband, ses trois frères et son père ont tous été supprimés pour DAZ mais pas pour RBM. Au moment de l’analyse, le père du proband était azoospermique alors que ses quatre fils étaient soit fortement oligozoospermiques, soit azoospermiques. Contrairement à leur père, les quatre fils sont infertiles et n’ont pas de progéniture, à l’exception de l’un d’eux qui n’a eu une fille qu’après un traitement de FIV / ICSI pour l’infertilité. Les microdélétions de Yq impliquant le gène DAZ sont associées à une expression phénotypique variable pouvant inclure une fertilité manifestement normale.

Introduction

L’infertilité survient chez environ 14 % des couples (Mosher, 1985) et on estime que des anomalies chez le partenaire masculin sont présentes dans jusqu’à la moitié des cas (Swerdloff et al., 1985). Les efforts visant à évaluer les causes de l’azoospermie ont montré qu’après exclusion des causes traditionnellement reconnaissables (caryotype anormal, obstruction, varicocèle, défaut hormonal, etc.), la plupart des cas (50 à 75 %) sont inexpliqués et sont qualifiés d’idiopathiques (Pryor et al., 1997). Récemment, il a été rapporté que jusqu’à 30% des hommes atteints d’azoospermie « idiopathique » présentent des microdélétions du chromosome Y (Henegariu et al., 1993; Ma et coll., 1993; Nagafuchi et coll., 1993; Kobayashi et coll., 1994; Najmabadi et coll., 1996; Reijo et coll., 1996; Vogt et coll., 1996; Pryor et coll., 1997). Exactement comment et si ces microdélétions provoquent ou non l’azoo / oligozoospermie fait l’objet d’une enquête et d’un débat intenses.

L’observation que les microdélétions Y provoquent l’infertilité est essentielle à l’argument selon lequel les hommes fertiles manifestent rarement des microdélétions Y. Des microdélétions chez quatre des 200 hommes fertiles étudiés ont été rapportées (Pryor et al., 1997). Cependant, les suppressions chez ces hommes étaient très faibles et représentaient très probablement un polymorphisme insignifiant. Des délétions relativement importantes du type associé à l’infertilité masculine n’ont pas été rapportées chez les hommes ayant une fertilité normale. Bien qu’il soit généralement supposé que ces délétions surviennent de novo et que la transmission de père en fils de la microdélétion Y ne serait pas attendue, quelques rares cas de transmission de père en fils de la microdélétion du chromosome Y ont été rapportés (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et coll., 1996; Vogt et coll., 1996; Pryor et coll., 1997). Cependant, la transmission verticale d’une microdélétion impliquant le locus délété en azoospermie (DAZ) du père à un fils n’a été rapportée que dans trois cas (Kobayashi et al., 1994; Vogt et coll., 1996; Pryor et coll., 1997). Nous décrivons maintenant une famille de quatre générations dans laquelle un père azoospermique et ses quatre fils infertiles partagent tous une microdélétion apparemment identique qui inclut le locus DAZ. Cette famille représente le premier et le seul rapport de transmission verticale spontanée de la délétion DAZ à plusieurs descendants. Il fournit la preuve qu’une seule microdélétion Yq peut entraîner une expression phénotypique variable chez différents individus. Elle est cliniquement significative, en ce sens que la présence d’une microdélétion n’est pas un marqueur absolu de l’infertilité et peut être associée à une fertilité apparemment normale.

Matériaux et méthodes

Le dépistage de la microdélétion Yq a été effectué de manière routinière pour l’infertilité masculine à l’aide d’un protocole examiné et approuvé par le Conseil d’examen institutionnel du Collège des médecins & Chirurgiens de l’Université Columbia. Des échantillons ont été prélevés sur des patients après consentement éclairé.

Analyse du sperme

Les résultats ont été analysés selon les critères de l’OMS avec un microscope à contraste de phase Nikon.

