Caché à la vue – Chloroflexi d’eau douce planctonique très abondant et diversifié

Abondance et diversité du phylum Chloroflexi dans des environnements d’eau douce

Sur la base de l’ARNr 16S, lire les abondances de 117 métagénomes de lacs, réservoirs et rivières, les représentants du phylum Chloroflexi comprenaient jusqu’à 7% de l’ARNR. communauté procaryote dans l’épilimnion (Fig. 1a, b), cependant, avec de grandes fluctuations. Comme pour les observations précédentes, la lignée CL500-11 dominait les échantillons d’hypolimnions (atteignant au moins 16 % dans tous les échantillons sauf un, et près de 27 % dans un échantillon du lac Biwa) (Fig. 1c), à l’exception d’un groupe moins connu appelé cluster TK10. La majorité des séquences d’ARNr 16S liées à TK10 dans la base de données SILVA proviennent du sol, de la peau humaine ou d’échantillons métagénomiques inconnus, tandis que seulement quatre (1,5%) proviennent d’eaux douces (fichier supplémentaire 1: Figure S1A).

Étonnamment, les échantillons d’épilimnions étaient dominés par des séquences affiliées au « groupe marin SL56″ (jusqu’à ca. 5% de la communauté procaryote totale). Des séquences de SILVA liées à SL56 ont été récupérées dans un lac d’eau douce et dans les ensembles de données de la Série mondiale des océans (GOS). Cependant, l’échantillon GOS à partir duquel ils ont été décrits est en fait un ensemble de données d’eau douce, le lac Gatun (Panama). Cela ressort clairement de nos résultats (Fig. 1; Dossier supplémentaire 1: Figure S2) que cet amas ne se trouve systématiquement que dans les lacs, les réservoirs et les rivières, mais pas dans l’habitat marin, ce qui suggère qu’il a été incorrectement appelé  » groupe marin. »Un autre groupe de séquences, appelé JG30-KF-CM66, décrit dans divers environnements (tas de déchets d’extraction d’uranium, sol, eau douce, colonne d’eau marine et sédiments), s’est avéré être distribué préférentiellement dans les rivières (en particulier le fleuve Amazone) que dans les lacs (Fig. 1a, b), mais à très faible abondance (maximum 1% du total des procaryotes). Des abondances similaires ont été trouvées dans la mer Caspienne saumâtre (profondeurs 40 m et 150 m) (Fichier supplémentaire 1: Figure S2).

Cependant, nous n’avons trouvé aucun support pour la présence de l’amas SAR202 ou de son clade frère d’eau douce CL500-9 dans tous les ensembles de données métagénomiques d’eau douce examinés. Dans les habitats marins et saumâtres, les SAR202 se trouvent presque exclusivement dans les couches aphotiques sombres, où ils représentent jusqu’à 30% de la communauté procaryote. S’il existe des clades liés à SAR202 dans les habitats d’eau douce, ils ne sont certainement pas très abondants ou ne proviennent peut-être pas de la colonne d’eau du rapport original (fichier supplémentaire 1: Figure S1). Dans l’ensemble, même si les abondances relatives de Chloroflexi dans les épilimnies d’eau douce sont beaucoup plus faibles que dans les eaux plus profondes, elles abritent une collection riche et étendue de nouveaux groupes.

Avec ces observations, il est également évident que dans les milieux aquatiques examinés ici (eau douce, saumâtre et marine), la diversité des représentants de Chloroflexi est sensiblement différente, les milieux d’eau douce abritant un assortiment de groupes phylogénétiquement plus diversifié que les milieux saumâtres ou marins. De plus, il existe des preuves claires de la présence de groupes d’eau douce uniquement (p. ex., SL56) et des groupes marins et saumâtres seulement (SAR202), réitérant que la salinité est une barrière aux transitions d’habitats microbiens entre les écosystèmes d’eau douce et marins. Ce n’est en aucun cas une barrière insurmontable car les transitions relativement récentes de l’eau douce à la mer (par exemple, l’eau douce  » ca. Methylopumilus spp. » et marine OM43) et à l’envers (Pélagibacter marin et LD12 d’eau douce) ont tous deux été proposés. Cependant, il est probable que les groupes trouvés dans des environnements saumâtres soient peut-être simplement mieux « apprêtés » pour des incursions plus réussies. Nous trouvons des exemples de groupes présents dans les métagénomes d’eau douce et saumâtre (JG30-KF-CM66 et CL500-11).

