hématopoïèse clonale chez les patients atteints de vascularite associée à des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles | Haematologica

hématopoïèse clonale de potentiel indéterminé (CHIP) – définie par la présence d’une mutation génétique hématologique somatique associée au cancer avec une fréquence d’allèle variant ≥2% – se produit dans le sang périphérique d’au moins 10% des personnes âgées de plus de 60 ans sans antécédents de trouble hématologique.21 Les mutations affectent principalement les régulateurs épigénétiques de la transcription DNMT3A, TET2 et ASXL1, conduisant à un avantage compétitif des cellules souches hématopoïétiques mutées avec un biais de différenciation ultérieur vers le compartiment myéloïde.43 La fréquence des puces augmente avec l’âge et s’associe à un risque plus élevé de développer des tumeurs malignes hématologiques et des maladies cardiovasculaires, entraînant une mortalité globale accrue.5

En utilisant un modèle de souris avec des macrophages déficients en Tet2, il a été montré que l’athérosclérose et la maladie coronarienne sont entraînées par la puce via une fonction inflammasome altérée, entraînant une augmentation des taux de cytokines pro-inflammatoires.6 Notre groupe a récemment détecté une corrélation entre les mutations du DNMT3A et la maladie chronique du greffon contre l’hôte, fournissant une preuve supplémentaire du rôle important de la puce dans les réactions inflammatoires chroniques.7 Cependant, on sait peu de choses sur le rôle de la puce dans les maladies auto-immunes. Une étude menée chez 56 patients atteints de polyarthrite rhumatoïde n’a montré aucune corrélation entre la puce et l’activité de la maladie.8 Les vascularites auto-immunes associées aux anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles (ANCA) comprennent une variété de vascularites nécrosantes, y compris la granulomatose avec polyangiite et la polyangiite microscopique, et sont caractérisées par une inflammation grave des petits vaisseaux, affectant potentiellement tous les systèmes organiques. Les ANCA sont dirigés contre l’autoantigène myéloperoxydase (MPO) et la protéinase 3 (PR3). En se liant à leurs antigènes exprimés à la surface des cellules, les IgG ANCA provoquent une activation incontrôlée des neutrophiles et des monocytes, entraînant des lésions endothéliales et une défaillance des organes terminaux. Chez la plupart des individus, la charge de mutation la plus élevée de CHIP se trouve dans les cellules myéloïdes,4 qui sont les seules cellules répondeuses primaires exprimant l’autoantigène dans l’AAV. De plus, TET2 et DNMT3A jouent un rôle central dans le silençage génique en régulant la méthylation de l’ADN. En fait, un silençage génique défectueux dans les cellules myéloïdes de patients atteints d’AAV a été rapporté. Ce processus dérégulé comprenait les autoantigènes ANCA et était corrélé avec le risque de rechute.119

En résumé, des données récentes appuient l’idée de liens potentiels, en ce qui concerne la pathogenèse et les résultats cliniques, entre les puces et les maladies auto-immunes / affections inflammatoires. Nous avons donc caractérisé CHIP dans une grande cohorte de patients atteints d’AAV, en examinant la prévalence, les changements dynamiques au fil du temps, les manifestations organiques, le silençage de l’antigène ANCA et l’activation in vitro induite par ANCA.

Nous avons prélevé des échantillons de sang périphérique de patients atteints d’AAV, vus dans les services et services ambulatoires de néphrologie Charité/HELIOS (Berlin, Allemagne, entre avril 2005 et octobre 2018. Les données démographiques et cliniques des patients ont été extraites de leur dossier médical. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé écrit à l’inclusion dans l’étude, qui a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki. L’approbation éthique a été obtenue auprès des comités d’éthique locaux.

L’ADN de sang entier a été testé pour la PUCE à l’aide d’une version personnalisée du panneau de séquençage myéloïde Illumina TruSight (Tableau supplémentaire en ligne S1) sur un séquenceur NextSeq. L’analyse de séquençage a été réalisée à l’aide d’un hub de séquençage de la plate-forme Illumina BaseSpace. Seules des variantes non synonymiques avec des fréquences d’allèles ≥2% ont été incluses. Les variantes candidates ont été validées par séquençage approfondi ciblé (Méthodes supplémentaires en ligne). Un total de 46 mutations somatiques ont été identifiées chez 34 patients AAV sur 112 (30,4%) avec une fréquence d’allèle variant médiane de 5.2% (Tableau Supplémentaire En Ligne S2). Alors que 25 patients avaient une seule mutation, huit en avaient deux et un patient en avait cinq. Les gènes les plus fréquemment mutés étaient DNMT3A (19/46 = 39,1 %), TET2 (7/46 = 15,2 %) et ASXL1 (4/46 = 8,7 %) (Figure 1A). Parmi les 46 mutations, 26 étaient fausses, 18 tronquaient et deux étaient des mutations au site d’épissure. Le changement de base le plus fréquent dans les mutations de faux sens était C > T (16/30) (Figure supplémentaire en ligne S1).

