y-kromosommikrodeletion hos en far og hans fire infertile sønner

abstrakt

Mikrodeletioner af YK er forbundet med asoospermi og svær oligosospermi. Generelt er mænd med sletninger ufrugtbare, og derfor overføres sletninger ikke til sønner, medmindre der udføres in vitro-befrugtning (IVF) og intracytoplasmisk sædinjektion (ICSI). Vi rapporterer en usædvanlig familie præget af flere medlemmer med infertilitet og YK mikrodeletion. Komplet reproduktionshistorie, sædanalyser og blodprøver blev fremkaldt fra relevante familiemedlemmer. DNA-forberedelse og kvantificering blev udført ved hjælp af kommercielle sæt. Ialt 27 par sekvensmærkede lokalitetsbaserede primersæt, der er specifikke for y mikrodeletion region loci, blev brugt til screening. Southern blots blev derefter analyseret for bekræftelse ved hjælp af slettede cDNA ‘ er og ribosomale bindingsmotiv (RBM). Proband, hans tre brødre og far blev alle fundet slettet for das, men ikke RBM. På tidspunktet for analysen var probandens far asoospermisk, mens hans fire sønner enten var alvorligt oligosospermiske eller asospermiske. I modsætning til deres far er de fire sønner ufrugtbare og har ingen afkom, bortset fra en af dem, der kun opnåede en datter efter IVF/ICSI-behandling for infertilitet. Mikrodeletioner af YK, der involverer das-genet, er forbundet med en variabel fænotypisk ekspression, der kan omfatte åbenbart normal fertilitet.

introduktion

infertilitet forekommer hos ~14% af par (Mosher, 1985), og abnormiteter hos den mandlige partner anslås at være til stede i op til halvdelen af tilfældene (Sverdloff et al., 1985). Forsøg på at vurdere årsagerne til asoospermi har vist, at efter udelukkelse af traditionelt genkendelige årsager (dvs.unormal karyotype, obstruktion, varicocoele, hormonal defekt osv.), er de fleste tilfælde (50-75%) uforklarlige og betegnes idiopatisk (Pryor et al., 1997). For nylig er det blevet rapporteret, at op til 30% af mænd med `idiopatisk’ asoospermi har mikrodeletioner af Y-kromosomet (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Præcis hvordan og hvorvidt disse mikrodeletioner forårsager asoo / oligosospermi er genstand for både intens undersøgelse og debat.

væsentlig for argumentet om, at Y mikrodeletioner forårsager infertilitet, er observationen om, at frugtbare mænd sjældent manifesterer Y mikrodeletioner. Mikrodeletioner hos fire ud af 200 undersøgte frugtbare mænd er rapporteret (Pryor et al., 1997). Sletningerne hos disse mænd var imidlertid meget små og repræsenterede sandsynligvis ubetydelig polymorfisme. Relativt store sletninger af den art, der er forbundet med mandlig infertilitet, er ikke rapporteret hos mænd med normal fertilitet. Selvom det generelt antages, at disse sletninger opstår de novo, og at far til søn transmission af Y mikrodeletion ville ikke forventes, et par sjældne tilfælde af far til en søn transmission af Y kromosom mikrodeletion er rapporteret (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Imidlertid er vertikal transmission af en mikrodeletion, der involverer det slettede sted fra far til en søn, kun rapporteret i tre tilfælde (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Vi beskriver nu en fire-generations familie, hvor en asoospermisk far og hans fire ufrugtbare Sønner alle deler en tilsyneladende identisk mikrodeletion, der inkluderer das-locus. Denne familie repræsenterer den første og eneste rapport om spontan lodret transmission af Das-sletning til flere afkom. Det giver bevis for, at en enkelt YK-mikrodeletion kan resultere i varierende fænotypisk ekspression hos forskellige individer. Det er klinisk signifikant, idet tilstedeværelsen af en mikrodeletion ikke er en absolut markør for infertilitet og kan være forbundet med tilsyneladende normal fertilitet.

materialer og metoder

Screening for YK-mikrodeletion blev udført rutinemæssigt for mandlig infertilitet ved hjælp af en protokol, der blev gennemgået og godkendt af det institutionelle Gennemgangsudvalg For College of Physicians & kirurger, Columbia University. Prøver blev taget fra patienter efter informeret samtykke.

sædanalyse

resultaterne blev analyseret ved hjælp af hvem-kriterier med et Nikon-fasekontrastmikroskop.

serumhormonkoncentrationer

follikelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH) og testosteron blev målt ved fast fase, to-site kemiluminescerende immunometrisk analyse (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Normale intervaller for mænd er FSH <10 mIU/ml; LH < 10 mIU/ml; og testosteron 270-1070 ng/dl.

