Frontières en Physiologie

Introduction

Les réseaux de neurones qui sous-tendent le réflexe chimiosensoriel respiratoire sont une cible principale pour comprendre l’étiologie de plusieurs troubles comportementaux et physiologiques. On suppose que les réflexes chimiosensoriels perturbés jouent un rôle à la fois dans les troubles congénitaux et chez l’adulte, y compris le Syndrome de mort subite du nourrisson (SMSN), le Syndrome d’hypoventilation centrale congénitale (ESCC), les apnées centrales du sommeil, la respiration anormale dans le syndrome de Rett et le syndrome d’hypoventilation de l’obésité (Obonai et al., 1998; Ozawa et coll., 2003; Amiel et coll., 2009; Ramanantsoa et coll., 2011; Lavezzi et coll., 2013). Selon l’hypothèse d’une fausse alarme de suffocation, une activation chimiosensorielle ou une hypersensibilité inappropriée joueraient un rôle chez des sous-groupes de patients souffrant de trouble panique (Klein, 1993). Le dysfonctionnement chimiosensoriel peut également jouer un rôle dans les maladies neurodégénératives par le biais de troubles respiratoires du sommeil associés à une progression accélérée (Hakim et al., 2012; Verbraecken et McNicholas, 2013; Bahia et Pereira, 2015; Snyder et coll., 2017). Ainsi, une meilleure compréhension des réseaux chimiosensoriels du tronc cérébral fournira des indices importants sur un certain nombre de pathologies comportementales et physiologiques.

Récepteurs de synthèse pharmacogénétiques activés exclusivement par des médicaments de synthèse (DREADDs) (Armbruster et al., 2007) ont été utilisés dans un certain nombre d’études pour cartographier les populations neuronales du chimioréflexe respiratoire (réponse respiratoire à des niveaux élevés de CO2 dans le sang). La technologie DREADD en combinaison avec le déploiement génétique intersectionnel a été utilisée pour réduire au silence des populations neuronales hautement ciblées tout en observant la fonction respiratoire chez des souris conscientes et non contraintes par notre laboratoire et d’autres, évitant ainsi de nombreuses confusions des approches de cartographie de circuits antérieures (Ray et al., 2011, 2013; Brust et coll., 2014; Hennessy et coll., 2017; Sun et Ray, 2017; Sun et al., 2017). Ces études, ainsi que la plupart des autres, incluaient presque toujours des témoins de frères et sœurs non-DREADD n’exprimant aucun effet chimiosensoriel ou autre effet respiratoire, arguant que le CNO n’avait aucun effet hors cible sur la respiration chez des souris conscientes et non freinées malgré la dose élevée utilisée, 10 mg / kg. Néanmoins, il a été constaté dans plusieurs autres études que le CNO et ses produits du métabolisme du dos pouvaient avoir des effets hors cible sur le comportement et la locomotion dans une variété de tests, mais la production respiratoire n’a pas été abordée (Guettier et al., 2009; Joober, 2010; MacLaren et coll., 2016; Gomez et coll., 2017; Ilg et coll., 2018; Mahler et Aston-Jones, 2018; Manvich et coll., 2018; Padovan-Hernandez et Knackstedt, 2018). Il a également été démontré que le CNO et ses métabolites ne sont pas répartis de manière équivalente entre le système circulatoire et le cerveau (Gomez et al., 2017).

Une deuxième préoccupation, non traitée, provient du stress induit par le paradigme expérimental, y compris la détention d’animaux dans une chambre de pléthysmographie barométrique du corps entier, la manipulation, l’injection intra-péritonéale et les mesures de température rectale. Dans des études respiratoires antérieures de DREADD, des souris naïves ont été introduites dans une petite chambre (140-400 mls) et autorisées à s’acclimater 20-40 min avant l’acquisition des données (Ray et al., 2011, 2013; Brust et coll., 2014; Hennessy et coll., 2017; Sun et Ray, 2017; Sun et al., 2017). Cependant, il n’est pas clair si ce laps de temps est suffisant pour minimiser les modifications respiratoires induites par le stress qui peuvent agir comme un facteur d’interaction avec les effets de la clozapine.