Par rapport aux prévalences précédemment rapportées de CHIP dans des cohortes témoins non sélectionnées d’âge et de technologie de séquençage similaires,15128743 la prévalence de CHIP chez les patients atteints d’AAV était significativement plus élevée (30,4 % vs 13,5 %, P < 0,001) (Figure 1C, Tableau supplémentaire en ligne S3). Compte tenu des différentes technologies de séquençage utilisées dans ces études, nous avons étudié une cohorte témoin appariée selon l’âge et le sexe de 112 individus en bonne santé, parmi lesquels 22 mutations ont été trouvées chez 20 sujets (témoins sains vs patients AAV: 17,9% vs 30,4%, P = 0.042) (Tableau Supplémentaire En Ligne S4, Chiffres Supplémentaires En Ligne S2-S4). Il est à noter que nous avons trouvé une proportion pertinente de patients atteints d’AAV avec une PUCE âgée ≤55 ans (6/33 = 18,2%) (Figure 1B). Des échantillons de sang périphérique de suivi étaient disponibles pour 19 patients atteints d’AAV à puce. Le suivi médian était de 2,3 ans (intervalle de 0,3 à 10,9 ans). La charge mutationnelle des échantillons en série de ces 19 patients à deux ou quatre moments a été quantifiée par séquençage approfondi.171674 Alors que cinq patients présentaient une augmentation significative de la taille des clones, deux patients présentaient une légère diminution des clones et 12 patients ne présentaient aucun changement dans la taille des clones au fil du temps (Figure 1D, Figure supplémentaire en ligne S5). Ensuite, nous avons étudié un échantillon de suivi de chacun des 20 patients sous puce, prélevé 2 à 10 ans après l’échantillon initial. Aucun des 20 échantillons de suivi n’a montré de nouvelle mutation.

Des analyses statistiques exploratoires ont été effectuées pour identifier les associations entre la puce et les paramètres cliniques (76 patients atteints de granulomatose avec polyangiite et 34 avec polyangiite microscopique). Les patients à puce étaient significativement plus âgés que les patients à puce (médiane de 70,5 vs 63,0 ans, respectivement, P = 0,017). La prévalence du CHIP n’était pas plus élevée chez les patients ayant reçu un traitement immunosuppresseur avant l’échantillonnage (100% de stéroïdes, 90% de cyclophosphamide, 20% de rituximab, 16% d’azathioprine, 13% de méthotrexate). Aucune différence dans la numération globulaire, la largeur de distribution des globules rouges, les taux de créatinine, les comorbidités, le développement de tumeurs malignes, l’état de l’activité de la maladie et le risque de rechute d’AAV n’a été observée en ce qui concerne l’état de la puce. Cependant, les schémas de manifestation de la maladie différaient: les patients atteints de granulomatose avec polyangiite présentaient moins d’insuffisance rénale (68,2% contre 88,5%, P = 0,049) et d’atteinte du système nerveux (0% contre 19,2%, P = 0,028) (Tableaux Supplémentaires en ligne S5-S8, Chiffres Supplémentaires en ligne S6-S8).