genomisk DNA

ekstraktion af genomisk DNA fra helblod blev udført ved lysis af røde blodlegemer efterfulgt af lysis af hvide blodlegemer og deres kerner. Cellulære proteiner blev fjernet ved saltudfældning, og genomisk DNA blev udfældet med isopropanol ved hjælp af Puregene DNA-ekstraktionssæt (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; katalognr. D-5004).

polymerasekædereaktion (PCR)

primere blev produceret som tørrede oligonukleotider på en automatiseret DNA-syntetisator (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). I alt 27 y kromosomspecifikke sekvensmærkede steder (STS) (Figur 1) blev valgt fra et STS-kort (Vollrath et al., 1992). De omfatter de tre foreslåede spermatogenese loci Asfa, Asfb og Asfc (som pr Vogt et al., 1996) med intervaller på 5, 6 og 7. Som en hurtig screeningsprotokol blev et PCR-multiplekssystem sammensat af to til seks forskellige primerpar anvendt i i alt seks multipleksede reaktioner (tabel i). Ved hver PCR-kørsel blev en kvindelig kontrol og en normal mandlig kontrol inkluderet. Alle PCR-reaktioner blev kørt i polycarbonatplader (Techne lart) i en MJ-forskningsmaskine. PCR-betingelserne var i det væsentlige som tidligere beskrevet (Henegariu et al., 1993). Kort sagt blev der i en 14-liters totalvolumenreaktion anvendt 50 ng genomisk DNA som skabelon, 1-liter primerstandardopløsning (blanding I eller II eller III eller IV eller V eller VI bestående af 10 pmol pr.primer), 12-liter `PCR-koldblanding’ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l af hver dNTP, 5% DMSO, 1-liter polymerasereaktionsbuffer uden Mg2+), 1,25 IE Tak DNA-polymerase (Promega) og 1 dråbe olie. De komplette blandinger blev anbragt direkte i en termocycler forvarmet til 94 liter C. Cykelbetingelser for 27 cyklusser var: 94 liter C, 30 s (smeltning); 55 liter C, 45 s (udglødning); og 72 liter C, 60 s (forlængelse). Den endelige forlængelsestid var 5 min. PCR-reaktionsprodukterne blev derefter adskilt på 3% agarosegeler (Bio-Rad, ultra-ren kvalitet) ved elektroforese i TBE-buffer. PCR-produkter blev farvet med ethidiumbromid og visualiseret ved udsættelse for ultraviolet lys. STS, der ikke viste nogen amplifikation i multipleksreaktioner, blev bekræftet ved PCR med en enkelt reaktion med passende positive og negative kontroller. En STS blev anset for at være fraværende efter tre forstærkningsfejl.

sydlig hybridisering

sydlig blotting blev udført i henhold til etableret protokol (Sambrook et al., 1989). Kort fortalt blev 5-genomisk DNA fordøjet med HindIII eller Taki, kørt på en 0,7% agarosegel i standard TBE-buffer, overført til en nylonmembran og hybridiseret med 32P-mærkede prober. Den rensede indsats af et plasmid (pDP1577) indeholdende cDNA i fuld længde (Reijo et al., 1995). Tilsvarende var RBM-sonden plasmidindsatsen af en RBM cDNA-klon (MK5) (Ma et al., 1993).

Faderskabsbestemmelse

faderskab af alle fire sønner blev bekræftet ved at vise den forventede adskillelse af fire stærkt polymorfe autosomale markører (Uber og maj, 1989). Disse var D21S156, D21S270, D13S132 og D13S159 med hhv.0,83, 0,86, 0,84 og 0,90.

fluorescerende in-situ hybridisering (fisk)

fisk til das blev udført med Cosmid 63c9 (Sachsen et al., 1996), ved hjælp af etablerede metoder (Yu et al., 1996).

resultater

Probanden (individuel III 8 i figur 2) og hans ægtefælle (III-9) præsenteret for reproduktiv-endokrinologi-Infertilitetsklinikken ved Columbia-Presbyterian Medical Center med klage over primær infertilitet i 3 år. Test afslørede normale karyotype-og normale serumhormonniveauer, mens sædanalyser viste alvorlig oligosospermi (tabel II). Mikrodeletionsscreening ved STS-baseret PCR afslørede tilstedeværelsen af en mikrodeletion i underinterval 6D–6F af Y-kromosomet lang arm (Figur 1). Under diskussionen rapporterede proband, at hans to ældre brødre (III-4 og III-6) var kendt for at være asoospermiske og ufrugtbare. Efterfølgende oparbejdning afslørede, at alle tre brødre havde en tilsyneladende identisk mikrodeletion. Testikelbiopsi udført på en af dem (III-6) viste `Sertoli kun celle’ syndrom.

