Délétions du chromosome 20 dans les tumeurs malignes myéloïdes: réduction de la région délétée commune, génération d’un contig PAC/ BAC et identification des gènes candidats

Baguage et peinture des chromosomes

Préparations chromosomiques de la moelle osseuse de 107 cas avec myéloïde les troubles ont été analysés par bandes G pour évaluer la taille de la délétion du bras long du chromosome 20. Comme décrit précédemment (Nacheva et al., 1995b), deux catégories de délétions du 20q ont été identifiées – les grandes suppressions (59 cas), entraînant la perte des deux bandes sombres de Giemsa à partir du 20q (Figure 1a, en haut) et les petites suppressions (48 cas) dans lesquelles une bande sombre de Giemsa reste (Figure 1a, en bas). Nous nous sommes ensuite concentrés sur ce dernier groupe de patients (résumé dans le tableau 1).

Une analyse de POISSON à l’aide d’une peinture du chromosome 20 a été réalisée sur les 48 échantillons avec une petite délétion de 20q. Dans six cas, la « suppression 20q » s’est révélée être due à des réarrangements cryptiques. Dans un cas, l’application simultanée de peintures pour les chromosomes 15 et 20 a permis d’identifier un marqueur dérivé du chromosome 15 mais deux homologues normaux du chromosome 20 (figure 1b). Dans les cinq autres cas, la peinture chromosomique a démontré la présence d’une translocation déséquilibrée avec un point d’arrêt récurrent à 20q11.2 et des partenaires chromosomiques variables (figure 1c). Dans les cinq cas, le marqueur der(20) était le seul produit de translocation conservé dans le génome. De plus, la cartographie des POISSONS a montré que le point d’arrêt sur le chromosome 20 s’était produit dans une région proximale de D20S107 et a confirmé la perte du reste du bras long du chromosome 20 (données non présentées). Ces résultats seront présentés en détail ailleurs.

Dans les 42 autres cas, la peinture chromosomique était compatible avec une petite délétion interstitielle de 20q (figure 1d). La majorité (33 cas) portait une délétion de 20q comme seule anomalie caryotypique. Dans les neuf autres cas, la délétion 20q s’est accompagnée de diverses aberrations chromosomiques supplémentaires (tableau 1). Les 42 cas avec une petite délétion de 20q ont été soumis à une cartographie plus poussée des POISSONS avec des sondes spécifiques au locus.

Analyse cartographique des délétions

Les 42 patients présentant de petites délétions de 20q ont été analysés par FISH à l’aide d’un PAC centromère (CEP20), d’un PAC s’hybridant à une région distale de 20q (LSI 20q13) et d’un PAC s’hybridant au sein du CDR (LSI D20S108). Chez chaque patient, des signaux provenant à la fois du LSI 20q13 et du CEP20 mais pas du LSI D20S108 ont été observés sur le chromosome 20 délété confirmant la présence d’une délétion interstitielle (résumé à la figure 3). Les métaphases de chaque patient ont ensuite été hybridées avec la cartographie PACs aux limites des CDRS MPD et MDS/AML connus- D20S107 qui se trouve à la limite proximale du CDRs et D20S176 qui se trouve télomère de la limite distale du CDRs (Bench et al., 1998a; Wang et coll., 1998).

Chez 37 patients (25 avec SMD ou LAM, 12 avec MPD), les deux sondes n’ont pas produit de signal sur le chromosome 20 délété démontrant la présence de délétions étendues qui n’aideraient pas à affiner les CDR. Ces échantillons n’ont pas été étudiés plus avant. Cependant, chez quatre patients atteints de SMD (DB53, MH40, DB122 et DB214) et un avec MPD (JH41), l’une des deux sondes a donné un signal sur le chromosome 20 délété et ces échantillons ont été analysés plus en détail.