Les principaux représentants du Chloroflexi d’eau douce

Le binning automatisé de contigs liés au Chloroflexi provenant d’assemblages de chacun des 57 ensembles de données appartenant à 14 environnements différents (28 lacs/réservoirs, 26 rivières et 3 ensembles de données saumâtres) a entraîné la ségrégation de 102 MAGs (génomes assemblés par métagénome) au total (fichier supplémentaire 2: Tableau S1). L’analyse phylogénomique de MAGs présentant une complétude de 30 % ou plus (n = 53) montre qu’une diversité remarquablement élevée de MAGs a été récupérée dans pratiquement toutes les classes de Chloroflexi bien connues (Fig. 2). Trente-cinq MAGs constituaient trois lignées distinctes nouvelles au niveau de la classe sans représentants de culture disponibles (SL56, TK10 et JG30-KF-CM66).

Alors que l’hybridation in situ par fluorescence suivie d’un dépôt rapporteur catalysé (CARD-FISH) a détecté un nombre élevé de cellules CL500-11 dans l’épilimnion du lac de Zurich pendant un mixis partiel en hiver, des niveaux d’abondance de pointe ont toujours été trouvés dans des zones plus profondes, dans les deux lacs de Zurich (jusqu’à 11% de tous les procaryotes; Fig. 3a) et du lac Biwa (jusqu’à 14%; Fig. 3d). L’abondance de CL500-11 est corrélée négativement avec la température et la concentration de chlorophylle a (fichier supplémentaire 1: Figure S3). Dans les échantillons du réservoir de Řimov, cependant, CL500-11 était en dessous de la limite de détection (< 0,18 %), ce qui suggère que cet habitat relativement peu profond (profondeur maximale de 43 m) ne représente pas une niche privilégiée pour ce groupe de bactéries (fichier supplémentaire 1: Figure S4). Les cellules CL500-11 ont déjà été visualisées par des POISSONS-CARTES et se sont révélées être de grandes cellules incurvées. Des formes et des tailles similaires ont été observées dans des échantillons de POISSONS du lac de Zurich avec des longueurs moyennes de 0,92 µm (plage de 0,4 à 1,6 µm; n = 277) et des largeurs de 0,28 µm (plage de 0,19 à 0,39 µm). Analyse des volumes cellulaires (médiane 0.06 µm3) et la biomasse de cet amas par rapport à tous les procaryotes (Fig. 3c) suggère une contribution extrêmement élevée de la population CL500-11 à la biomasse microbienne totale. Leur rapport biomasse / abondance est de près de 2, c’est-à-dire qu’à 10% d’abondance, ils représentent près de 20% de la biomasse procaryote totale, ce qui indique une adaptation remarquable à l’hypolimnion profond relativement oligotrophe, atteignant des populations élevées même avec leurs grandes tailles de cellules.

Nous avons récupéré 11 MAGs (10 eaux douces, 1 saumâtre) pour CL500-11 au total. Les quatre MAGs du lac Biwa de différents mois forment une seule espèce. Cependant, les deux espèces du lac de Zurich semblent coexister tout au long de l’année (Mars, mai et novembre), une espèce se ramifiant avec le MAG précédemment décrit du lac Michigan (CL500-11-LM) et l’autre espèce ayant des représentants proches également dans la Caspienne saumâtre (> 95% ANI) et des schémas de recrutement de fragments métagénomiques similaires (Fig. 2 et 4c). Nous proposons le genre candidat Profundisolitarius (Pro.fun.di.so.li.ta’ri.us . L. adj . profond profond; L. adj. solitaire seul; N.L. masc. n. Profundisolitarius une seule recluse des profondeurs) au sein de Candidatus Profundisolitariaceae fam. nov. pour le cluster CL500-11 (classe Anaérolinée).

