ADN tumoral circulant

Considérations préanalytiquesmodifier

Lorsque le sang est collecté dans des tubes d’EDTA et stocké, les globules blancs commencent à lyser et à libérer de l’ADN de type sauvage génomique dans l’échantillon en quantités généralement beaucoup plus élevées que l’adNCT. Cela rend la détection de mutations ou d’autres biomarqueurs de l’adNCT plus difficile. L’utilisation de tubes de stabilisation cellulaire disponibles dans le commerce peut empêcher ou retarder la lyse des globules blancs, réduisant ainsi l’effet de dilution de l’adNCT. Sherwood et al ont démontré une détection supérieure des mutations KRAS dans des échantillons appariés collectés dans des tubes EDTA K3 et Streck BCT. Les avantages des tubes de stabilisation cellulaire peuvent être réalisés dans des situations où le sang ne peut pas être transformé immédiatement en plasma.

D’autres procédures peuvent également réduire la quantité d’ADN de type sauvage « contaminant » et rendre la détection de l’adNCT plus réalisable:

• Ne jamais congeler un échantillon de sang avant d’extraire le plasma pour l’analyse de l’adNCT
• Transformer l’échantillon en plasma dans les 2 à 4 heures (s’il est collecté dans un tube EDTA)
• Ne jamais utiliser de tubes héparinés, l’héparine inhibe la PCR en imitant la structure hélicoïdale de l’ADN
• Effectuer une double étape de centrifugation (centrifuger le sang pour éliminer le plasma, répétez ensuite sur le plasma pour éliminer les débris au fond du tube) pour éliminer plus de débris cellulaires avant l’extraction de l’ADN.
• Le plasma est meilleur que le sérum pour la récupération de l’adNCT

Extraction de l’ADNCT

Le principal attrait de l’analyse de l’adNCT est qu’elle est extraite de manière non invasive par prélèvement sanguin. L’acquisition d’ADNCFC ou d’adNCT nécessite généralement une collecte d’environ 3 ml de sang dans des tubes enrobés d’EDTA. L’utilisation de l’EDTA est importante pour réduire la coagulation du sang. Les fractions plasmatiques et sériques du sang peuvent être séparées par une étape de centrifugation. L’adNCT ou l’ADNCFC peuvent ensuite être extraits de ces fractions. Bien que le sérum ait tendance à avoir des niveaux plus élevés d’ADNC, cela est principalement attribué à l’ADN des lymphocytes. Des niveaux élevés d’ADNc contaminant sont sous-optimaux car cela peut diminuer la sensibilité de la détection de l’ADNc. Par conséquent, la majorité des études utilisent le plasma pour l’isolement de l’adNCT. Le plasma est ensuite traité à nouveau par centrifugation pour éliminer les cellules sanguines intactes résiduelles. Le surnageant est utilisé pour l’extraction d’ADN, qui peut être réalisée à l’aide de kits disponibles dans le commerce.

Analyse de l’ADNCT

L’analyse de l’adNCT après extraction nécessite l’utilisation de diverses méthodes d’amplification et de séquençage. Ces méthodes peuvent être séparées en deux groupes principaux selon que l’objectif est d’interroger tous les gènes dans une approche non ciblée, ou si l’objectif est de surveiller des gènes et des mutations spécifiques dans une approche ciblée.

Approches non cibléesmodifier

Des approches de séquençage du génome entier ou de l’exome entier peuvent être nécessaires pour découvrir de nouvelles mutations dans l’ADN tumoral tout en surveillant la charge de morbidité ou en suivant la résistance aux médicaments. Des approches non ciblées sont également utiles en recherche pour observer l’hétérogénéité tumorale ou pour découvrir de nouvelles cibles médicamenteuses. Cependant, bien que des méthodes non ciblées puissent être nécessaires dans certaines applications, elles sont plus coûteuses et ont une résolution plus faible. Cela rend difficile la détection de mutations rares ou dans des situations où de faibles taux d’adNCT sont présents (comme une maladie résiduelle minimale). De plus, il peut y avoir des problèmes de distinction entre l’ADN des cellules tumorales et l’ADN des cellules normales en utilisant une approche du génome entier.