En plus des 42 patients avec de petites délétions de 20q qui ont été analysés par FISH à l’aide de sondes spécifiques au locus, six autres patients avec une délétion de 20q (quatre avec MDS, deux avec MPD), dont les métaphases de la moelle osseuse n’étaient pas disponibles, ont été analysés par PCR microsatellite. L’ADN des granulocytes et des cellules T purifiés a été analysé à l’aide d’un large panel de marqueurs polymorphes couvrant les CDR MPD et MDS/AML (tableau 2). Les quatre patients atteints de SMD présentaient des suppressions dépassant les limites du CDR publié. Cependant, chez l’un des deux patients atteints de MPD (RB42), la limite centromérique de la délétion a considérablement réduit le CDR de MPD (Figure 2, tableau 2).

Réduction de la région délétère commune chez les patients atteints de SMD /LMA

L’analyse FISH préliminaire a identifié quatre patients atteints de SMD avec des délétions qui empiétaient sur le CDR du SMD/LMA. Dans chaque cas, la suppression 20q était présente dans toutes les métaphases examinées. Dans trois cas (DB53, DB214 et MH40), la délétion 20q était présente comme une seule anomalie. Chez le patient DB122, la délétion 20q était la seule anomalie originale avec deux sous-clones contenant la trisomie 21 ou la trisomie 8 et la trisomie 21 en plus de la délétion 20q également présents. Ces quatre cas ont été étudiés à l’aide de sondes spécifiques à des locus supplémentaires afin de déterminer les limites de délétion.

La limite proximale du CDR MDS / AML a été affinée par les patients DB53, MH40 et DB122. La limite proximale de la suppression dans DB53 se situait entre D20S107 et WI-11538 (Figure 3), soit une distance d’environ 400 ko. Pour le patient MH40, un PAC contenant WI-11538 (dJ357E14) a systématiquement donné lieu à un signal réduit compatible avec la présence du point d’arrêt de délétion proximale au sein de ce PAC (Figure 3). De plus, la limite proximale de la délétion chez le patient DB122 se situait entre sts-R52161 et stSG25449 (Figure 1e, f), à une distance inférieure à 200 kb (Figures 3 et 4). Cela représente un grand raffinement de la limite proximale du CDR MDS / AML.

Le patient DB214 a permis un raffinement considérable de la limite distale du SDM / LMA CDR. La limite distale de cette suppression se situait entre WI-12515 et stSG40369 (Figure 1g, h), soit une distance inférieure à 100 ko (Figures 3 et 4).

Ces données réduisent donc considérablement le CDR MDS/AML à une région comprise entre le PAC dJ620E11, qui contient sts-R52161, et le PAC dJ196H17 qui contient WI-12515 (Figures 3 et 4). Le clone bactérien contig présenté ci-dessous démontre que la taille physique de cette région est d’environ 2,6 Mb.

Réduction de la région délétée commune chez les patients atteints de MPD

Chez le patient JH41 (diagnostic PV), la limite proximale de la délétion avait précédemment été déterminée par PCR par microsatellite pour se situer entre D20S438 et D20S107 (Bench et al., 1998a). Le PAC dJ155H19, qui contient le D20S107 (Figure 4), a systématiquement donné lieu à un signal réduit compatible avec la présence du point d’arrêt de délétion proximale au sein de ce PAC (Figure 3).

Les granulocytes et les cellules T de deux patients supplémentaires ont été étudiés par PCR microsatellitaire (tableau 2). Un patient atteint de PV (RB42) a démontré une rétention d’hétérozygotie à J20S108 mais une perte à J20S858 (Figure 2, tableau 2). Le point d’arrêt proximal de la délétion chez ce patient se situait entre D20S108 et D20S858, soit une distance inférieure à 200 kb (Figures 3 et 4).