D’autre part, le groupe SL56 est la lignée dominante dans le réservoir de Řimov (maximum 1.1%), à la fois par analyse de l’ARNr 16S et par analyse CARD-FISH (Fig. 1 et 3). Les abondances maximales ont presque toujours été trouvées autour de 5-20 m à des températures de ca. 15 °C, ce qui suggère que ce groupe est principalement épilimnétique (fichier supplémentaire 1 : Figures S3 et S4). Cette région de la colonne d’eau (thermocline), en plus d’avoir un gradient de température, présente également une intensité lumineuse nettement inférieure à celle des couches superficielles. Les abondances maximales de la cyanobactérie Planktothrix rubescens adaptée à la faible luminosité à environ 13 m de profondeur dans les profils stratifiés d’été du lac de Zurich coïncident avec les abondances maximales du SL56 (fichier supplémentaire 1: Figure S3). Les cellules SL56 sont en forme de bâtonnets et allongées (longueur moyenne = 0,68 ± 0,25 µm; largeur moyenne = 0,35 ± 0,09 µm; n = 6; Fig. 3e). À notre connaissance, il s’agit du premier rapport d’un groupe de Chloroflexi spécifique à l’eau douce qui semble prospérer dans l’épilimnion.

Un total de 14 MAGs ont été récupérés pour le cluster SL56 (1 contenant l’ARNr 16S) et forment une lignée au niveau de la classe, considérablement divergente de tous les Chloroflexi connus (Fig. 2). Leur seul parent est un seul MAG (Chloroflexi CSP1-4) décrit à partir de sédiments aquifères. Le clade d’ARNr 16S auquel le CSP1-4 serait affilié est Gitt-GS-136, et la majorité des séquences de ce clade proviennent soit du sol, soit des sédiments fluviaux (informations tirées de la taxonomie de SILVA). Cependant, nous n’avons pu détecter aucune séquence d’ARNr 16S (partielle ou complète) dans la séquence génomique disponible de CSP1-4. Le clade le plus proche suivant (dans la taxonomie de l’ARNr 16S) de Gitt-GS-136 et SL56 est KD4-96, dont les séquences ont été obtenues à partir des mêmes habitats (voir fichier supplémentaire 1: Figure S1B). De plus, toutes les séquences d’ARNr 16S connues du groupe SL56 proviennent uniquement d’eaux douces (lac Gatun, lac de Zurich, etc.). Pris ensemble, il semble que les parents phylogénétiques les plus proches de la lignée d’eau douce SL56 habitent les habitats du sol ou des sédiments.

Les MAGS SL56 ont été reconstruits à partir d’endroits géographiquement éloignés (Europe, Amérique du Nord et du Sud, Fig. 2), et au moins neuf espèces différentes ont pu être détectées (ANI, Fig. 1). Aucun MAG n’a été obtenu à partir d’échantillons du lac Biwa, mais trois séquences d’ARNr 16S ont été récupérées dans des contigs non liés. Les MAG reconstruits sont répartis globalement le long des ensembles de données d’eau douce de l’épilimnion (aucun détecté dans l’hypolimnion profond) (Fig. 4 et Fichier supplémentaire 1: Figure S6). Aucun MAGS SL56 n’a été reconstruit à partir de la mer Caspienne, et aucun des génomes récupérés n’a été recruté à partir de métagénomes saumâtres. Nous proposons le genre candidat Limnocylindrus (Lim.no.cy.lin’drus.Gr. fem. n. limne un lac; L. masc. n. cylindrus un cylindre; N.L. masc. n. Limnocylindrus un cylindre d’un lac) dans la famille des Limnocylindracées. nov., Limnocylindrales ord.nov., et Limnocylindria classis. nov. pour le cluster Chloroflexi SL56.