Ensuite, nous avons cherché à étudier le silençage de l’antigène ANCA et l’activation in vitro induite par ANCA. Dans ce but, des tests de stimulation des neutrophiles in vitro utilisant l’oxydation de la dihydrorhodamine avec des anticorps monoclonaux contre les antigènes ANCA MPO et PR3 ont été réalisés chez un sous-ensemble de patients atteints d’AAV et de témoins sains (Méthodes supplémentaires en ligne) qui avaient été testés négatifs pour la PUCE. Une activation réduite a été observée chez les patients CHIP par rapport aux patients CHIP AAV (anti-MPO: indice de stimulation: 6,29 vs 13,01, P = 0,057; anti-PR3: indice de stimulation 7,72 vs 13,00, P = 0.026) (Figure 2A), alors qu’aucune différence d’indice d’expression membranaire ou de pourcentage de cellules positives n’a été observée (Figure 2B, C). De plus, les taux d’ARNm dans le sang périphérique de PR3, MPO, CD177, RUNX3 et JMJD3 ont été mesurés par réaction quantitative en chaîne par polymérase. Les patients atteints d’AAV à PUCE ont montré une expression accrue de l’ARNm MPO et PR3 par rapport aux niveaux chez les témoins sains (MPO: 1,94 vs 0,86, P = 0,026; PR3: 2,02 vs 0,58, P = 0,057), une différence moins apparente chez les patients atteints de PUCE. Cependant, les patients atteints d’AAV à PUCE ont montré une expression réduite de l’ARNm RUNX3 par rapport au niveau des témoins sains (0.28 contre 0,79, P = 0,007) (Figure 2). En raison du petit nombre de patients, nous n’avons pas pu subdiviser davantage les patients atteints d’AAV à PUCE en fonction des gènes affectés ou des fréquences d’allèles variables et nous n’avons donc pas pu évaluer leur impact potentiel sur nos résultats (Tableau supplémentaire en ligne S9). De plus, des différences significatives dans le nombre de neutrophiles et de lymphocytes entre les patients atteints d’AAV et les témoins sains pourraient avoir affecté nos résultats et limiter la capacité de tirer des conclusions généralisées (Tableau supplémentaire en ligne S10).

In summary, we detected CHIP in 34 out of 112 patients (30.4 %), une prévalence significativement plus élevée que celle rapportée dans les cohortes saines et dans notre groupe témoin apparié selon l’âge, mais comparable à une fréquence accrue rapportée chez les patients atteints de cancer, d’anémie12 aplasique18 et de maladies cardiovasculaires.5 Bien que la signalisation inflammatoire altérée ait été proposée comme mécanisme sous-jacent à l’association des syndromes myélodysplasiques avec des maladies auto-immunes / affections inflammatoires,19 un mécanisme similaire pourrait relier CHIP à de telles affections et, en particulier, à l’AAV. La transcription autoantigène ANCA dérégulée est couramment observée dans l’AAV et pourrait être modifiée par CHIP. Fait intéressant, les patients atteints d’AAV à PUCE, mais pas à PUCE, ont montré une régulation de l’expression de l’ARNm autoantigène précédemment rapportée.119 Cette découverte assez surprenante suggère que l’expression de l’antigène ANCA régulée à la hausse est vraisemblablement un phénomène secondaire dans l’AAV, induit par une signalisation inflammatoire défectueuse dans les cellules de la PUCE. Dans cette optique, une réduction de l’activation des neutrophiles induite par l’ANCA a été observée chez les patients sous puce. Fait intéressant, nous avons précédemment démontré que la production induite par l’ANCA d’espèces réactives de l’oxygène joue un rôle majeur dans la régulation négative de l’activation de l’inflammasome par inhibition oxydative de la cascade de l’inflammasome-caspase-1-interleukine-1β.20 La diminution de la production d’espèces réactives de l’oxygène par les neutrophiles des PUCES que nous avons trouvées pourrait donc contribuer à une activation excessive de l’inflammasome et affecter ainsi la pathogenèse de l’AAV. Cliniquement, nous avons trouvé moins de manifestations rénales et neuronales chez les patients atteints de CHIP, ce qui soutient l’idée que la CHIP fonctionne comme un modificateur de la maladie dans l’AAV.

Dans l’analyse longitudinale, plus de 25% des patients ont montré une augmentation de la taille des clones au fil du temps sans impact significatif d’un traitement spécifique sur l’expansion des clones. La fréquence des puces n’a pas été augmentée chez les patients précédemment traités par des agents immunosuppresseurs/cytotoxiques et n’a pas été enrichie pour les mutations impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN (Tableau supplémentaire en ligne S11). Il semble donc peu probable que la prévalence élevée de CHIP ne soit qu’une conséquence d’un traitement cytotoxique et, avec la taille croissante des clones, justifie une surveillance plus étroite des patients atteints d’AAV en raison du risque connu de progression vers des syndromes myélodysplasiques ou une leucémie myéloïde aiguë.1513

Collectivement, nos données révèlent une nouvelle association d’AAV avec CHIP avec des effets potentiellement modificateurs de la maladie, comme le montrent l’activation des neutrophiles, la régulation de la transcription des autoantigènes et la manifestation des organes. Nous reconnaissons que, compte tenu des multiples tests, les valeurs P ne représentent pas l’erreur globale de type I. Des études futures et des investigations fonctionnelles sont maintenant justifiées pour confirmer ces résultats et déchiffrer les mécanismes moléculaires.

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