Dans nos études visant à examiner le rôle du système noradrénergique (NA) dans le contrôle respiratoire, nous avons cherché à utiliser la RC bien établie::Allèle P_hM4D DREADD (Ray et al., 2011) pour tester le rôle des neurones NA dans la respiration de base et hypercapnique chez les animaux adultes non restreints en utilisant une pléthysmographie du corps entier. Parce que les neurones noradrénaline et NA sont également connus pour jouer un rôle central dans les réponses au stress (Valentino et Van Bockstaele, 2008; Chen et al., 2018), nous avons mené une série d’études pour comparer une accoutumance étendue (expositions multiples au paradigme expérimental selon lequel l’animal apprend que l’expérience n’est pas menaçante ou survivable) et une forte vs. faibles doses de CNO (1 mg/kg) avec des protocoles DREADD publiés antérieurement (Ray et al., 2011, 2013; Brust et coll., 2014; Hennessy et coll., 2017; Sun et Ray, 2017; Sun et al., 2017). Ici, nous montrons pour la première fois que des doses systémiques élevées de CNO sont capables de provoquer des effets hors cible sur une fonction respiratoire autonome chez des souris conscientes. Nous révélons également que l’effet hors cible de l’OCN sur la production respiratoire chimiosensorielle est effectivement démasqué par une accoutumance étendue et ne serait donc pas apparent dans les études de contrôle antérieures de l’OCN qui n’habituaient pas les animaux avant la mesure respiratoire, en utilisant seulement une courte période d’acclimatation avant la collecte des données. Ensemble, ces résultats suggèrent que les populations neuronales précédemment cartographiées peuvent affecter indirectement le contrôle respiratoire en jouant un rôle potentiel dans la régulation des réponses au stress. Notamment, ces données concordent avec des rapports récents suggérant que le CNO n’est pas biologiquement inerte à fortes doses par conversion métabolique en clozapine (MacLaren et al., 2016; Gomez et coll., 2017) et que des effets comportementaux hors cible peuvent se manifester non seulement par une perturbation des circuits comportementaux, mais également par des perturbations des circuits autonomes et de l’homéostasie sous-jacents.

Résultats

Le pilote DBH-Cre Marque et se limite aux Régions Noradrénergiques exprimant le TH dans le Tronc cérébral Qui Sont Inhibées par l’administration de CNO

Pour examiner l’expression et la spécificité de la lignée DBH-Cre, nous avons utilisé un schéma de sélection d’une seule recombinase (Figure 1A) dans lequel nous avons croisé le pilote à la lignée Ai9 (Madisen et al., 2010), qui exprime un tdTomato floqué. La coloration avec un anticorps de tyrosine hydroxylase (TH) a révélé que l’expression du tdTomato dans le tronc cérébral était limitée aux régions exprimant le TH, y compris les noyaux locus coeruleus, A5, A1, A2, A7, SubCV et SubCD comme prévu (Figure 1B). Pour confirmer que les neurones NA exprimant le récepteur hM4D répondaient au CNO, nous avons effectué des enregistrements sur les neurones du locus coeruleus (LC), où nous avons observé une inhibition du déclenchement des neurones lors de l’application du bain de CNO (n = 3, Figure 1C).

Perturbation médiée par CNO-hM4D des Neurones noradrénergiques chez des Souris adultes

Pour examiner le rôle des neurones NA sous la respiration de base et hypercapnique, nous avons utilisé le système DREADD inhibiteur RC: P_hM4D croisé avec le pilote DBH-Cre. En utilisant la pléthysmographie du corps entier (Ray et al., 2011), nous avons mesuré les réponses ventilatoires d’animaux adultes non retenus dans des conditions d’air ambiant (21% O2 / 79% N2) et hypercapniques (5% CO2 / 21% O2 / 74% N2) avant et après l’administration de CNO (Figure 1D). Pour répondre à la dose de CNO et au stress potentiel induit par notre conception expérimentale, les animaux ont été soumis à l’une des quatre conditions suivantes: (1) non habitée et injectée avec 10 mg / kg de CNO; (2) habituée et injectée avec 10 mg / kg de CNO; (3) non habitée et injectée avec 1 mg / kg de CNO; ou (4) habituée et injectée avec 1 mg / kg de CNO. L’habituation a consisté en un processus de 5 jours impliquant une manipulation, une sonde de température rectale, une injection de solution saline et une exposition à la chambre de pléthysmographie chaque jour pendant 30 min, tandis que les animaux naïfs n’ont été exposés qu’à une période d’acclimatation en chambre de 20 à 45 min immédiatement avant la collecte des données, comme cela a été fait dans des études antérieures (Ray et al., 2011, 2013; Brust et coll., 2014; Hennessy et coll., 2017; Sun et Ray, 2017; Sun et al., 2017). Les paramètres respiratoires mesurés comprenaient la fréquence respiratoire RR, le volume courant (VT), la ventilation minute (VE), la consommation d’oxygène (VO2), la ventilation minute normalisée à la consommation d’oxygène (VE / VO2), la fréquence d’apnée, la fréquence des soupirs et les coefficients de variation de l’intervalle et de l’amplitude intercalaires (instabilité périodique et volumique). Comme témoin supplémentaire, nous avons également comparé des animaux sauvages habitués et non habités injectés avec une solution saline.