Les concentrations d’hormones sériques

L’hormone folliculo-stimulante (FSH), l’hormone lutéinisante (LH) et la testostérone ont été mesurées par un test immunométrique enzymatique chimioluminescent à deux sites en phase solide (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, États-Unis). Les plages normales pour les hommes sont FSH < 10 mUI / ml; LH < 10 mUI / ml; et la testostérone 270-1070 ng / dl.

ADN génomique

L’extraction de l’ADN génomique du sang total a été réalisée par lyse des globules rouges, suivie d’une lyse des globules blancs et de leurs noyaux. Les protéines cellulaires ont été éliminées par précipitation de sel et l’ADN génomique a été précipité avec de l’isopropanol à l’aide du kit d’extraction d’ADN Puregene (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, États-Unis; numéro de catalogue. D-5004).

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Des amorces ont été produites sous forme d’oligonucléotides séchés sur un synthétiseur d’ADN automatisé (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, Californie, États-Unis). Un total de 27 sites marqués de séquences spécifiques du chromosome Y (figure 1) ont été sélectionnés à partir d’une carte STS (Vollrath et al., 1992). Ils comprennent les trois loci de spermatogenèse proposés AZFa, AZFb et AZFc (selon Vogt et al., 1996) couvrant les intervalles Yq 5, 6 et 7. En tant que protocole de criblage rapide, un système multiplex PCR composé de deux à six paires d’amorces différentes a été utilisé dans un total de six réactions multiplexées (tableau I). À chaque course de PCR, un contrôle féminin et un contrôle masculin normal ont été inclus. Toutes les réactions de PCR ont été exécutées dans des plaques de polycarbonate (Techne®) dans une machine MJ Research®. Les conditions de PCR étaient essentiellement telles que décrites précédemment (Henegariu et al., 1993). Brièvement, dans une réaction en volume total de 14 µl, 50 ng d’ADN génomique ont été utilisés comme matrice, 1 µl de solution étalon d’amorce (mélange I ou II ou III ou IV ou V ou VI constitué de 10 pmol par amorce), 12 µl de « mélange à froid PCR » (1,5 mmol / l MgCl2, 0,2 mmol / l de chaque dNTP, 5% de DMSO, 1 × Tampon de réaction de polymérase Taq sans Mg2+), 1,25 UI d’ADN polymérase Taq (Promega) et 1 goutte d’huile. Les mélanges complets ont été placés directement dans un thermocycleur préchauffé à 94°C. Les conditions de cyclage pour 27 cycles ont été: 94 ° C, 30 s (fusion); 55 ° C, 45 s (recuit); et 72 ° C, 60 s (extension). Le temps de prolongation final était de 5 min. Les produits de réaction de PCR ont ensuite été séparés sur gels d’agarose à 3% (Bio-Rad, grade ultra-pur) par électrophorèse en tampon TBE. Les produits de PCR ont été colorés avec du bromure d’éthidium et visualisés par exposition à la lumière ultraviolette. Les ST ne montrant aucune amplification dans les réactions multiplex ont été confirmés par PCR à réaction unique avec des témoins positifs et négatifs appropriés. Un STS a été considéré comme absent après trois échecs d’amplification.

Hybridation Southern

Le Southern blot a été effectué selon le protocole établi (Sambrook et al., 1989). Brièvement, 5 µg d’ADN génomique ont été digérés avec du HindIII ou du TaqI, exécutés sur un gel d’agarose à 0,7% dans un tampon TBE standard, transférés sur une membrane en nylon et hybridés avec des sondes marquées au 32P. La sonde DAZ était l’insert purifié d’un plasmide (pDP1577) contenant l’ADNc pleine longueur (Reijo et al., 1995). De même, la sonde RBM était l’insert plasmidique d’un clone d’ADNc RBM (MK5) (Ma et al., 1993).

