Comment effectuer une extraction d’ADN à partir de Taches de sang séchées À l’aide de résine Chelex

Chaque bio-scientifique qui souhaite analyser l’ADN sait que le processus commence par l’extraction de l’ADN à partir de cellules d’intérêt. Ces cellules pourraient être des RBC, des parasites ou des bactéries pour n’en nommer que quelques-unes. De plus, il existe différentes méthodes d’extraction d’ADN 1 à choisir en fonction du type d’échantillon, de l’analyse en aval, etc. De nombreux scientifiques commencent par des taches de sang séché (DBS) et la façon d’extraire l’ADN de tels échantillons présente donc un intérêt particulier. Un DBS est généralement préparé, en collectant du sang sur une carte Whatman FTA 2 ou un papier filtre chromatographique de 3 mm de Whatman, et en le laissant sécher pendant une période de temps (~ 4 heures) avant le traitement. Cette méthode de bio-échantillonnage est utilisée depuis des décennies.

Une méthode utile pour isoler l’ADN de tels échantillons à l’aide de la résine BT Chelex 1003 est décrite ci-dessous.

Première étape: Lyse des érythrocytes

• Découpez une tache de sang sec et placez-la dans un tube de microcentrifugeuse (1,5 ml) à l’aide d’un perforateur. N’oubliez pas d’étiqueter le tube, surtout lorsque vous travaillez sur plusieurs échantillons. À des fins de contrôle de la qualité, incluez également une tache de sang de contrôle positif.
• Ajouter 1 ml de saponine à 0,5% dans le tube de microcentrifugeuse contenant la tache de sang. Fermer, tourbillonner et incuber à 4 0C pendant au moins 4 heures, ou mieux encore, pendant la nuit. Dans cette étape, la saponine se complexifie avec le cholestérol dans la membrane érythrocytaire conduisant à la formation de pores dans la membrane et donc à l’hémolyse.4 La saponine est un réactif de lyse couramment utilisé pour libérer les parasites (par exemple, les parasites du paludisme) des globules rouges.
• Essorez pendant quelques secondes à 4 000 tr / min, pour retirer les gouttes du couvercle intérieur, et aspirez la saponine du tube à l’aide d’une pointe de pipette non barrière fixée à une pipette pasteur sur une machine d’assemblage sous vide. Une pipette pasteur en plastique peut également être utilisée. Laissez la tache dans le tube de la microcentrifugeuse.

Deuxième étape: Lavage

• Ajouter 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate dans la microcentrifugeuse, fermer, vortex et incuber à 4 0C pendant 20 à 30 minutes. L’incubation pendant la nuit ne causera aucun dommage. Cette étape garantit que la saponine est éliminée du tube.
• Tournez pendant quelques secondes à 4 000 tr / min, puis retirez le PBS, de la même manière que vous avez éliminé la saponine. Laissez la tache dans le tube de la microcentrifugeuse.

Troisième étape: Extraction de l’ADN avec de la résine Chelex

Principe: La résine Chelex agit en empêchant la dégradation de l’ADN à partir d’enzymes de dégradation (DNases) et de contaminants potentiels qui pourraient inhiber les analyses en aval. En général, la résine Chelex emprisonne ces contaminants, laissant l’ADN en solution. La résine Chelex arrête les cations tels que Mg2+, un co-facteur important pour l’action de la DNase, protégeant ainsi l’ADN de la dégradation.5,6

• Pipeter et ajouter 150µL de solution de résine Chelex à 6,7% dans le tube de microcentrifugeuse contenant la tache. Fermez le tube. Un rappel important: lors de la préparation de la solution de Chelex à 6,7%, utilisez de l’eau exempte de DNases, de nucléases (ou de tout ce qui pourrait nuire et dégrader l’ADN).
• Incuber à 95 0C pendant 10 minutes à l’aide d’un bloc chauffant / agitateur. Il est important d’ouvrir le tube deux fois, toutes les 2 minutes, pour relâcher la pression, puis de secouer pendant quelques secondes par la suite. Cela libère de l’ADN en solution.

Quatrième étape: Éviter les billes de résine Chelex dans l’extrait final

• Essorer pendant 5 minutes à 4 000 tr / min
• Pipeter autant d’extrait que possible dans un tube de microcentrifugeuse plus petit (0,6 ml) à l’aide d’une pointe de barrière aérosol tout en évitant le transfert de billes de Chelex.
• Centrifuger la microcentrifugeuse de 0,6 ml à 4 000 tr/min pendant 10 minutes. L’idée de la deuxième rotation est d’enlever les perles de Chelex restantes qui pourraient être transférées dans l’extrait final. Pourquoi est-ce important? Deux raisons principales: 1) Le Chelex se lie aux ions magnésium (co-facteur essentiel de la Taq polymérase utilisée en PCR) et 2) les fluorescences du Chelex. Si la fluorescence est votre moyen de visualiser un résultat, cela peut créer un faux positif.
• Pipeter environ 100 µL et transférer l’extrait final dans une nouvelle microcentrifugeuse. Étiqueter et conserver au réfrigérateur.

Quelques conseils Lors des extractions d’ADN

• Travaillez dans un environnement propre et exempt de contaminants
• Utilisez des embouts de pipette exempts de nucléases
• Manipulez tous les échantillons avec des gants
• Encore une fois, évitez les billes de Chelex dans votre extrait final

Conclusion

Chelex resin7, fournit une méthode d’extraction d’ADN simple et rapide à partir de DBS, pour une utilisation dans diverses applications analytiques moléculaires. Cette méthode ne nécessite pas d’équipement coûteux et est fiable lorsqu’elle est testée par rapport à d’autres méthodes.

1. GE Healthcare (2010). Extraction fiable de l’ADN des cartes Whatman FTA. Note de demande 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Royaume-Uni: GE Healthcare.
2. Whatman (s.d.). Préparation d’un disque FTA pour l’analyse de l’ADN. Protocole ALE de Whatman BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex® 100 et Chelex 20 Mode d’emploi des Résines échangeuses d’ions chélatantes. LIT200RevB. Hercules, CA : Laboratoires Bio-Rad.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C. et Linss, W. (2000). L’hémolyse des érythrocytes humains avec de la saponine affecte la structure membranaire. Acta Histochimica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Protocole d’extraction : Chelex. Site web de l’IBRC. Extrait de http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C.S., Boissaye, R., Stewart, J. et Staton, P. (s.d.). Développement et Validation Interne d’un Protocole d’Extraction d’ADN Chelex® pour les Écouvillons Oraux de Référence.
7. Walsh, P.s., Metzger, D.A., et Higuchi, R. (2013). BioTechniques 30e anniversaire de la Gemme Chelex 100 comme Support pour l’Extraction Simple de l’ADN pour le Typage par PCR à partir de Matériel Médico-légal. Biotechniques, 54(3), 134-139.