La perturbation CNO-hM4D des neurones DBH-Cre Entraîne un Déficit hypercapnique

Dans trois des conditions, DBH-Cre; RC::Les animaux P_hM4D ont montré une réduction de VE et VE / VO2 après l’administration de CNO, tandis que les témoins frères n’ont montré aucune différence dans les valeurs pré et post-CNO. Les animaux non habités injectés avec 10 mg / kg de CNO ont montré une réduction significative de la RR (-12,17%, p = 0,034) et de la VT (-30,87%, p = 0,0016), entraînant une réduction de l’VE (-38,64%, p = 0,0031) et une légère réduction de la VO2 (-14,25%, p = 0,042) (Figure 2). La réduction de VE était supérieure à la diminution de VO2, entraînant une réduction globale de VE/VO2 (-26,89%, p = 0,0095). Les animaux non habités injectés avec 1 mg / kg de CNO ont montré une tendance à une réduction de la RR (-12,88 %, p = 0,066) et à une réduction significative de la VT (-16,52%, p = 0,00085) et de l’VE (-28,08%, p = 0,0070), conduisant à une réduction globale de la VE / VO2 (-22,23%, p = 0,016) (Figure 3). Enfin, les animaux habitués injectés avec 1 mg / kg de CNO ont montré une réduction du RR (-10,77%, p = 0,074), une tendance à une diminution de l’VE (-25,07%, p = 0,074) et une réduction globale de l’VE / VO2 (-23,70%, p = 0,024) (Figure 4). Aucun changement significatif de la fréquence de l’apnée, de la fréquence des soupirs, de l’instabilité périodique ou volumique ou de la température n’a été observé dans aucune cohorte.

Les Témoins Frères Habitués Injectés Avec 10 mg/kg De CNO Ont Montré un Déficit Ventilatoire Hypercapnique

Dans les deux DBH-Cre; RC::P_hM4D et chez les animaux témoins habitués à recevoir 10 mg /kg de CNO, nous avons noté une réduction significative de VE /VO2 (p = 0,0235) médiée par des diminutions de RR (p = 0,00036) et de VE (p = 0,037) (Figure 5). Cependant, contrairement aux autres cohortes, il n’y avait pas de différence entre DBH-Cre; RC::P_hM4D et les animaux témoins frères dans ces paramètres: RR (-12,72 vs -10,22%, p = 0,6268), VE (-24,88 vs -23,94%, p = 0,4150), ou VE/VO2 (-15,4 vs -22,55%, p = 0,4643 ).

Les animaux sauvages habitués et non Habités injectés avec une solution Saline N’ont Montré Aucun Changement Présaline et Postsaline

Bien qu’aucun phénotype n’ait été observé chez les témoins injectés avec 1 mg / kg de CNO, nous avons abordé la possibilité que l’injection elle-même provoque le phénotype observé chez les témoins injectés avec 10 mg / kg de CNO en testant des animaux sauvages habitués et non habités injectés avec une solution saline (Figure 6). Dans les cohortes habituées et non habitées, les animaux n’ont montré aucune différence dans les paramètres respiratoires administration présaline et postsaline. Aucun changement significatif de la fréquence de l’apnée, de la fréquence des soupirs, de l’instabilité périodique ou volumique ou de la température n’a été observé.