Détermination de la paternité

La paternité des quatre fils a été confirmée en montrant la ségrégation attendue de quatre marqueurs autosomiques hautement polymorphes (Weber et May, 1989). Il s’agissait de D21S156, D21S270, D13S132 et D13S159 avec des hétérozygoties de 0,83, 0,86, 0,84 et 0,90 respectivement.

Hybridation in situ fluorescente (FISH)

FISH pour DAZ a été réalisée avec le Cosmide 63C9 (Saxena et al., 1996), en utilisant des méthodes établies (Yu et al., 1996).

Résultats

Le proband (individu III 8 sur la figure 2) et son conjoint (III-9) se sont présentés à la Clinique d’endocrinologie de la reproduction et de l’infertilité du Columbia-Presbyterian Medical Center avec plainte d’infertilité primaire pendant 3 ans. Les tests ont révélé des taux normaux de caryotype et d’hormones sériques, tandis que les analyses de sperme ont montré une oligozoospermie sévère (tableau II). Le dépistage de la microdélétion par PCR à base de STS a révélé la présence d’une microdélétion dans le sous–intervalle 6D-6F du bras long du chromosome Y (Figure 1). Au cours de la discussion, le proband a rapporté que ses deux frères aînés (III-4 et III-6) étaient connus pour être azoospermiques et infertiles. Un examen ultérieur a révélé que les trois frères avaient une microdélétion apparemment identique. Une biopsie testiculaire réalisée sur l’un d’eux (III-6) a mis en évidence le syndrome « cellule de Sertoli uniquement ».

La découverte d’une microdélétion chez trois frères infertiles a suggéré que leur père était susceptible de porter la même délétion. Une étude détaillée a été entreprise sur le reste de la famille qui résidait tous dans une petite ville de la République dominicaine. Des antécédents reproductifs complets ont été obtenus auprès des membres adultes de la famille. Les relations familiales représentées dans le pedigree (Figure 2) ont été confirmées en montrant la ségrégation attendue de plusieurs marqueurs polymorphes autosomiques (données non représentées) pour les membres de la famille concernés (I-1, I-2, II-1, II-8 et II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Il n’y avait aucune preuve de non-paternité. Des études cytogénétiques approfondies sur des membres pertinents de la famille (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 et IV-1) ont révélé des caryotypes normaux. L’analyse du sperme a été effectuée chez sept des 16 mâles et des échantillons de sang ont été prélevés sur la plupart des membres de la famille.

Le tableau II résume les résultats de l’analyse du sperme et du travail endocrinien sur les membres de la famille concernés. Le proband (III-8), son père (II-1) et deux de ses trois frères (III-4, III-6) ont été trouvés azoospermiques ou sévèrement oligozoospermiques. Le frère aîné du proband (III-1) a refusé l’analyse du sperme. De plus, l’oncle du proband (II-8) présentait une azoospermie et une FSH élevée avec une faible taux de testostérone. Comme le montre la figure 1, le proband, son père et ses trois frères ont tous une microdélétion de Yq par analyse PCR STS. Le transfert southern avec les sondes DAZ (Figure 3) et RBM (données non représentées) a confirmé que la délétion incluait le locus DAZ mais pas le locus du motif de liaison à l’ARN (RBM). Analyse des poissons avec le cosmide DAZ 63C9 (Saxena et al., 1996) des leucocytes du père du proband (II-1) ont montré une absence uniforme du locus DAZ (Figure 4).

La découverte que l’individu II-8 dans le pedigree était azoospermique mais n’avait pas de microdélétion était une surprise. Le locus DAZ chez cet individu a été testé plus avant par analyse Southern en utilisant l’ADNc DAZ et une enzyme de restriction différente (TaqI). Il n’a montré aucune anomalie du locus DAZ. De plus, les POISSONS avec le cosmide DAZ 63C9 ont montré une intensité normale (données non présentées).