fundet af mikrodeletion hos tre infertile brødre antydede, at deres far sandsynligvis ville bære den samme sletning. Der blev foretaget en detaljeret undersøgelse af resten af familien, der alle boede i en lille by i Den Dominikanske Republik. En komplet reproduktiv historie blev fremkaldt fra de voksne familiemedlemmer. De familieforhold, der er afbildet i stamtavlen (figur 2), blev bekræftet ved at vise den forventede adskillelse af flere autosomale polymorfe markører (data ikke vist) for de relevante familiemedlemmer (i-1, i-2, II-1, II-8 og II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Der var ingen tegn på ikke-faderskab. Grundige cytogenetiske undersøgelser af relevante familiemedlemmer (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 og IV-1) afslørede normale karyotyper. Sædanalyse blev udført i syv af de 16 mænd, og blodprøver blev opnået fra de fleste familiemedlemmer.

tabel II opsummerer resultaterne af sædanalyse og endokrin oparbejdning på relevante familiemedlemmer. Probanden (III-8), hans far (II-1) og to af hans tre brødre (III-4, III-6) viste sig at være enten asoospermisk eller alvorligt oligosospermisk. Probands ældste bror (III-1) afviste sædanalyse. Desuden blev probandens onkel (II-8) fundet at have asoospermi og forhøjet FSH med lavt testosteron. Som vist i Figur 1 blev proband, hans far og tre brødre alle fundet at have mikrodeletion af YK ved STS PCR-analyse. 3) og RBM (data ikke vist) prober bekræftede, at sletningen omfattede das-locus, men ikke RNA-bindingsmotivet (RBM) locus. FISKEANALYSE med Cosmid 63c9 (Sachsen et al., 1996) af probands fars (II-1) leukocytter viste ensartet fravær af Das-locus (figur 4).

konstateringen af, at individuel II-8 i stamtavlen var asoospermisk, men ikke havde en mikrodeletion, var en overraskelse. Denne person blev yderligere testet ved sydlig analyse ved hjælp af cDNA og en anden restriktion (Taki). Det kunne ikke vise nogen abnormitet i DAS locus. Derudover viste fisk med Cosmid 63c9 normal intensitet (data ikke vist).

Probanden (III-8) og hans ældre bror (III-6) søgte infertilitetsbehandling. Efter omfattende rådgivning valgte de in vitro befrugtning (IVF) og intracytoplasmisk sædinjektion (ICSI). Proband (III-8) og hans kone (III-9) gennemgik to IVF-ICSI-cyklusser, der ikke kunne producere en graviditet sekundært til dårlig ovarierespons. Probandens bror (III-6) og hans kone (III-7) gennemgik en cyklus med kontrolleret ovariehyperstimulering, og ni oocytter blev hentet. Elleve modne sædceller blev fundet i tre ejakulater på dagen for hentning og anvendt til ICSI. Tre oocytter befrugtet som efterfølgende spaltet og blev overført. Hun leverede en sund kvindelig baby (IV-2).

Diskussion

vi rapporterer en usædvanlig familie, hvor en asoospermisk far og hans fire ufrugtbare sønner deler en tilsyneladende identisk YK-mikrodeletion, der involverer das-locus. De-novo-mutationen, der førte til mikrodeletion af Das, ser ud til at have sin oprindelse i probandens far (II-1). Denne sletning forventes at forårsage oligosoospermi og mandlig infertilitet, og alligevel undfanget han spontant fem børn og var uvidende om noget fertilitetsproblem. Interessant nok er alle fire sønner ufrugtbare og er enten asoospermiske eller alvorligt oligosospermiske.

denne familie rejser flere problemer med hensyn til sammenhængen mellem YK mikrodeletion og infertilitet. For det første bekræfter det, at vertikal transmission af YK-mikrodeletion er mulig og kan føre til efterfølgende infertilitet hos de mandlige afkom. For det andet er det indlysende, at den samme sletning kan resultere i forskellige fænotyper hos forskellige individer. Selvom faderen (II-1) af de fire drenge i denne familie var asoospermisk på analysetidspunktet, blev han far til sit første barn i en alder af 25 år og hans sidste i en alder af 38 år. Således havde han en vis grad af frugtbarhed over en lang årrække. På samme måde indebærer mikrodeletion af Y-kromosomet ikke nødvendigvis en livslang historie med asoospermi, og det udelukker heller ikke dannelsen af en stor familie. Hans fire sønner er på den anden side ufrugtbare og enten asoospermiske eller alvorligt oligosospermiske.