Les rapports de concentration Clozapine / CNO Sont plus élevés dans le Cerveau que dans le Sérum

Pour déterminer la biodisponibilité du CNO et de la clozapine, nous avons mesuré leurs concentrations dans le sérum et le cerveau par spectrométrie de masse. Trente minutes après une injection intrapéritonéale de CNO chez des souris, l’abondance relative de CNO est plus faible que celle de son métabolite arrière clozapine dans le sérum et le cerveau pour toutes les doses testées, soit 0,1 mg/kg (sérum p = 0,0054, cerveau p = 0,0001) (Figure 7A), 1 mg/kg (sérum p > 0,05, cerveau p = 0,0197) (Figure 7B) et 10 mg/kg (sérum p = 0,0001). 0,0036, cerveau p = 0.0005) (figure 7C). Lorsque les rapports globaux clozapine / CNO ont été analysés, ils étaient toujours supérieurs à zéro et étaient plus élevés dans le cerveau que dans le sérum (véhicule p > 0,5, 0,1 mg / kg p > 0,5, 1 mg / kg p = 0,0018, 10 mg / kg p = 0,0160) (figure 7D).

Discussion

L’objectif initial de cette étude était d’examiner le rôle des neurones DBH-Cre dans la physiologie respiratoire après une perturbation aiguë chez des animaux adultes non restreints et conscients. Parce que les neurones noradrénaline et NA jouent un rôle bien documenté dans les comportements de stress (Valentino et Van Bockstaele, 2008; Chen et al., 2018), nous avons également cherché à examiner si l’accoutumance à un protocole physiologique probablement stressant aurait un effet sur les phénotypes respiratoires précédemment observés. Dans le protocole DREADD de pléthysmographie du corps entier utilisé dans notre laboratoire et dans d’autres, les animaux sont manipulés, sondés par voie rectale pour la température, exposés à un nouvel environnement (la chambre de pléthysmographie) et injectés par voie intrapéritonéale. Des études antérieures ont montré que la manipulation et l’accoutumance à l’injection et à d’autres procédures « de routine » peuvent modifier les paramètres comportementaux et physiologiques, y compris la respiration (Misslin et al., 1982; Andrews et File, 1993; Lapin, 1995; Ryabinin et coll., 1999). D’autres facteurs de stress appliqués modifient également la respiration dans des conditions ventilatoires de base et hypercapniques (Isom et Elshowihy, 1982; Kinkead et al., 2001).

Dans nos études utilisant des doses élevées de CNO, nous avons constaté que l’inhibition médiée par le hM4D des neurones NA définis par le DBH-Cre entraînait une réduction du réflexe hypercapnique dans VE / VO2 dans quatre cohortes expérimentales définies, avec une réduction de la RR, de la VT et de l’VE, soutenant des études antérieures (Biancardi et al., 2008; Viemari, 2008; Gargaglioni et coll., 2010). Cependant, des témoins frères habitués recevant une dose de 10 mg / kg de CNO utilisée dans des études respiratoires antérieures ont montré un déficit ventilatoire dans des conditions hypercapniques de la même ampleur que celui observé chez les animaux DBH-Cre; RC::P_hM4D. Aucun autre groupe témoin frère n’a montré ce phénotype, y compris la cohorte habituée qui n’a reçu que (1 mg / kg de CNO) ou une solution saline. Ces résultats suggèrent que des doses plus élevées de CNO (10 mg / kg) ont un effet sur la réponse hypercapnique qui est démasquée après une accoutumance étendue tout en réduisant vraisemblablement les niveaux de stress chez l’animal, et que des doses plus faibles de CNO n’ont pas d’effet sur le contrôle respiratoire chez les animaux habitués. Ces résultats sont également en accord avec les travaux de Korsak et coll. l’oms a démontré qu’une faible dose d’OCN (2 mg/kg) ne produit pas d’effets hors cible sur la capacité de travail lors d’un test d’exercice qui comprenait un entraînement préalable (Korsak et al., 2018) et Fleury Curado et coll. l’OMS n’a montré aucun effet spécifique de la CNO à faible dose (1 mg/ kg) sur le débit respiratoire (Fleury Curado et al., 2018).