Ces données réduisent considérablement le CDR MPD qui est maintenant flanqué de D20S108 (cette étude) et D20S481 (Wang et al., 1998). La taille physique estimée de cette région est de 2.7 Mo, en utilisant les données du clone bactérien contig présenté ci-dessous. La région de chevauchement entre les nouveaux CDR MDS/AML et MPD a défini un CDR combiné  » myéloïde  » de 1,7 Mo (figure 3).

Un contig de clone bactérien couvrant les régions délétées communes MPD et MDS/AML

Nous avions précédemment construit un contig YAC de 11 Mo de cette région du chromosome 20 (Bench et al., 1998a). Afin de produire une carte physique plus détaillée, nous avons maintenant construit une carte contiguë basée sur PAC et BAC. Des clones PAC et BAC ont été identifiés par hybridation de STSS à des banques génomiques (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et coll., 1998). Les clones ont été chevauchés à l’aide d’empreintes digitales de restriction (Gregory et al., 1997) et la cartographie de contenu STS permettant de regrouper les clones en contigs. Pour combler les contigs, de nouvelles sondes STSs et d’ADN, développées à partir des extrémités des contigs, ont été utilisées pour un criblage ultérieur de la bibliothèque. Les nouveaux PACS et BAC ont ensuite été fusionnés en contigs de la même manière jusqu’à ce qu’une carte contiguë soit produite.

Le clone bactérien contig contient un total de 456 clones bactériens dont 376 sont des PACs et 80 sont des BAC. Il s’étend de D20S607 à SEMG1 et comprend 202 marqueurs d’ADN dont 185 sont des STSs et 17 sont des sondes d’ADN. La taille du contig était basée sur une moyenne de 3,5 ko par bande d’empreintes digitales HindIII (P Deloukas (2000), résultats non publiés). La taille estimée du contig a été calculée à 5 Mo en multipliant le nombre total de bandes d’empreintes digitales différentes dans le contig par 3,5. Une représentation de la carte illustrant le tracé minimal du carrelage et les PACS qui ont été utilisés pour les expériences sur les POISSONS est illustrée à la figure 4. Une version complète de la carte peut être trouvée à http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_-20ctg125 & class=Map.

Identification des séquences exprimées

Quarante-trois EST uniques ont été localisées entre D20S607 et stSG34035 inclusivement. Parmi celles-ci, 34 EST ont été cartographiées par hybridation à une  » polygrille  » de PACs et de BAC ou par PCR de colonies bactériennes contenant des PACs ou des BAC (Figure 4). Neuf EST supplémentaires, précédemment cartographiées dans cette région du chromosome 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et coll., 1998) ont été positionnés sur le contig par alignement de SOUFFLE de la séquence EST avec la séquence génomique PAC ou BAC disponible.

Afin d’identifier de nouvelles séquences exprimées putatives, 23 clones PAC de la voie de pavage minimale ont été partiellement ou complètement séquencés. La séquence génomique de ces clones a été analysée à l’aide du programme NIX (Williams et al., 1998) qui permet l’observation simultanée d’un certain nombre d’outils d’identification de gènes, notamment GRAIL, GENSCAN et BLAST. Huit EST et gènes non cartographiés précédemment ont été identifiés (tableau 3). Six d’entre eux se trouvaient dans le CDR du MPD et sept dans le CDR du MDS. Des preuves ont été obtenues que six de ces huit séquences exprimées putatives représentaient des gènes transcrits de bonne foi, plutôt que des pseudogènes traités ou des contaminants de l’ADN génomique dans la base de données EST. KCNS1 est un gène qui code pour une sous-unité de canal à chaîne de tension potassique. Les EST AA053206/AA053121 ont ensuite été trouvés dérivés du gène SGK2 (Kobayashi et al., 1999). L’alignement de la séquence d’ADNc sur la séquence génomique a démontré une structure exon/intron pour trois des six EST restantes (AI312497, AA568401 et AA910031) avec la séquence de consensus du site d’épissure présente à toutes les limites exon/intron. Dans ces trois cas, la présence de chaque exon a été confirmée par des programmes de prédiction d’exons tels que GRAIL. L’existence d’un exon a également été prédite par GRAIL, GENSCAN et Genefinder dans la région de PAC dJ1108D11 qui s’alignait sur EST AA993161, ce qui implique que cet EST représentait également un gène transcrit.