das-genet er blevet foreslået som asoospermi-faktor på Y-kromosomet. Denne familie viser tydeligt, at selvom DSA kan have en kritisk rolle i spermatogenese, er det ikke afgørende for fertiliteten. Desuden kan totalt tab af GENKLYNGEN være forbundet med et histologisk billede af `Sertoli-celle kun’ såvel som sædmodningsarrest (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Flere forfattere har fundet en dårlig sammenhæng mellem placeringen af Y mikrodeletioner (inklusive das-sletninger) med den kliniske og histologiske fænotype af patienterne (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Resultaterne i denne familie er enige om, at en sådan sammenhæng kan vise sig at være ret problematisk. Testikulær biopsi af probands bror (III-6) viste et billede af `Sertoli-celle kun’, mens Probanden (III-8 med sædantal 0,5 liter 106/ml) klart ville forventes at have en vis grad af sædmodning på biopsi. Desuden er testikelbiopsi muligvis ikke repræsentativ for hele testiklen, fordi der kan være geografisk heterogenitet for spermatogenese som i individuel III-6, hvis ejakulater indeholdt modne sædceller.

vi kan kun spekulere om grundlaget for fænotypiske forskelle mellem familiemedlemmer med samme sletning. Det er velkendt, at identiske sletninger inden for autosomer kan resultere i forskellige fænotyper (Schinsel, 1994). Man kan postulere, at sådanne forskelle er konsekvenser af hver enkelt persons eksponering for sit miljø eller udtryk for forskellige modificerende gener. En frugtbar far er blevet beskrevet med en mikrodeletion, der udvides, når den overføres til sin infertile søn (Stuppia et al., 1996). Selvom variable udvidelser ved sletningens grænser kan eksistere mellem vores forskellige familiemedlemmer, kan disse molekylære udvidelser ikke skelnes ved intervallkortlægning. Ved PCR-analyse kunne den samme STSs ikke forstærkes i vores fem individer, og sydlig hybridisering med das-sonden bekræftede en fuldstændig sletning af denne genklynge. Selvom det er muligt, at de observerede sletninger faktisk ikke er identiske, og tilstødende områder kan indeholde vigtige gener, der modulerer graden af fænotypisk ekspression, indikerer disse resultater stadig en stor overlapning af slettet y-DNA (inklusive tabet af Das-genklynge) i hvert individ af denne unikke familie.

vi var fascineret af det faktum, at probandens onkel (II-8) har infertilitet og asoospermi, men ingen tilsyneladende mikrodeletion ved STS-test. Da southern blot-analyse ved hjælp af både RBM-og Das-prober samt FISKEANALYSER ved hjælp af en das cosmid alle var helt normale, vi er tvunget til at konkludere, at han har en anden ætiologi, der ligger til grund for hans infertilitet. Det er ganske vist muligt, at han kan have en mindre eller punktmutation/forstyrrelse eller proksimal/distal omlejring, der ikke kan påvises ved nuværende metoder. Han gav ingen historie med eksponering for gonadotoksiner eller andre definerbare faktorer, der sandsynligvis ville påvirke spermatogenese.

indtil for nylig har y mikrodeletion haft ringe klinisk betydning, da en mand med sletning generelt ikke vil reproducere. Ved hjælp af ICSI og testikelsperma aspiration (TESA) kombineret med IVF er det nu muligt for oligo/asoospermiske mænd med Y mikrodeletion at opnå graviditeter (Mulhall et al., 1997; Silber et al. 1998 og individuel III-6). Dette har skabt bekymring for, at sådanne graviditeter kan producere mandlige afkom med lignende mikrodeletioner og efterfølgende infertilitet (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Faktisk kan YK-mikrodeletion overføres til mandlige afkom via ICSI (Kent-First et al., 1996). Den familie, vi rapporterer, antyder, at mænd med YK-mikrodeletioner (såsom individuel II-1), der opnår graviditeter, overfører den samme mikrodeletion og risikoen for infertilitet til deres sønner (individer III-1, III-4, III-6, III-8). Patienter bør derfor tilbydes y-mikrodeletionsscreening før ICSI, og de bør rådgives om sikkerheden ved overførsel af YK-mikrodeletion og muligvis infertilitet til deres sønner. Da mere forskning er fokuseret på genetiske ætiologier af mandlig infertilitet, bør identifikation af gener involveret i spermatogenese give indsigt i patofysiologien ved mandlig infertilitet og et mere rationelt grundlag for at starte terapi.

vi takker familierne for deres samarbejde i undersøgelsen; Dr David C. Page for at levere cDNA-sonden og hans uvurderlige hjælp med dette manuskript; Dr Kun Ma for at levere MK5 (RBM1) cDNA-sonden; Dr. Peter Vogt for DNA fra mikrodeleterede individer, der blev brugt til at validere vores STS PCR-metode; og C. C. Yu og Patricia Lansano for deres uvurderlige tekniske assistance.

denne undersøgelse blev delvist finansieret af Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Personalepriser.