Les rapports accrus des taux de clozapine et de CNO dans le sérum et dans le cerveau (figure 7) sont en accord avec des études récentes qui suggèrent que le CNO est facilement métabolisé en clozapine et montre une plus grande perméabilité cérébrale par rapport au CNO chez la souris et ailleurs (Jann et al., 1994; Chang et coll., 1998; Guettier et coll., 2009; Gomez et coll., 2017; Raper et coll., 2017). Cependant, il n’est pas clair si les effets hors cible observés sont dus au CNO ou à la clozapine. Comme nos mesures hypercapniques ont eu lieu < 30 min après l’application de CNO, il est probable que les effets respiratoires hors cible sont médiés par la clozapine. Nos résultats (figure 7) montrent des niveaux relatifs élevés de clozapine dans le cerveau, bien que le CNO ne soit pas complètement absent. Cependant, Huckstepp et ses collègues ont utilisé l’application directe de CNO sur la moelle ventrale chez des rats anesthésiés pour démontrer que l’application de CNO n’a qu’un faible effet, augmentant la fréquence et diminuant la durée expiratoire, mais laissant la TV inchangée, sans effet clair observé pendant l’hypercapnie (Huckstepp et al., 2015). Compte tenu de l’application directe chez les rats anesthésiés et du laps de temps des expériences, il est probable que les petits effets hors cible observés ont été médiés par CNO et non par la clozapine.

Le métabolite arrière clozapine est un médicament sédatif et antipsychotique couramment utilisé dans la schizophrénie avec de nombreuses cibles endogènes, y compris des actions antagonistes de faible affinité au niveau des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D4, des récepteurs sérotoninergiques 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT6 et 5-HT7, des récepteurs histaminiques H1 et des récepteurs adrénergiques α1 et α2, entre autres (Fitton et Heel, 1990; Ashby et Wang, 1996). Les effets hors cible observés ici peuvent résulter de mécanismes et de cibles distincts ou combinés. La clozapine peut affecter la respiration en tant que sédatif. Une étude antérieure a montré une réduction de la RR et de la VT sous 5 et 10% de CO2 pendant les états de sommeil à ondes lentes et de sommeil à mouvements oculaires rapides par rapport à l’état d’éveil silencieux chez la souris (Nakamura et al., 2007). Alternativement, l’inhibition des neurones exprimant les DREADD ciblés peut entraîner un effet antianxiogène ou anxiolytique similaire à notre protocole d’accoutumance pour révéler des effets chimiosensoriels hors cible médiés par la CNO / clozapine. Les deux explications sont étayées par plusieurs études ayant montré que le CO2 jouait un rôle dans les réponses de peur innées et apprises et les comportements liés à l’anxiété (Ziemann et al., 2009; Feinstein et coll., 2013; Taugher et coll., 2014; Dlouhy et coll., 2015; Winter et coll., 2017). Ainsi, les neurones ciblés dans certaines de ces études peuvent en effet jouer un rôle dans la conduite des réponses comportementales anxiogènes plutôt que des réflexes chimiosensoriels physiologiques, car les systèmes catécholaminergiques et sérotoninergiques sont impliqués dans les comportements de peur / anxiété et l’homéostasie chimiosensorielle (Brust et al., 2014; Hennessy et coll., 2017).

Inversement, les phénotypes chimiosensoriels observés avec des niveaux élevés de CNO peuvent être authentiques, car nous avons pu récapituler le déficit hypercapnique médié par le NA aux doses de CNO, une magnitude d’ordre plus faible chez les souris habituées, tandis que les groupes témoins n’ont montré aucun effet CNO. Cependant, les comparaisons complètes entre les études antérieures sont difficiles en raison de l’absence, dans certains cas, de données sur la VO2, la VT, la RR et la VE/VO2 rapportées. Par exemple, les changements de la température corporelle ou du taux métabolique peuvent également influer de plusieurs façons sur la production respiratoire et chimiosensorielle, et que les températures de la chambre de pléthysmographie étaient très différentes dans certains cas (34 contre 30 ° C dans nos études), affectant la plage dynamique de la composante barométrique de la forme d’onde et donc le volume courant. Notamment, nous n’avons constaté aucun changement appréciable des caractéristiques de la forme d’onde respiratoire dans aucune de nos affections ni d’arrêt cardio-respiratoire aigu observé lors de nos études antérieures sur les rhombomères entiers à forte dose (Sun et al., 2017).

Nos résultats montrent pour la première fois que le CNO a un effet inattendu sur le réflexe chimiosensoriel hypercapnique qui est démasqué par une accoutumance étendue. Fait important, malgré des niveaux élevés, un effet hors cible du CNO avait déjà été exclu en raison de l’absence de phénotype chez les témoins frères, mais que nous montrons devient clair lors de l’accoutumance. Nous proposons une caractérisation hors cible de CNO dans le système de modèle murin pour compléter les études chez le rat et les primates non humains. Les résultats ici soulèvent la possibilité que des effets supplémentaires médiés par des CNO, hors cible, sur les circuits étudiés ou sur les circuits autonomes ou homéostatiques puissent exister mais peuvent être masqués dans d’autres expériences contrôlées. Fait important, ces données révèlent que les chercheurs devraient s’efforcer d’utiliser les doses minimales du ligand activateur possibles en combinaison avec des niveaux élevés d’accoutumance, et que les contrôles appropriés doivent être inclus dans les manipulations génétiques chimiques pour apprécier et interpréter pleinement les données expérimentales.

