Chimères

Ce Que Vous Fournirez Partie I

• Un numéro de compte.
• Une lignée cellulaire ES sans mycoplasmes avec 40 chromosomes.

Ce que nous ferons

• Nous injecterons environ 50 blastocystes par lignée cellulaire ES. Cela devrait entraîner la naissance de 10 souris. Trois des souris devraient être de fortes chimères mâles. Nous avons fait nos preuves.
• Nous hébergerons les souris jusqu’au sevrage (trois semaines après la naissance).

Ce que Vous fournirez Partie II

• Vous hébergerez les souris sevrées.

Coût

• 3 300$ par 129 lignées cellulaires et le coût des donneuses; 4 950 $ par lignée cellulaire et le coût des donneuses pour d’autres origines génétiques.
• Les commandes locales non CWRU seront facturées 200 $ supplémentaires pour l’emballage et le transport des souris. Les commandes non locales seront facturées 200 $ et les frais de transport.

Conformité réglementaire

• Les chercheurs ont besoin d’un protocole IACUC de leur établissement pour recevoir des souris du noyau. Les protocoles IACUC de CWRU doivent spécifier l’utilisation du noyau transgénique de Cas. Les chercheurs n’ont normalement pas besoin d’un protocole IBC propre: l’examen de l’ADN recombinant chez les animaux sera effectué sur les informations soumises par commande en ligne pour le noyau transgénique et sera ajouté au protocole IBC du noyau en tant qu’amendement s’il est approuvé. Le BAC peut communiquer avec vous pour obtenir des renseignements supplémentaires dans le cadre de l’examen de l’ADNr après la soumission de la commande. L’approbation du GRV est requise avant le début des injections.

Remerciements

• Nous vous demandons de reconnaître le Cas Transgénique et l’Installation de ciblage dans les séminaires et publications.

Chronologie

• À compter de la date d’injection des cellules, il faudra un minimum de 6 semaines avant que nous puissions vous livrer des souris (près de 3 semaines pour la gestation, et au moins 3 semaines de croissance postnatale avant le sevrage). Il faudra encore 6 semaines avant que les chimères mâles soient assez âgées pour se reproduire, et un minimum de 6 semaines avant que vous ayez sevré votre progéniture au génotype pour tester la transmission de la lignée germinale– un total de 4.5 mois entre l’injection et le test de transmission des germes.
• Le délai actuel (3/25/21) prévu entre la commande et l’injection de cellules ES est de 8 semaines. Au cours des 8 semaines précédant l’injection, la demande de chimère est examinée par le comité ADNr du BAC, les cellules ES sont décongelées et cultivées, et les souris sont commandées et reçues.

Taux de réussite de la génération de Souris chimériques

Le noyau génère en moyenne environ 5 chimères par lignée cellulaire.

Mise en route
La probabilité de transmission germinale d’une mutation ciblée augmente avec le nombre de lignées cellulaires ES indépendantes disponibles. En moyenne, environ les deux tiers à trois quarts des lignées cellulaires ES sur le fond génétique 129 deviendront des lignées germinales. Pour les lignées cellulaires ES sur le fond C57, en moyenne, seulement la moitié à deux tiers des lignées deviendront des lignées germinales. Par conséquent, si vous achetez des lignées de cellules ES ciblées à partir d’un référentiel public, nous vous recommandons d’acheter 3 lignes correctement ciblées ou plus sur l’arrière-plan 129 et 4 lignes ou plus sur l’arrière-plan C57. De même, commandez 2 injections ou plus pour 129 lignes et 3 ou plus pour les lignes C57. Pour la génération de knockouts spécifiques aux tissus avec des allèles conditionnels dans les cellules ES d’EUCOMM, voir notre amorce.

Foire aux questions

Que sont les chimères?
Typiquement, les chimères sont construites pour générer des souris à partir de lignées cellulaires ES ciblées par des gènes ou piégées par des gènes. Les cellules ES injectées dans les embryons hôtes donnent naissance à des souris mosaïques appelées chimères.
Des cellules ES mâles sont injectées dans des blastocystes non sexués. Si l’embryon hôte est une femelle et que les cellules ES mâles fabriquent des cellules germinales, la chimère sera souvent un mâle fertile. Des embryons hôtes provenant d’une souche qui ne sera pas trop en concurrence avec les cellules ES sont utilisés, et les deux composants (ES et embryon hôte) sont génétiquement marqués avec des gènes de couleur du pelage afin que la contribution des cellules ES à l’animal puisse être déterminée facilement. Si la proportion de descendants de cellules ES dans le pelage de l’animal est élevée, la probabilité que les cellules ES soient représentées dans les gamètes est également élevée, car les cellules ES se mélangent soigneusement aux cellules hôtes au début de l’embryogenèse. Le système de marquage de la couleur du pelage permet également de déterminer, avec des croisements appropriés, si la progéniture des chimères provient de la composante cellulaire ES ou de la composante embryonnaire hôte.