Des séquences d’ARNr TK10 16S ont été trouvées aux plus fortes abondances dans des échantillons d’hypolimnions du lac Biwa (maximum ca. 2%) (Fig. 1 bis, c). Les cellules étaient ovoïdes avec une longueur estimée de 1,08 ± 0,1 µm et une largeur de 0,84 ± 0,09 µm (n = 12; Fig. 3e). Un groupe cohérent de neuf MAGs (trois contenant un fichier supplémentaire d’ARNr 16S 1: Figure S1) provenant d’endroits géographiquement éloignés (Europe, Asie et Amérique du Nord) a été récupérée. Ces organismes remarquablement cosmopolites qui prospèrent dans des strates lacustres plus profondes ne sont pas très diversifiés (valeurs ANI > 95%). Cette faible diversité apparente pourrait être la conséquence d’un créneau très spécialisé ou, ce qui est plus probable, le résultat d’une transition relativement récente vers l’eau douce, similaire à « Ca. Fonsibacter » (LD12 Alphaprotéobactéries). Aucun représentant de l’ARNr 16S n’a été détecté avec confiance dans des métagénomes marins ou saumâtres, bien que certaines séquences d’ARNr 16S de la base de données SILVA aient été obtenues à partir de sédiments marins et de colonnes d’eau (fichier supplémentaire 1: Figure S1). Les parents les plus proches de l’ARNr 16S semblent provenir soit du sol, soit d’échantillons de sédiments, ce qui suggère qu’ils pourraient être leur habitat d’origine. Fait intéressant, l’amas TK10 est également profondément ramifié, seulement après SL56 et CSP1-4 dans l’arbre phylogénétique du Chloroflexi en général, et tous les autres représentants du Chloroflexi (génomes de MAGs ou d’isolats) semblent descendre d’une branche distincte des deux. Nous suggérons le genre candidat UmbRicyclops (Um.bri.cy  » clops. L. fem. N. ombre de l’ombre; L. masc. n. cyclope (de Gr. Œil rond; Cyclope) un cyclope; N.L. masc. n. UmbRicyclops un œil rond vivant à l’ombre) dans la famille des UmbRicyclopaceae. nov., UmbRicyclopales ord.nov., et UmbRicyclopia classis nov. pour ce groupe d’organismes.

Les résultats de CARD-FISH montrent que les cellules JG30-KF-CM66 sont sphériques avec un diamètre estimé à 0,56 µm (± 0,15 µm; n = 8; Fig. 3e); cependant, des proportions très faibles (< 0,28%) ont été observées pour le JG30-KF-CM66 dans les profils de profondeur du lac de Zurich et du réservoir de Řimov (Fichier supplémentaire 1 : Figures S3 et S4). Nous avons obtenu 12 MAGs, principalement à partir de la colonne d’eau profonde (huit saumâtres, quatre d’eau douce), dont un avec une séquence 16S presque complète, qui a formé une nouvelle lignée au niveau de la classe dans l’analyse phylogénomique (Fig. 1). Les parents les plus proches de ces MAGs sont le SAR202 marin et les Dehalococcoidea (Fig. 1 et Fichier supplémentaire 1: Figure S1). Au sein de cet amas, des groupes distincts de MAGs saumâtres et d’eau douce peuvent être distingués. Nous suggérons le genre candidat Bathosphaera (Ba.tho.sphae’ra. Grammes. adj. bathos deep; L. fem. n. sphaera une sphère; N.L. fem. n. Bathosphaera une bactérie coccoïde vivant dans les profondeurs) dans la famille des Bathosphaéracées. nov., Bathosphaerales ord.nov., et Bathosphaeria classis. nov. pour le cluster Chloroflexi JG30-KF-CM66.

Nous avons également récupéré des MAGs dans les classes Chloroflexia (quatre MAGs) et Caldilineae (deux MAGs) (Fig. 1). Les MAGs de Chloroflexia étaient apparentés aux Oscillochloris trichoides mésophiles DG-6 dans le sous-ordre des Chloroflexineae (un MAG) et trois autres MAGs à Kouleothrix aurantiaca dans la famille des Kouleotrichaceae. nov. former un nouveau sous-ordre pour lequel nous proposons le nom de sous-ordre Kouleothrichniae. nov. Aucun de ces MAGs ne montre de recrutement significatif de fragments en dehors de leur lieu d’origine. 14 MAG supplémentaires de la Caspienne affiliés au cluster SAR202 qui ne seront pas discutés ici car ils ont déjà été décrits.