Matériaux et méthodes

Approbation éthique

Les études ont été approuvées par le Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee en vertu du protocole AN-6171.

Sélection, Antécédents génétiques et Maintien de souris

Nous avons maintenu des colonies de toutes nos souches de souris hétérozygotes par rétrocroisement vers des souris C57BL/6J et des souches homozygotes par croisements frères. Pour les expériences d’histologie, le DBH-Cremice a été accouplé avec la souris homozygote Ai9 (Madisen et al., 2010) (JAX 007909). Pour les expériences de pléthysmographie, des souris DBH-Cre ont été accouplées avec RC::P_hM4D homozygote (Ray et al., 2011) pour dériver des animaux, chez lesquels toutes les souris portaient l’allèle RC::P_hM4D. Les animaux frères qui n’héritaient pas de l’allèle Cre ont été utilisés comme animaux témoins pour la progéniture positive Cre. Les amorces spécifiques Rosa26 pour les souris Ai9, RC::P_hM4D et RC::ePe étaient de 5′-GCACTTGCTCTCCCAAAGTC, 5′-GGGCGTACTTGGCATATGAT et 5′-CTTTAAGCCTGCCAGAAGA et donnent une bande de 495 pb (ciblée) et 330 pb (poids). Les amorces spécifiques au Cre pour tous les conducteurs de Cre rhombomères étaient de 5′-ATCGCCATCTTCCAGGCGCACCATTGCCC et de 5′-GCATTTCTGGGGATTGCTTA et donnaient une bande de 550 pb si elle était positive. Pour les expériences LC-MS, des souris C57BL / 6J ont été obtenues du Centre de médecine comparée (CCM) du Baylor College of Medicine.

Histologie

DBH-Cre de quatre à huit semaines; Des souris adultes Ai9 ont été perfusées par voie transcardiale avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M, puis avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans le PBS. Les cerveaux ont été disséqués et déposés pendant 2 h dans du PFA à 4% avant un rinçage au PBS et une équilibration dans du saccharose à 20% dans du PBS. Les cerveaux ont ensuite été sectionnés en sections de 30 µm, montés sur des lames et marqués avec des anticorps immunofluorescents. Nous avons coloré pendant une nuit avec un anticorps anti-tyrosine hydroxylase pour identifier les neurones catécholaminergiques (1: 1 000, Millipore AB152) suivi de 2 h avec un secondaire Cy3 anti-lapin d’âne (1: 500, Jackson 711-165-152) dans du Triton-X à 0,1% dans du PBS (PBST) avec du sérum d’âne à 5%. Les images ont été collectées sur un microscope épifluorescent vertical Zeiss.

Électrophysiologie

Des tranches de cerveau horizontales contenant le locus coeruleus (300 µm) ont été découpées avec un vibratome (Leica VT 1000S, Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) de souris adultes DBH-Cre; RR2P; RC::ePe (~ 1 mois) dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) à 4 °C. Les tranches ont été immergées dans une chambre perfusée avec de l’ACSF oxygéné (95% O2 et 5% CO2) contenant en mM : 124 NaCl, 2,0 KCl, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 et 10 glucose (2-3 ml/min). Des enregistrements de cellules entières ont été effectués à 30°C en utilisant des techniques conventionnelles de patch-clamp et un amplificateur MultiClamp 700B (Molecular Devices, Union City, CA). Les neurones positifs au GFP du locus coeruleus ont été identifiés visuellement et ensuite imagés par vidéo de contraste d’interférence différentielle infrarouge sur la scène d’un microscope vertical (Axioskope FS2, Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne). Les pipettes Patch (résistances 4-6 MU) ont été remplies de (en mM): 110 K-gluconate, 10 KCI, 10 HEPES, 10 Na2-phosphocréatine, 2 Mg3-ATP et 0,2 Na3-GTP; Le pH a été ajusté à 7,2 et l’osmolarité à 300 mOsm. Le potentiel de détention était de -70 mV. CNO a été appliqué au bain.