Le proband (III-8) et son frère aîné (III-6) cherchaient un traitement contre l’infertilité. Après un conseil approfondi, ils ont opté pour la fécondation in vitro (FIV) et l’injection intracytoplasmique de sperme (ICSI). Le proband (III-8) et sa femme (III-9) ont subi deux cycles de FIV-ICSI qui n’ont pas produit de grossesse secondaire à une mauvaise réponse ovarienne. Le frère du proband (III-6) et sa femme (III-7) ont subi un cycle d’hyperstimulation ovarienne contrôlée et neuf ovocytes ont été récupérés. Onze spermatozoïdes matures ont été trouvés dans trois éjaculations le jour de la récupération et utilisés pour l’ICSI. Trois ovocytes fécondés qui se sont ensuite clivés et ont été transférés. Elle a accouché d’une femelle en bonne santé (IV-2).

Discussion

Nous rapportons une famille exceptionnelle dans laquelle un père azoospermique et ses quatre fils infertiles partagent une microdélétion Yq apparemment identique impliquant le locus DAZ. La mutation de-novo qui a conduit à la microdélétion de DAZ semble provenir du père du proband (II-1). Cette délétion devrait provoquer une azoo / oligozoospermie et une infertilité masculine, et pourtant il a spontanément conçu cinq enfants et ignorait tout problème de fertilité. Fait intéressant, cependant, les quatre fils sont infertiles et sont soit azoospermiques, soit sévèrement oligozoospermiques.

Cette famille soulève plusieurs questions quant à l’association entre la microdélétion Yq et l’infertilité. Premièrement, il confirme que la transmission verticale de la microdélétion Yq est possible et peut entraîner une infertilité ultérieure chez la progéniture mâle. Deuxièmement, il est évident qu’une même délétion peut entraîner des phénotypes différents chez différents individus. Bien que le père (II-1) des quatre garçons de cette famille était azoospermique au moment de l’analyse, il a engendré son premier enfant à l’âge de 25 ans et son dernier à l’âge de 38 ans. Ainsi, il possédait un certain degré de fertilité sur une grande période d’années. De même, la microdélétion du chromosome Y, en particulier la DAZ, n’implique pas nécessairement une histoire d’azoospermie à vie et n’empêche pas la formation d’une grande famille. Ses quatre fils, en revanche, sont infertiles et azoospermiques ou sévèrement oligozoospermiques.

Le gène DAZ a été proposé comme facteur d’azoospermie sur le chromosome Y. Cette famille montre clairement que si la DAZ peut avoir un rôle critique dans la spermatogenèse, elle n’est pas essentielle à la fertilité. De plus, la perte totale du groupe de gènes DAZ peut être associée à une image histologique de « cellule de Sertoli uniquement » ainsi qu’à un arrêt de la maturation des spermatozoïdes (Foresta et al., 1997; Pryor et coll., 1997). Plusieurs auteurs ont trouvé une mauvaise corrélation entre la localisation des microdélétions Y (y compris les délétions DAZ) et le phénotype clinique et histologique des patients (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et coll.; 1996; Silber et coll., 1998). Les résultats de cette famille conviennent qu’une telle corrélation peut s’avérer assez problématique. La biopsie testiculaire du frère du proband (III-6) a montré une image de « cellule de Sertoli uniquement » alors que le proband (III-8 avec un nombre de spermatozoïdes de 0,5×106 / ml) devrait clairement présenter un certain degré de maturation des spermatozoïdes lors de la biopsie. De plus, la biopsie testiculaire peut ne pas être représentative de l’ensemble du testicule car il peut y avoir une hétérogénéité géographique pour la spermatogenèse comme chez l’individu III-6 dont les éjaculations contenaient des spermatozoïdes matures.