Contribution du Chloroflexi d’eau douce au fonctionnement de l’écosystème

Des informations métaboliques sur les MAGs de Chloroflexi reconstruits (complétude ≥ 30%) suggèrent un style de vie principalement hétérotrophe qui, dans certains groupes, est stimulé par la production d’énergie entraînée par la lumière via des rhodopsines (CL500-11, Chloroflexales, SL56 et TK10) ou une phototrophie anoxygénique aérobie (Chloroflexales). Les MAG de chaque groupe contiennent les gènes nécessaires au métabolisme central des glucides, y compris la glycolyse, la gluconéogenèse et le cycle de l’acide tricarboxylique. Les gènes clés de la réduction assimilatoire du sulfate (3′-phosphoadénosine 5′-phosphosulfate (PAPS) synthase et sulfate adénylyltransférase) étaient absents dans la plupart des MA suggérant l’utilisation de composés soufrés réduits exogènes. Des gènes de dénitrification (sous-unités alpha et bêta de la nitrate réductase/nitrite oxydoréductase et nitrite réductase) ont été trouvés dans les MAG TK10, mais les enzymes subséquentes responsables de la production d’azote moléculaire étaient absentes.

Dans les milieux aquatiques, les Thaumarchaeota et les cyanobactéries sont la principale source de cobalamine et de ses précurseurs de corrinoïdes pour la grande communauté des auxotrophes ou ceux qui sont peu susceptibles d’être récupérés. La synthèse de novo de la cobalamine a un coût métabolique élevé, et l’hypothèse de la Reine noire a été avancée pour expliquer les raisons pour lesquelles seuls quelques membres de la communauté entreprennent sa production. Aucun des MAGS de Chloroflexi reconstruits ne codent les gènes nécessaires à la biosynthèse des anneaux de corrine à partir de zéro, et il manquait également de la cobalamine à haute affinité (BtuBFCD) ou d’autres transporteurs présumés de corrinoïdes (DET1174-DET1176), ce qui pourrait être une conséquence de l’incomplétude du génome ou de l’utilisation d’un transporteur non décrit. Cependant, tous ces organismes ne semblent pas être des auxotrophes car les MAG du cluster JG30-KF-CM66 codent des gènes pour la voie de récupération de cobinamide en cobalamine qui utilise des corrinoïdes importés ainsi que des intermédiaires de la voie de biosynthèse de la riboflavine pour synthétiser la cobalamine. Le ZH-chloro-G3 MAG contient une voie de récupération presque complète de la cobalamine (seul le CobC manquant) et de la biosynthèse de la riboflavine (fichier supplémentaire 3: Tableau S2).

Des gènes d’assemblage flagellaire étaient présents dans plusieurs MAGs des amas CL500-11 et TK10 (Fig. 1 et Fichier supplémentaire 3 : Tableau S2). Cependant, les composants des cycles L et P qui ancrent les flagelles à la membrane externe manquaient dans tous les MAGs flagellés et les génomes Chloroflexi de référence (par exemple, Thermomicrobium, Sphaerobacter). De plus, les génomes MAGs et Chloroflexi de référence n’ont pas codé de gènes pour la biosynthèse du LPS et aucun système de sécrétion, mis à part Sec et Tat, n’a été détecté (les systèmes de sécrétion de type I–IV ancrés dans la membrane externe sont absents) (fichier supplémentaire 3: Tableau S2). Ensemble, la génomique comparative des génomes de Chloroflexi disponibles renforce les inférences selon lesquelles, bien que les micrographies électroniques suggèrent deux couches denses en électrons dans la plupart des membres de ce phylum, les Chloroflexi possèdent probablement une seule membrane lipidique (monoderme) plutôt que deux (didermes).