129 cellules ES donnent naissance à une robe brune parce qu’elles sont A/A (agouti de type sauvage), et les embryons hôtes C57BL/6J donnent naissance à une robe noire parce qu’ils sont a/a (nonagouti récessif). Les cellules ES sont issues de la souche 129 de souris ; les embryons hôtes sont issus de la souche C57BL/6J de souris. Si ces chimères sont élevées à des souris a / a non agouti (par exemple C57BL / 6J, alors toute progéniture brune (A / a) doit provenir de gamètes dérivés de cellules ES, et 50% de la progéniture brune devrait porter l’allèle knockout. Alternativement, la transmission de la mutation peut être dosée directement par PCR ou Southern blot des tissus de la progéniture.
Si les cellules ES proviennent de la souche C57BL/6J (a/a, Tyr/Tyr et black), l’embryon hôte sera albinos C57BL/6J (a/a, Tyrc-2J/Tyrc2-J et white). La reproduction de telles chimères en C57BL / 6J albinos peut générer une progéniture noire (a / a, Tyr / Tyrc-2J) à partir de la composante cellulaire ES, dont 50% devraient porter la mutation, et une progéniture blanche (a / a, Tyrc-2J / Tyrc-2J) à partir de la composante embryonnaire hôte.
Les chimères mâles susceptibles de transmettre la mutation ciblée peuvent être identifiées par génotypage de bouchons copulateurs.

Chimères pour d’autres usages
Nous fabriquons également des chimères d’agrégation et des chimères diploïdtétraploïdes. Deux embryons préimplantatoires de deux souches différentes de souris sont combinés pour former une chimère d’agrégation. Cette technologie peut être utilisée pour générer des embryons de mosaïque génétique pour l’analyse de l’autonomie et de la nonautonomie de l’action des gènes et d’autres objectifs expérimentaux. Chez les chimères diploïdtétraploïdes, la composante tétraploïde donne en grande partie naissance à une grande partie du placenta dérivé de l’embryon et la composante diploïde à l’embryon. Ce type de chimère peut être utilisé pour déterminer si un gène est requis dans le placenta ou l’embryon.

Pourquoi mes souris sont-elles drôles de couleurs ?
Certaines lignées cellulaires ES sont hétérozygotes pour les allèles de couleur du pelage qui ne se révèlent que dans les générations suivantes. Les cellules R1 129 ES que nous utilisons sont hétérozygotes au locus albinos, portant une copie de l’allèle chinchilla de l’albinos (cch, également désigné Tyrc-ch) et sont hétérozygotes au locus de dilution aux yeux roses (p). La progéniture reproductrice issue de cellules R1 ES les unes aux autres peut donner naissance à des souris noires, de différentes nuances de gris, de différentes nuances de brun ou de jaune, selon l’assortiment d’allèles de couleur de pelage.

Que peut-on faire pour assurer la transmission des lignées germinales?
La transmission germinale est maximisée avec des cellules ES qui ont passé un minimum de temps en culture, qui ont un complément normal de chromosomes et qui sont exemptes de levures, de bactéries et de mycoplasmes. Ciblez une lignée cellulaire dont vous savez qu’elle est transmise dans vos conditions dans votre établissement. Utilisez une lignée cellulaire parentale qui est au nombre de passage le plus bas disponible (de préférence inférieur au nombre de passage 16). Minimisez le temps de culture de la lignée ciblée. Vérifiez que les lignées cellulaires ciblées ont le nombre normal de chromosomes. Testez votre lignée cellulaire pour les mycoplasmes. Certaines lignées cellulaires ne transmettront pas même lorsque tous ces paramètres sont en votre faveur. Même dans des conditions optimales, seuls les deux tiers des lignées cellulaires ES ciblées seront transmises par la lignée germinale. Par conséquent, commencez par au moins trois lignées cellulaires ciblées indépendantes pour assurer la transmission.

J’ai des chimères faibles / chimères féminines. Vont-ils transmettre le ko?
Les chimères faibles et les chimères femelles peuvent transmettre des allèles mutants, bien que rarement. Les chimères mâles susceptibles de transmettre la mutation ciblée peuvent être identifiées par génotypage de bouchons copulateurs. Seulement environ 10% des chimères femelles transmettent le génome des cellules ES, lorsqu’elles le font, ce n’est que dans les premières portées, et beaucoup de leurs descendants mâles ont des aneuploïdies des chromosomes sexuels qui les rendent stériles (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

Pourquoi mes chimères les plus fortes sont-elles mortes ?
La mortalité peut augmenter avec la proportion de l’animal qui provient des cellules ES, même pour les meilleures lignées cellulaires. Cette mortalité est due en grande partie aux aberrations épigénétiques apparues en culture. On pense que les aberrations épigénétiques sont corrigées par la reproduction ultérieure de souris survivantes et se sépareraient aléatoirement du locus ciblé, même si ce n’était pas le cas.