Le séquençage du génome entier ou de l’exome utilise généralement des technologies de séquençage de l’ADN à haut débit. Limiter le séquençage à l’ensemble de l’exome peut plutôt réduire les dépenses et augmenter la vitesse, mais au prix de la perte d’informations sur les mutations dans les régions régulatrices non codantes de l’ADN. Bien que le simple fait d’examiner les polymorphismes de l’ADN par séquençage ne différencie pas l’ADN des cellules tumorales ou normales, ce problème peut être résolu en le comparant à un échantillon témoin d’ADN normal (par exemple, l’ADN obtenu par un écouvillon buccal.) Fait important, le séquençage du génome entier et de l’exome entier est utile pour la découverte initiale de mutations. Cela fournit des informations pour l’utilisation de techniques ciblées plus sensibles, qui peuvent ensuite être utilisées à des fins de surveillance des maladies.

Le séquençage du génome entier permet de récupérer les propriétés structurales de l’ADNc, la taille des fragments et leurs motifs de fragmentation. Ces motifs uniques peuvent être une source d’information importante pour améliorer la détection de l’adNCT ou localiser le tissu d’origine de ces fragments. La sélection de la taille de fragments courts (< 150 pb) avec des méthodes in vitro ou in silico pourrait améliorer la récupération des mutations et des aberrations du nombre de copies.

Caryotypage numériquemodifier

Cette méthode a été développée à l’origine par le laboratoire de Bert Vogelstein, Luis Diaz et Victor Velculescu à l’Université Johns Hopkins. Contrairement au caryotypage normal où un colorant est utilisé pour colorer les bandes chromosomiques afin de visualiser les chromosomes, le caryotypage numérique utilise des séquences d’ADN de loci dans tout le génome afin de calculer la variation du nombre de copies. Les variations du nombre de copies sont courantes dans les cancers et décrivent des situations où la perte d’hétérozygotie d’un gène peut entraîner une diminution de la fonction due à une expression plus faible, ou une duplication d’un gène, ce qui conduit à une surexpression.

Analyse personnalisée des extrémités réarrangées (PARE) Edit

Une fois le génome entier séquencé à l’aide d’une méthode de séquençage à haut débit, telle qu’Illumina HiSeq, le PARE est appliqué aux données pour analyser les réarrangements et les translocations chromosomiques. Cette technique a été conçue à l’origine pour analyser l’ADN tumoral solide, mais a été modifiée pour des applications d’adNCT.

Méthylation et hydroxyméthylation de l’ADN

Un marquage épigénétique approprié est essentiel pour l’expression génique normale et la fonction cellulaire et des altérations aberrantes des schémas épigénétiques sont une caractéristique du cancer. Un état épigénétique normal est maintenu dans une cellule au moins en partie par méthylation de l’ADN. La mesure des schémas de méthylation aberrants dans l’adNCT est possible grâce à la méthylation stable de régions de l’ADN appelées « îles CpG ». La méthylation de l’adNCT peut être détectée par traitement au bisulfite. Le traitement au bisulfite convertit chimiquement les cytosines non méthylées en uracile tout en laissant les cytosines méthylées non modifiées. L’ADN est ensuite séquencé et toute altération du motif de méthylation de l’ADN peut être identifiée. L’hydroxyméthylation de l’ADN est une marque associée de manière similaire qui s’est avérée être un marqueur prédictif des conditions saines par rapport aux maladies dans l’ADNc, y compris le cancer. La mesure des schémas d’hydroxyméthylation aberrants dans l’adNCT a été prouvée par des chercheurs de l’Université de Chicago (Chuan He lab), de l’Université de Stanford (Quake lab) et de la société Cambridge Epigenetix.

Approches ciblesmodiFier

Dans une approche ciblée, le séquençage de l’adNCT peut être dirigé vers un panel génétique construit sur la base de points chauds mutationnels pour le cancer d’intérêt. Ceci est particulièrement important pour informer le traitement dans les situations où des mutations sont identifiées dans des cibles pouvant être droguées. Il est également possible de personnaliser l’analyse ciblée de l’adNCT pour chaque patient en combinant des biopsies liquides avec des biopsies de tissus primaires standard. Le séquençage du génome entier ou de l’exome entier de la biopsie tumorale primaire permet la découverte de mutations génétiques spécifiques à la tumeur d’un patient et peut être utilisé pour un séquençage ciblé ultérieur de l’adNCT du patient. La sensibilité la plus élevée de la détection de l’adNCT est obtenue grâce au séquençage ciblé de polymorphismes nucléotidiques uniques spécifiques (SNP). Les gènes couramment mutés, tels que les oncogènes, qui présentent généralement des mutations à points chauds, sont de bons candidats pour des approches de séquençage ciblées. Inversement, la plupart des gènes suppresseurs de tumeurs présentent un large éventail de mutations possibles de perte de fonctions dans tout le gène et, en tant que tels, ne conviennent pas au séquençage ciblé.

