La microscopie par défaut est une technique qui nous permet d’observer, plutôt que de mesurer, des événements biologiques et de tirer des conclusions basées sur ce que nous voyons, plutôt que sur certains calculs. Le sujet de cet article peut donc paraître un peu surprenant puisqu’il traite des mesures de colocalisation. Bien qu’il existe des situations où vous pouvez déterminer visuellement la colocalisation des protéines, une confirmation plus précise d’une distribution mutuelle de deux sondes sera souvent nécessaire.
Pourquoi une Détermination visuelle de la Colocalisation Est-elle Insuffisante?
Ce n’est que si vous avez collecté des images suivant un protocole contrôlé d’analyse de colocalisation (signal suffisant dans chaque canal, pas d’autofluorescence ou de purge de signal) qu’il est sûr de dire que les deux sondes colocalisent uniquement sur la base de l’observation. Dans ce cas, si le signal vert se colocalise avec le signal rouge et que l’image est principalement jaune, aucune mesure statistique n’est nécessaire. Mais si vous ne voyez pas de chevauchement, cela ne signifie pas qu’il n’est pas là! Il se peut que les intensités des deux canaux ne soient pas les mêmes. A savoir, la couleur intermédiaire que nous voyons ne peut apparaître que si les deux sondes sont de même intensité. Par conséquent, les conclusions basées sur la détermination visuelle peuvent souvent conduire à des résultats faussement négatifs.
Quelles Méthodes de mesure de Chevauchement Existent?
Bien qu’il n’existe pas d’approche standard unique en la matière, deux méthodes sont largement utilisées et généralement acceptées. Ceux-ci impliquent soit le coefficient de corrélation de Pearson (PCC), soit le coefficient de colocalisation de Mander (MCC).
Ces deux méthodes concernent deux aspects différents de la colocalisation : la corrélation et la cooccurrence. Le coefficient de Pearson est lié à la corrélation des intensités de pixels dans les deux canaux. Il mesure la relation entre les signaux – si les valeurs du signal dans un canal augmentent simultanément avec l’autre, ou si un signal diminue lorsque l’autre augmente. La corrélation est distincte de la cooccurrence, qui est exprimée mathématiquement par le coefficient de Mander. Cela représente la couverture d’un signal par rapport à l’autre, ce qui révèle dans quelle mesure deux sondes occupent la même place. Explorons cela un peu plus loin.
Coefficient de corrélation de Pearson (PCC)
Définition: PCC reflète la relation linéaire entre les intensités du signal. Les valeurs peuvent varier entre 1 (corrélation positive parfaite) et -1 (corrélation négative parfaite), tandis que 0 signifie qu’il n’y a pas de corrélation. Il est possible d’explorer PCC visuellement à travers un scattergram où les coordonnées sur le graphique représentent les valeurs de pixels (signal) dans les deux canaux. Plus il y a de points qui se regroupent autour d’une ligne droite, meilleure est la corrélation entre les deux signaux
Exigences: Le PCC doit être mesuré dans la région d’intérêt (ROI) pour éviter les faux positifs ou négatifs. Si vous mesurez le PCC sur l’ensemble de l’image, les pixels de l’arrière-plan seront parfaitement corrélés et gonfleront le PCC. En revanche, si la mesure est effectuée dans une région sans intérêt où il existe une distribution hétérogène des deux canaux, le PCC sera déprimé.
Vous pouvez sélectionner le ROI à la main ou par seuillage pour exclure l’arrière-plan. Quelle que soit la façon dont vous le faites, soyez prudent, surtout lors du seuillage. La sélection du ROI doit inclure toutes les régions pertinentes de la ou des cellules, c’est-à-dire tous les endroits où une sonde peut être censée distribuer. Si vous utilisez une méthode basée sur l’intensité pour sélectionner le ROI (seuillage), vous pouvez exclure par inadvertance les résultats pertinents. Comment cela peut-il arriver? Vous pourriez avoir une région d’exclusion mutuelle, où aucune étiquette n’apparaît, et cela peut être un résultat biologiquement pertinent (les deux molécules ne sont pas exprimées à cet endroit dans la cellule). Cependant, le seuillage n’inclura pas cette région dans le ROI, vous mettant en danger de perdre des résultats pertinents.
Recommandé pour: Le PCC doit être utilisé sur les images s’il existe une relation linéaire entre les intensités. Si les données correspondent à un modèle plus complexe, PCC ne fonctionnera pas bien. Une méthode différente devrait également être choisie s’il y a un chevauchement inégal, où les sondes se répartissent conjointement mais dans des proportions différentes. Cela peut se produire lorsque le GFP est utilisé comme une seule sonde. Son niveau d’expression peut différer d’une cellule à l’autre et entraîner potentiellement une dépression de la PCC en raison d’une variabilité intercellulaire élevée.