L’analyse des séquences de PACs à partir du chemin de pavage minimal nous a également permis d’établir la structure génomique de gènes connus et nouveaux dans cette région. L’alignement de l’ADNc RPTPrho sur les PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 et dJ269M15 a démontré que ce gène couvre au moins 1,2 Mo. Le PAC dJ138B7 contenait deux gènes (h-l(3)mbt et SGK2) ainsi que la partie 5′ du gène correspondant à SHGC-36858. En particulier, le gène h-l(3) mbt contient 20 exons avec deux exons finaux alternatifs putatifs. L’analyse de dJ644L1 a démontré que le gène MafB humain est constitué d’un seul exon. L’analyse de la séquence terminée a également été effectuée par le Centre Sanger (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) et cela peut être visualisé à http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20 & class=GenomeSequence.

Ces données établissent la présence de six gènes et de 14 ESTS non qiues supplémentaires dans le nouveau CDR MDS/AML et un total de 14 gènes avec 23 ESTS uniques dans le nouveau CDR MPD (tableau 3). Six gènes et 10 EST uniques sont présents dans la région de chevauchement entre les deux CDR.

Profilage de l’expression

On pense que les troubles myéloprolifératifs, les syndromes myélodysplasiques et la leucémie myéloïde aiguë résultent de la transformation d’une cellule multipotente dans le compartiment des cellules souches hématopoïétiques (Bonnet et Dick, 1997; Kralovics et Prchal, 1998). De plus, il a été précédemment montré que la délétion 20q peut survenir dans une cellule progénitrice capable de donner naissance à la fois à des cellules myéloïdes et à des cellules B (White et al., 1994). Ces considérations suggèrent que le ou les gènes du chromosome 20q inactivés dans ces maladies sont susceptibles d’être exprimés dans des cellules progénitrices hématopoïétiques normales. Nous avons donc déterminé laquelle des séquences transcrites était exprimée dans la moelle osseuse et les cellules positives CD34 purifiées.

L’amplification par PCR à transcription inverse (RT–PCR) a été réalisée avec des amorces représentant chacune des 51 séquences transcrites (Figure 5). Au moins deux amplifications RT–PCR indépendantes ont été réalisées pour chaque séquence transcrite. Des amorces correspondent à un EST (WI-7685) dérivé du 3′ UTR du gène CD34 ont été utilisées comme témoin positif (Figure 5). Lorsque deux EST ou plus correspondent à la même séquence transcrite, le même résultat est obtenu pour chaque EST.

Les données sont présentées à la figure 5, tableaux 3 et 4. Sur les 37 séquences exprimées dans le CDR MPD, 20 ont été exprimées dans des cellules mononucléées de moelle osseuse. Parmi ceux-ci, 16 ont également été exprimés en cellules positives CD34. Au sein du CDR MDS/AML, 11 séquences transcrites sur 20 ont été exprimées dans des cellules mononucléées de moelle osseuse. Parmi ceux-ci, huit ont également été exprimés en cellules positives CD34. Sur les 16 séquences transcrites situées dans la région de chevauchement entre les CDR MPD et MDS/AML, huit ont été exprimées dans des cellules de moelle osseuse dont cinq ont également été exprimées dans des cellules CD34 positives. Ces cinq séquences transcrites représentent donc des gènes candidats principaux puisqu’elles se situent à la fois dans les CDR MPD et MDS/AML et sont exprimées dans le compartiment cellulaire progéniteur hématopoïétique. Ils comprennent deux gènes inconnus correspondant aux ESTs SHGC-36858 et WI-12515 ainsi que trois gènes, SFRS6, h-l(3) mbt et MYBL2.