Les approches ciblées ont l’avantage d’amplifier l’adNCT par réactions en chaîne par polymérase (PCR) ou PCR numérique. Ceci est particulièrement important lors de l’analyse de l’adNCT, non seulement parce qu’il y a des niveaux relativement faibles d’ADN circulant dans la circulation sanguine, mais aussi parce que l’adNCT représente une faible proportion de l’ADN total sans cellules extrait. Par conséquent, l’amplification des régions d’intérêt peut considérablement améliorer la sensibilité de la détection de l’adNCT. Cependant, l’amplification par PCR peut introduire des erreurs compte tenu du taux d’erreur inhérent aux ADN polymérases. Les erreurs introduites lors du séquençage peuvent également diminuer la sensibilité de la détection des mutations de l’adNCT.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Edit

Cette méthode est dérivée de la PCR numérique, nommée à l’origine par le groupe de Bert Vogelstein à l’Université Johns Hopkins. La PCR numérique par gouttelettes utilise un générateur de gouttelettes pour partitionner des morceaux d’ADN uniques en gouttelettes à l’aide d’une émulsion huile / eau. Ensuite, des réactions en chaîne de polymérase individuelles se produisent dans chaque gouttelette en utilisant des amorces sélectionnées contre des régions d’adNCT et se poursuit jusqu’au point final. La présence des séquences d’intérêt est mesurée par des sondes fluorescentes, qui se lient à la région amplifiée. Le ddPCR permet une évaluation hautement quantitative des fréquences des allèles et des mutants dans l’adNCT, mais est limité par le nombre de sondes fluorescentes pouvant être utilisées dans un seul essai (jusqu’à 5). La sensibilité du test peut varier en fonction de la quantité d’ADN analysée et est d’environ 1 sur 10 000.

Modification des perles, de l’émulsification, de l’amplification et de la magnétisme (rayonnement)

Cette technique s’appuie sur la PCR numérique par gouttelettes afin d’identifier les mutations de l’adNCT à l’aide de la cytométrie en flux. Une fois l’adNCT extrait du sang, la PCR est réalisée avec des amorces conçues pour cibler les régions d’intérêt. Ces amorces contiennent également des séquences d’ADN spécifiques, ou des étiquettes. L’ADN amplifié est mélangé à des billes magnétiques enrobées de streptavidine et émulsionné en gouttelettes. Des amorces biotinylées conçues pour se lier aux étiquettes sont utilisées pour amplifier l’ADN. La biotinylation permet à l’ADN amplifié de se lier aux billes magnétiques, qui sont recouvertes de streptavidine. Une fois la PCR terminée, les billes liées à l’ADN sont séparées à l’aide d’un aimant. L’ADN sur les billes est ensuite dénaturé et laissé s’hybrider avec des oligonucléotides fluorescents spécifiques à chaque matrice d’ADN. Les complexes perle-ADN obtenus sont ensuite analysés par cytométrie en flux. Cette technique est capable de capturer les fréquences des allèles et des mutations grâce au couplage avec le ddPCR. Cependant, contrairement au ddPCR, un plus grand nombre de séquences d’ADN peuvent être interrogées en raison de la flexibilité de l’utilisation de sondes liées par fluorescence. Un autre avantage de ce système est que l’ADN isolé peut également être utilisé pour le séquençage en aval. La sensibilité est de 1,6 sur 104 à 4,3 sur 105.