Coefficients de colocalisation de Mander
Définition: MCC est une métrique qui décrit la cooccurrence – la fraction d’une protéine qui colocalise avec l’autre. MCC vous donnera une bonne mesure de la colocalisation lorsque vous marquez une protéine dans une vésicule et que vous voulez voir comment elle se colocalise avec une certaine structure dans une cellule, disons un microtubule. Si nous supposons que toutes les vésicules se colocalisent avec des microtubules mais que seule une proportion de microtubules se colocalise avec la vésicule, vous pouvez calculer MCC pour chaque canal et obtenir une métrique qui décrit quantitativement ce chevauchement fractionnaire.
Exigences: Le problème avec le MCC est qu’il nécessite l’élimination du fond. La partie la plus délicate ici consiste à définir un point de coupure pour l’intensité qui permettra la soustraction de l’arrière-plan. MCC mesure la fluorescence complète d’une sonde par pixel supérieur à zéro. Cependant, les pixels supérieurs à zéro sont extrêmement rares, en raison de facteurs tels que: autofluorescence, fuite de lumière, marquage non spécifique ou fluorescence des plaines d’images floues. La mesure de MCC nécessite donc une sélection minutieuse du seuil (coupure).
La première façon de le faire est le seuillage global, où vous soustrayez une valeur de seuil de chaque pixel, de sorte que chaque niveau en dessous de la coupure sélectionnée sera en arrière-plan et chaque pixel au-dessus tombera dans une région d’intérêt. Bien que cela soit très intuitif, le seuillage global est plutôt grossier et peut conduire à des situations indésirables comme l’exclusion des pixels de faible valeur proches de l’arrière-plan mais qui sont en fait positifs.
Une option plus automatique et moins subjective est la méthode Costes où le seuil est estimé en calculant plusieurs fois le PCC. Cela sert à définir la plage de valeurs de pixels qui sont positives et ne doivent donc pas être exclues. PCC est calculé pour différents groupes de pixels, et les valeurs de pixels pour lesquelles PCC est égal ou proche de zéro sont prises comme valeurs de seuil. Néanmoins, il doit également être vérifié visuellement, car dans les images avec un rapport signal sur bruit plus faible, il peut identifier un niveau de seuil très bas afin de ne pas distinguer les structures étiquetées de l’arrière-plan.
Recommandé pour: Lorsque la question biologique de votre expérience concerne la mesure dans laquelle les protéines / structures se chevauchent, la MCC devrait être la mesure de choix. Ces coefficients sont interprétés de manière plus intuitive que PCC, et sont indépendants de la proportionnalité du signal (les différences dans le nombre de structures marquées par chaque sonde).
Avant de commencer Votre Analyse
Quel que soit le choix de mesure de la colocalisation que vous choisissez, il est très important que la collecte d’images soit effectuée de manière correcte. Essayez de contrôler autant de facteurs que possible et préparez un ensemble d’échantillons de contrôle qui vous permettent de surveiller autant de variables que possible.
Gardez à l’esprit que la détermination de la colocalisation visuelle est influencée par de nombreux facteurs, notamment la subjectivité de l’observateur, le fait que le cerveau de chaque individu puisse voir les couleurs différemment, un daltonisme possible de l’observateur et la résolution spatiale qui détermine la taille du pixel, entre autres. Assurez-vous de traiter les images que vous êtes sur le point d’analyser de manière uniforme et gardez à l’esprit que toute manipulation incontrôlée peut vous faire perdre des informations pertinentes.
Et Enfin
Ces calculs sont implémentés dans la plupart des logiciels d’analyse d’images, par exemple ImageJ et Volocity. Mais, étant donné que la mesure de la colocalisation est encore un domaine quelque peu confus, des améliorations sont nécessaires, alors gardez une trace des nouvelles versions et des nouveaux packages pour le logiciel.
Comment mesurez-vous la colocalisation ? Faites-le nous savoir en écrivant dans la section commentaires!
Littérature:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Un guide pratique pour évaluer la colocalisation en microscopie biologique. Journal Américain de Physiologie – Physiologie cellulaire (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Analyse de colocalisation en microscopie à fluorescence. Dans : Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (éd.), Techniques d’imagerie cellulaire: Méthodes et protocoles, New York: Humana Press, 2012, pp. 97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Tests statistiques pour les mesures de colocalisation en microscopie biologique. Journal de microscopie. 2013; 252(3): 295-302
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