Pléthysmographie

La pléthysmographie sur des souris conscientes et non retenues a été réalisée comme décrit sur des animaux adultes âgés de 6 à 12 semaines (Ray et al., 2011). Les souris habituées ont été soumises à un protocole d’accoutumance de 5 jours comprenant chaque jour plusieurs minutes de manipulation, une prise de température par sonde rectale, une injection de solution saline intrapéritonéale et 30 minutes dans la chambre de pléthysmographie. Les souris ont ensuite été testées dans la semaine 1 suivant le dernier jour d’accoutumance. Les souris non habitées n’ont pas été exposées à la manipulation ou à la chambre de pléthysmographie. Toutes les souris étaient naïves envers CNO et utilisées une seule fois.

Le jour du test, des souris ont été prises dans leur cage d’origine, pesées et la température rectale a été prise. Les animaux ont ensuite été placés dans une chambre de pléthysmographie à température contrôlée (enveloppe d’eau à 30 ° C) et autorisés à s’acclimater pendant au moins 20 min dans des conditions d’air ambiant (21% O2 / 79% N2). Après acclimatation et mesure sous air ambiant, le gaz de chambre a été commuté sur un mélange hypercapnique de 5% CO2 / 21% O2 / 74% N2 pendant 20 min. Le gaz de chambre a ensuite été remis à l’air ambiant pendant 20 min. Les souris ont été brièvement enlevées pour la mesure de la température rectale et l’injection intra-péritonéale de CNO (National Institute of Mental Health Chemical Synthesis and Drug Supply Program) dissous dans une solution saline (1 ou 0,1 mg / ml) pour une concentration efficace de 10 ou 1 mg / kg, respectivement. L’animal a été renvoyé dans la chambre pendant encore 20 minutes d’air ambiant, 20 minutes d’hypercapnie et 20 minutes d’air ambiant. L’animal a ensuite été retiré de la chambre et la température rectale a été prise immédiatement après la fin de l’expérience.

Chromatographie en phase liquide – Spectrométrie de masse

Vingt-quatre souris de type sauvage, divisées uniformément par sexe, ont été pesées et traitées avec 10 mg / kg de CNO, 1 mg / kg de CNO, 0,1 mg / kg de CNO ou véhicule. Trente minutes après l’injection, des échantillons de sang ont été prélevés par ponction cardiaque et placés dans des microtainers BD. Les échantillons ont été centrifugés à 4°C à 13 500 tr/min dans une centrifugeuse de paillasse et des surnageants ont été collectés. Le sérum et le cerveau ont été maintenus à -20°C jusqu’à l’extraction.

Solvants de qualité HPLC l’eau, l’acétonitrile chloroforme, le méthanol et l’acide formique de qualité spectrométrie de masse ont été obtenus à partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Une solution d’étalonnage contenant plusieurs calibres dans une solution d’acétonitrile, d’acide trifluoracétique et d’eau a été achetée à Agilent Technologies (Santa Cruz, CA). Les métabolites et les étalons internes, y compris l’acide N-acétyl-aspartique – d3, le tryptophane-15N2, l’acide glutamique-d5, la thymine-d4, l’acide gibbérellique, la trans-zéatine, l’acide jasmonique, l’acide 15N anthranilique et la testostérone-d3, ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Le Microtainer R SST TM a été obtenu auprès de Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey).

L’extraction consistait en 750 µl de méthanol: eau glacée (4: 1) contenant des étalons internes dopés de 20 µl qui ont été ajoutés à chaque échantillon de cerveau (50 mg) et aux contrôles de qualité, puis ont été homogénéisés pendant 1 min chacun. Ensuite, 750 µl d’acétonitrile à 100% contenant des étalons internes dopés à 20 µl ont été ajoutés à l’échantillon de lavage (100 µl) et aux contrôles de qualité, puis soniqués pendant 5 min. Tous les échantillons ont été centrifugés à 5000 tr/min pendant 10 min à 4°C. Le surnageant résultant a été collecté et 20 µl ont été injectés dans LC-MS.

Tous les échantillons ont été analysés à l’aide de 6 490 spectromètres de masse triples quadripolaires (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) couplés au système HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) par surveillance de réactions multiples (MRM). Environ 8 à 11 points de données ont été acquis par métabolite détecté. Les métabolites détectés étaient la clozapine, le CNO et la norclozapine (N-desméthyl clozapine). Le mode positif ESI a été utilisé dans la méthode. La colonne HPLC était la colonne ACQUITUPLC C18 (100 Å, 1,8 µm et 2,1 mm × 100 mm. Milford, MA, USA) avec un débit de 0,5 ml/min.