Des séquences de type rhodopsine ont été reconnues dans 18 MAG de cette étude auprès de représentants de CL500-11, de Chloroflexie, de SL56 et de TK10 qui sont phylogénétiquement les plus proches des xanthorhodopsines (fichier supplémentaire 1: Figure S8A et B), et sont ajustés pour absorber la lumière verte comme d’autres rhodopsines d’eau douce et côtières (fichier supplémentaire 1: Figure S8C). Plusieurs MAG codent des gènes pour la biosynthèse des caroténoïdes permettant la possibilité d’une antenne caroténoïde qui est la marque de fabrique des xanthorhodopsines. Parmi les résidus impliqués dans la liaison de la salinixanthine (le caroténoïde prédominant de Salinibacter ruber), nous avons trouvé un nombre étonnamment élevé conservé (10 identiques sur 12 dans au moins une séquence de rhodopsine) (Fichier supplémentaire 1: Figure S8D), suggérant qu’une antenne caroténoïde peut être liée, rendant au moins certaines de ces séquences des xanthorhodopsines bonafides.

Même les représentants de CL500-11 et de TK10 qui se trouvent principalement dans l’hypolimnion pendant la stratification sont capables de phototrophie; cependant, ils peuvent potentiellement accéder à la zone photique pendant l’hiver et au début du printemps mixis. Outre la photohétérotrophie à base de rhodopsine, nous avons également récupéré des MAG de la classe Chloroflexie codant des gènes pour les protéines du centre de réaction de type II du photosystème L et M (pufL et pufM), la bactériochlorophylle et la biosynthèse des caroténoïdes. Les séquences du gène pufM se regroupent avec d’autres séquences pufM apparentées au Chloroflexi (fichier supplémentaire 1 : Figure S9). Cependant, aucune preuve de fixation du carbone, soit par la voie du 3-hydroxypropionate, soit par le cycle de Calvin–Benson, n’a été trouvée dans un photosystème portant du MAG, ce qui pourrait être une conséquence de l’incomplétude du MAG. Il se peut également que ce soient des phototrophes anoxygènes aérobies qui ne fixent pas le carbone, par exemple les Gemmatimonadètes d’eau douce et les Acidobactéries (toutes deux aérobies).

Histoire évolutive du Chloroflexi pélagique

Il ressort des analyses phylogénomiques que la collection de représentants du phylum Chloroflexi récupérée dans ce travail, ainsi que les séquences génomiques existantes à partir d’isolats et de MAGs, n’offre qu’une esquisse partielle de l’histoire évolutive complexe du phylum dans son ensemble. Par exemple, les branches les plus divergentes  » Ca. Limnocylindria » (groupe SL56) et  » Ca. UmbRicyclopia » (amas TK10) n’ont pratiquement pas de parent proche à part un MAG de sédiments aquifères (apparenté à  » Ca. Limnocylindrie « ). Cependant, des clones d’ARNr 16S apparentés ont été récupérés dans le sol/les sédiments pour ces deux groupes, suggérant des transitions vers un mode de vie pélagique (fichier supplémentaire 1: Figure S1B).

La prise en compte de l’absence de séquences d’ARNr 16S marines apparentées pour ces groupes, en plus de leur indétectabilité dans les ensembles de données métagénomiques marines, suggère également une ascendance du sol / sédiment plutôt que de l’environnement salin. Bien que la possibilité d’une origine marine ne puisse être formellement exclue, la directionnalité d’une transition du sol / sédiment vers les colonnes d’eau douce semble la plus probable. De plus, étant donné que  » Ca. Limnocylindrie » et  » Ca. UmbRicyclopia » divergent avant la divergence des classes Dehalococcoidea et marine SAR202 (classe  » Ca. Monstramaria »), qui sont les seuls Chloroflexi marins écologiquement pertinents connus à ce jour (le premier dans les sédiments marins et le second dans la colonne d’eau profonde de l’océan), il est probable que les Chloroflexi ancestraux proviennent d’un habitat sol / sédiment. Le succès du SAR202 marin dans les océans profonds est remarquable; c’est le groupe Chloroflexi le plus largement distribué, peut-être numériquement le plus abondant de la planète. Cependant, certaines séquences d’ARNr 16S de ses plus proches parents, les Dehalococcoidea, ont également été récupérées dans des sédiments d’eau douce, même si la grande majorité semble provenir de sédiments marins profonds (les deux habitats anoxiques).