À quelle souche de souris dois-je élever mes mutants?
Pour minimiser la variabilité génétique le plus rapidement possible, reproduisez les chimères sur le même fond que les cellules ES. Si les cellules ES étaient 129, élevez les chimères à 129 souris et votre mutation sera complètement sur le fond consanguin 129 en une seule étape. Le fond consanguin le plus courant pour les études génétiques est la souche C57BL/6. Si vos cellules ES sont C57BL/6, croisez vos chimères vers des souris C57BL/6J. Si vous souhaitez changer le fond, la norme est de faire 9 croisements en série avec la souche consanguine de votre choix (environ 2,5 ans). La raison d’être des 9 générations est expliquée ici par Lee Silver. Alternativement, environ la moitié du nombre de générations est nécessaire pour le rétrocroisement assisté par marqueur, ou congénères de vitesse.Pour une reproduction maximale, croisez vos souris sur une souche héritée comme CD1. Les souris CD1 sont dérivées de souris suisses, présentent un degré élevé de variation génétique et ont été sélectionnées pour une reproduction robuste.

Cellules ES avec Allèles conditionnels d’EUCOMM
Chaque lignée cellulaire d’EUCOMM vous demandera de conclure un Accord de transfert de Matériaux. Commencez ce processus le plus tôt possible.
Le temps de génération des souris et le nombre de croisements nécessaires pour générer les souris expérimentales se combinent à une durée qui surprend ceux qui ne sont pas habitués à la génétique des souris, alors planifiez à l’avance. Le temps de génération des souris (le temps de l’adulte sexuellement mature à la progéniture sexuellement mature) est d’environ 3 mois.
Les allèles conditionnels EUCOMM ont typiquement une cassette flanquée de Frt (une cassette « Frt-ed »). La cassette possède un accepteur d’épissure qui dévie pratiquement tout épissage dans la cassette, ce qui fait de l’allèle une mutation de perte de fonction dans cette configuration. Pour générer l’allèle conditionnel, la cassette flanquée de Frt doit être retirée par croisement avec des souris exprimant le Flpe. Le système Flpe/Frt est comparable mais distinct du système Cre/LoxP.
Nous allons injecter les cellules ES dans des embryons hôtes pour fabriquer des souris chimériques. À partir de là, vous allez reproduire les souris pour générer des souris porteuses de la mutation (transmission germinale). Cette génération fondatrice de souris peut être croisée à des souris qui expriment Flpe pour retirer la cassette Frt-ed, générant l’allèle conditionnel. Ensuite, vous devez faire plusieurs autres croisements pour générer les souris expérimentales.

1. De l’injection de cellules ES aux chimères adultes sexuellement matures est le temps de génération des souris (3 mois).
2. Les chimères sont élevées à des souris de type sauvage pour établir le mutant dans la lignée germinale (3 mois).
3. Les souris conditionnelles frtd hétérozygotes sont croisées à des homozygotes exprimant des Flpe. Cela génère une progéniture Flpe/ o, frtd conditionnelle/+. (3 mois)
4. Les souris Flpe/o, frtd conditionnelles/+ sont croisées en type sauvage pour établir l’allèle excisé dans la lignée germinale et reproduire le Flpe, et l’excision est vérifiée moléculairement chez ces souris conditionnelles/+ (3 mois).
5. Les souris conditionnelles /+ se sont ensuite reproduites les unes aux autres pour faire des souris allèles conditionnelles homozygotes (3 mois).
6. Les souris conditionnelles / conditionnelles sont élevées à des souris Cre/Cre spécifiques aux tissus, null / +, pour créer les souris expérimentales Cre / o spécifiques aux tissus, conditionnelles / nulles, et des souris Cre / o spécifiques aux tissus, conditionnelles / +.

De plus, les souris Fple, null, Cre doivent être obtenues, les souris tissulaires spécifiques-Cre / tissulaires spécifiques-Cre, null / + doivent être élevées.
De plus, l’allèle conditionnel doit être analysé pour déterminer s’il est de type sauvage en fonction avant l’excision avec Cre, et nul après l’excision avec Cre. Pour déterminer si l’allèle conditionnel est de type sauvage en fonction avant l’excision, les mutants conditionnels /conditionnels et conditionnels / nuls doivent être examinés pour déterminer si leur phénotype est le même que les souris + /+ et null/+ respectivement. Pour déterminer si le conditionnel excisé par Cre est un allèle nul, le conditionnel est croisé à une souris Cre germinale et les conditionnels excisés sont intercalés pour tester si le phénotype de conditionnel excisé / conditionnel excisé est le même que nul / nul et / ou qu’aucune protéine n’est fabriquée à partir de l’allèle conditionnel excisé.
Un rapporteur d’activité Cre comme RosaReporter, ou plus idéalement, montrant directement que la protéine d’intérêt est absente des cellules cibles par immunofluorescence est un contrôle important. RosaReporter génère une expression permanente de la bêta-galactosidase dans toutes les cellules exposées au Cre.
Une expression excessive de Cre peut entraîner une rupture chromosomique pouvant provoquer des phénotypes sans rapport avec la fonction de l’allèle conditionnel. Par conséquent, les souris frères qui expriment le Cre mais conservent une certaine fonction génique (par exemple, conditionnel / +) sont un contrôle important.