Collecte et analyse des données

Pléthysmographie

Les variations de pression de Pléthysmographie ont été mesurées à l’aide d’un transducteur de pression différentielle Validyne DP45 et d’une chambre de référence et d’un démodulateur de porteuse CD15 et enregistrées avec LabChartPro en temps réel. Les formes d’onde ont été analysées hors ligne à l’aide de LabChartPro et d’un code MATLAB écrit sur mesure pour déterminer la fréquence respiratoire (RR), le volume courant (VT) (Ray et al., 2011), ventilation minute (VE) et analyse des modèles. Les formes d’ondes respiratoires ont été collectées hors ligne pendant les périodes où l’animal était au repos, et les lectures étaient exemptes d’artefacts de mouvement. Un minimum de 1 min de données cumulatives compilées à partir de traces d’au moins 10 s de long à partir des 10 dernières minutes d’une condition expérimentale donnée ont été analysées. La consommation d’O2 a été déterminée en comparant la composition du gaz entre l’étalonnage dans une chambre vide et la respiration vivante à l’aide d’un capteur et d’un analyseur d’oxygène AEI. La température de la chambre a été constamment surveillée à l’aide d’un MicroThermo 2 et d’une sonde ThermoWorks et a été enregistrée avec LabChartPro en temps réel.

Les mesures de Poincaré et la fréquence des soupirs et des apnées ont été déterminées en utilisant 1 min de traces de mouvement de chaque condition respiratoire. Les soupirs étaient définis comme une respiration dont l’amplitude était au moins deux fois plus grande que la respiration moyenne. Les apnées ont été définies comme un intervalle entre les respirations (IBI) au moins deux fois plus grand que l’IBI moyen. Le coefficient de variation (CV) de l’IBI et de l’amplitude a également été calculé à partir de la même compilation de traces de 1 min de chaque condition respiratoire (erreur type IBI ou amplitude / IBI ou amplitude moyenne).

Statistiques

Pléthysmographie

Les résultats (RR, VT, VE, VO2, VE/VO2, nombre d’apnées et de soupirs, et CV d’IBI et d’amplitude) pour l’air ambiant et les données hypercapniques ont été comparés entre les cohortes DBH-Cre; RC::P_hM4D et les témoins frères en utilisant un modèle de régression linéaire à effets mixtes avec type d’animal (expérimental contre le contrôle) et l’administration de CNO (avant et après l’injection) en tant qu’effets fixes et l’identification de l’animal en tant qu’effet aléatoire. Les données de température ont été comparées à l’aide d’un modèle de régression linéaire à effets mixtes avec le type d’animal (expérimental vs témoin) comme effet fixe. Un p < 0,05 a été utilisé pour indiquer la signification statistique, et les points de données individuels, la moyenne et l’erreur type de la moyenne sont indiqués sur toutes les cartes.

Chromatographie liquide – Spectrométrie de masse

La surface obtenue sous le pic pour chaque échantillon a été normalisée par le contrôle interne puis au véhicule avant analyse statistique. Un test t non apparié a été utilisé pour comparer l’abondance relative de clozapine et de CNO dans chaque tissu par groupe de concentration.

Déclaration d’éthique

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine. Les expériences étaient conformes aux normes nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire établies par l’Association pour l’Évaluation et l’accréditation des Soins aux Animaux de laboratoire.

Contributions des auteurs

JS, FS-M, MC-M et RR ont conçu et conçu les expériences. JS, FS-M et PZ ont effectué les expériences et contribué à l’analyse des données. JS, FS-M, VM, MC-M et RR ont écrit le document.

Financement

Cette étude a été soutenue par les subventions R01HL130249 et R01HL130249-S1 du National Heart, Lung, and Blood Institute; March of Dimes Basil O’Connor Award; et le McNair Medical Institute.

Déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de relations commerciales ou financières pouvant être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Nous remercions les Drs Shaila K. Mani et Benjamin Arenkiel pour leurs discussions utiles. Nous remercions également le centre central de protéomique du Baylor College of Medicine pour l’exécution de la chromatographie liquide – Spectrométrie de masse.