Profilage personnalisé du cancer par séquençage profond (CAPP-Seq) Edit

Cette méthode a été décrite à l’origine par les groupes d’Ash Alizadeh et de Maximilian Diehn à l’Université de Stanford. Cette technique utilise des sondes sélectrices d’oligonucléotides biotinylées pour cibler des séquences d’ADN pertinentes pour la détection de l’adNCT. Des bases de données sur le cancer accessibles au public ont été utilisées pour construire une bibliothèque de sondes contre les mutations récurrentes du cancer en calculant leur indice de récurrence. Le protocole a été optimisé pour les faibles niveaux d’ADN observés dans la collecte de l’adNCT. Ensuite, l’ADN isolé subit un séquençage profond pour une sensibilité accrue. Cette technique permet l’interrogation de centaines de régions d’ADN. La sensibilité de détection de l’adNCT de CAPP-Seq est rapportée à 2,5 molécules sur 1 000 000.

Tagged AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq) Edit

TAM-Seq permet un séquençage ciblé de gènes entiers pour détecter des mutations dans l’adNCT. Tout d’abord, une étape d’amplification générale est réalisée à l’aide d’amorces couvrant l’ensemble du gène d’intérêt dans des sections 150-200bp. Ensuite, un système microfluidique est utilisé pour attacher des adaptateurs avec un identifiant unique à chaque amplicon pour amplifier davantage l’ADN dans des réactions singleplexes parallèles. Il a été démontré que cette technique permettait d’identifier avec succès des mutations dispersées dans le gène suppresseur de tumeur TP53 chez des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire avancé. La sensibilité de cette technique est de 1 sur 50.

Safe-Sequencing (Safe-Seq) Edit

Cette méthode a été décrite à l’origine par Bert Vogelstein et son groupe à l’Université Johns Hopkins. Safe-Seq diminue le taux d’erreur du séquençage massivement parallèle afin d’augmenter la sensibilité aux mutants rares. Il y parvient en ajoutant une séquence d’identifiant unique (UID) à chaque modèle d’ADN. L’ADN est ensuite amplifié à l’aide des UID ajoutés et séquencé. Toutes les molécules d’ADN avec le même UID (une famille d’UID) devraient avoir la même séquence d’ADN rapportée puisqu’elles ont été amplifiées à partir d’une molécule. Cependant, des mutations peuvent être introduites par amplification, ou des affectations de base incorrectes peuvent être appelées dans les étapes de séquençage et d’analyse. La présence de l’UID permet de séparer ces erreurs méthodologiques des mutations réelles de l’adNCT. Une mutation est considérée comme un « supermutant » si 95% des lectures séquencées sont en accord. La sensibilité de cette approche est de 9 sur 1 million.

sequencingEdit duplex

Cette méthode est une amélioration des UID uniques ajoutés dans la technique Safe-Seq. Dans le séquençage duplex, l’ADN double brin randomisé agit comme des étiquettes uniques et est attaché à un espaceur invariant. Les étiquettes sont attachées aux deux extrémités d’un fragment d’ADN (étiquettes α et β), ce qui donne deux modèles uniques pour la PCR – un brin avec une étiquette α à l’extrémité 5′ et une étiquette β à l’extrémité 3′ et l’autre brin avec une étiquette β à l’extrémité 5′ et une étiquette α à l’extrémité 3′. Ces fragments d’ADN sont ensuite amplifiés avec des amorces contre les séquences invariantes des étiquettes. L’ADN amplifié est séquencé et analysé. L’ADN avec les adaptateurs duplex est comparé et les mutations ne sont acceptées que s’il existe un consensus entre les deux brins. Cette méthode prend en compte à la fois les erreurs de séquençage et les erreurs d’amplification PCR au stade précoce. La sensibilité de l’approche à la découverte des mutants est de 1 sur 10 ^ 7.

Suppression d’erreur numérique intégrée (iD) – CAPP-SeqEdit amélioré

L’iD améliore l’analyse CAPP-Seq de l’adNCT afin de diminuer l’erreur et donc d’augmenter la sensibilité de détection. Rapporté en 2016, iDES combine CAPP-Seq avec une technologie de séquençage de codes à barres duplex et avec un algorithme de calcul qui supprime les erreurs stéréotypées associées à l’étape d’hybridation CAPP-Seq. Le procédé intègre également le séquençage duplex dans la mesure du possible, et comprend des méthodes pour une récupération duplex plus efficace à partir d’ADN libre de cellules. La sensibilité de cette version améliorée de CAPP-Seq est de 4 sur 100 000 exemplaires.