Nous ne pouvons que spéculer sur la base des différences phénotypiques entre les membres de la famille avec la même délétion. Il est bien connu que des délétions identiques au sein des autosomes peuvent entraîner des phénotypes différents (Schinzel, 1994). On peut postuler que de telles différences sont des conséquences de l’exposition de chaque individu à son environnement ou de l’expression de divers gènes modificateurs. Un père fertile a été décrit avec une microdélétion qui s’est élargie lorsqu’elle a été transmise à son fils infertile (Stuppia et al., 1996). Bien que des extensions variables aux frontières de la délétion puissent exister entre nos différents membres de la famille, ces extensions moléculaires ne peuvent pas être distinguées par un mappage d’intervalles. Par analyse PCR, le même STSs n’a pas réussi à s’amplifier chez nos cinq individus et l’hybridation de Southern avec la sonde DAZ a confirmé une délétion complète de cet amas de gènes. Bien qu’il soit possible que les délétions observées ne soient en fait pas identiques et que des zones adjacentes puissent contenir des gènes importants qui modulent le degré d’expression phénotypique, ces résultats indiquent tout de même un chevauchement important de l’ADN Y délété (y compris la perte du groupe de gènes DAZ) chez chaque individu de cette famille unique.

Nous avons été fascinés par le fait que l’oncle du proband (II-8) a une infertilité et une azoospermie mais aucune microdélétion apparente par test STS. Étant donné que les analyses de southern blot utilisant à la fois les sondes RBM et DAZ ainsi que les analyses de POISSONS utilisant un cosmide DAZ étaient tout à fait normales, nous sommes obligés de conclure qu’il a une étiologie différente sous-jacente à son infertilité. Certes, il est possible qu’il présente une mutation / perturbation plus petite ou ponctuelle ou un réarrangement proximal / distal qui n’est pas détectable par les méthodes actuelles. Il n’a donné aucun antécédent d’exposition à des gonadotoxines ou à d’autres facteurs définissables susceptibles d’affecter la spermatogenèse.

Jusqu’à récemment, la microdélétion Y avait peu de signification clinique, car un homme avec une délétion ne se reproduira pas, en général,. Cependant, en utilisant l’ICSI et l’aspiration du sperme testiculaire (TESA), combinée à la FIV, il est maintenant possible pour les hommes oligo / azoospermiques atteints de microdélétion Y de réaliser des grossesses (Mulhall et al., 1997; Silber et coll., 1998, et individu III-6). Cela a suscité des inquiétudes quant au fait que de telles grossesses puissent produire une progéniture mâle avec des microdélétions similaires et une infertilité subséquente (Reijo et al., 1996; Girardi et coll., 1997; Kremer et coll., 1997). En effet, la microdélétion Yq peut être transmise à la progéniture mâle via ICSI (Kent-First et al., 1996). La famille que nous rapportons suggère que les hommes atteints de microdélétions Yq (comme l’individu II-1) qui réalisent une grossesse transmettront la même microdélétion et le même risque d’infertilité à leurs fils (individus III-1, III-4, III-6, III-8). Par conséquent, les patients devraient se voir proposer un dépistage de la microdélétion Y avant l’ICSI et ils devraient être conseillés sur la certitude de transmettre la microdélétion Yq et éventuellement l’infertilité à leurs fils. Comme de plus en plus de recherches sont axées sur les étiologies génétiques de l’infertilité masculine, l’identification des gènes impliqués dans la spermatogenèse devrait fournir un aperçu de la physiopathologie de l’infertilité masculine et une base plus rationnelle pour initier un traitement.

Nous remercions les familles pour leur coopération dans l’étude; le Dr David C.Page pour avoir fourni la sonde ADNC DAZ et son aide inestimable pour ce manuscrit; le Dr Kun Ma pour avoir fourni la sonde ADNc MK5 (RBM1); Dr Peter Vogt pour l’ADN des individus microdélétés de Yq utilisés pour valider notre méthodologie de PCR STS; et C.C.Yu et Patricia Lanzano pour leur aide technique inestimable.

Cette étude a été financée en partie par les prix du personnel du Bureau des essais cliniques du Columbia Presbyterian Medical Center.