skjult i almindeligt syn–meget rigeligt og forskelligt planktonisk ferskvandsklorfleksi

overflod og mangfoldighed af phylumchlorfleksi i ferskvandsmiljøer

baseret på 16S rRNA Læs overflod fra 117 metagenomer fra søer, reservoirer og floder, repræsentanter for phylumchlorfleksi udgjorde op til 7% af phylumchlorfleksiens samlede mængde prokaryotisk samfund i epilimnion (fig. 1a, b) dog med store udsving. I lighed med tidligere observationer dominerede CL500-11-slægten hypolimnionprøver (nåede mindst 16% i alle undtagen en prøve og næsten 27% i en prøve fra Biva-søen) (Fig. 1c), bortset fra en mindre kendt gruppe kaldet tk10-klyngen. Størstedelen af TK10-relaterede 16S rRNA-sekvenser i SILVA-databasen stammer fra jord, menneskelig hud eller ukendte metagenomiske prøver, mens kun fire (1,5%) er fra ferskvand (yderligere fil 1: Figur S1A).

overraskende blev epilimnion-prøverne domineret af sekvenser tilknyttet “SL56 marine group” (op til ca. 5% af det samlede prokaryote samfund). SL56-relaterede sekvenser af SILVA er blevet genvundet fra en ferskvandssø og Global Ocean Series datasæt (GOS) . GOS-prøven, hvorfra de blev beskrevet, er imidlertid faktisk et ferskvandsdatasæt, Lake Gatun (Panama). Det fremgår tydeligt af vores resultater (Fig. 1; yderligere fil 1: Figur S2), at denne klynge konsekvent kun findes i søer, reservoirer og floder, men ikke i det marine habitat, hvilket antyder, at det forkert er blevet omtalt som en “marine gruppe.”En anden gruppe af sekvenser, kaldet JG30-KF-CM66, beskrevet fra forskellige miljøer (uranmineaffaldsbunke, jord, ferskvand, havvandssøjle og sediment), viste sig at være fortrinsvis fordelt i floder (især floden amason) end søer (Fig. 1a, b), omend ved meget lave mængder (maksimalt 1% af de samlede prokaryoter). Lignende overflod blev fundet i det Brakke Kaspiske Hav (dybder 40 m og 150 m) (yderligere fil 1: Figur S2).

vi kunne dog ikke finde nogen støtte til tilstedeværelsen af hverken SAR202-klyngen eller dens ferskvandssøster clade CL500-9 i alle undersøgte ferskvandsmetagenomiske datasæt. I marine og Brakke levesteder findes SAR202 næsten udelukkende i de mørke afotiske lag, hvor de tegner sig for op til 30% af det prokaryote samfund . Hvis der er SAR202-relaterede klader i ferskvandshabitater, er de bestemt ikke meget rigelige eller stammer måske ikke fra vandkolonnen i den oprindelige rapport (yderligere fil 1: Figur S1). Samlet set, selvom relative mængder Klorofleksi i ferskvandspilimniaen er langt lavere end i de dybere farvande, de er hjemsted for en rig og udbredt samling af nye grupper.

med disse observationer er det også tydeligt, at i de vandmiljøer, der undersøges her (ferskvand, brak og hav), er mangfoldigheden af Klorofleksirepræsentanter væsentligt anderledes, idet ferskvandsmiljøerne huser et fylogenetisk mere forskelligt sortiment af grupper end enten brak eller hav. Desuden er der klare beviser for tilstedeværelsen af ferskvandsgrupper (f. eks., SL56) og marine og Brakke kun grupper (SAR202), der gentager, at saltholdighed er en barriere mod mikrobielle habitatovergange mellem ferskvand og marine økosystemer . Det er på ingen måde en uoverstigelig barriere som relativt nylige overgange fra ferskvand til marine (f.eks ferskvand “Ca. Methylopumilus spp.”og marine OM43 ) og omvendt (marine Pelagibacter og ferskvand LD12) er begge blevet foreslået. Det er dog sandsynligt, at de grupper, der findes i Brakke miljøer, måske simpelthen er bedre “primet” til mere vellykkede strejftog. Vi finder eksempler på grupper, der er til stede i ferskvand og brak metagenomer (JG30-KF-CM66 og CL500-11).

de største repræsentanter for ferskvandsklorfleksi

automatiseret binning af Chlorfleksirelaterede contigs fra samlinger af hvert 57 datasæt, der tilhører 14 forskellige miljøer (28 søer/reservoirer, 26 floder og 3 brak datasæt) resulterede i adskillelse af 102 MAGs (metagenomsamlede genomer) i alt (yderligere fil 2: Tabel S1). Fylogenomisk analyse af MAGs med 30% eller højere fuldstændighed (n = 53) viser, at en bemærkelsesværdig høj mangfoldighed af MAGs blev genvundet fra praktisk talt alle kendte Chlorfleksiklasser (Fig. 2). Femogtredive MAGs udgjorde tre separate nye klasseniveauer uden tilgængelige kultiverede repræsentanter (SL56, TK10 og JG30-KF-CM66).

mens fluorescens in situ hybridisering efterfulgt af katalyseret reporteraflejring (KORTFISK) detekterede et stort antal af CL500-11-cellerne i epilimnion-søen under delvis blanding om vinteren blev der altid fundet maksimale overflodniveauer i dybere områder i begge Lake (op til 11% af alle prokaryoter; Fig. 3a) og Biva-søen (op til 14%; Fig. 3d). Cl500-11 overflod korreleret negativt med både temperatur og klorofyl en koncentration (yderligere fil 1: Figur S3). I Krosimov-Reservoirprøver var CL500-11 imidlertid under detektionsgrænsen (< 0,18%), hvilket antyder, at dette relativt lave habitat (maksimal dybde 43 m) ikke repræsenterer en foretrukken niche for denne gruppe af bakterier (yderligere fil 1: Figur S4). CL500 – 11 celler er tidligere blevet visualiseret af KORTFISK og vist sig at være store, buede celler . Lignende former og størrelser blev observeret i FISKEPRØVER fra søen med gennemsnitlige længder på 0,92 liter (område 0,4–1,6 liter; n = 277) og bredder på 0,28 liter (område 0,19–0,39 liter). Analyse af cellevolumener (median 0.06 liter 3) og biomasse til denne klynge i sammenligning med alle prokaryoter (Fig. 3c) foreslår et ekstremt højt bidrag fra cl500-11-populationen til den samlede mikrobielle biomasse. Deres biomasse til overflodsforhold er næsten 2, dvs.ved 10% overflod udgør de næsten 20% af den samlede prokaryote biomasse, hvilket indikerer en bemærkelsesværdig tilpasning til den relativt oligotrofe dybe hypolimnion og opnår høje populationer selv med deres store cellestørrelser.

vi genvundet 11 MAGs (10 ferskvand, 1 brak) for CL500-11 I alt. Alle fire MAGs af søen Biva fra forskellige måneder danner en enkelt art. De to arter fra Lake Michigan ser imidlertid ud til at eksistere sammen hele året (marts, maj og November) med en art, der forgrener sig sammen med den tidligere beskrevne MAG fra Lake Michigan (CL500-11-LM) og de andre arter, der også har nære repræsentanter i det Brakke Kaspiske (> 95% ANI) og lignende metagenomiske fragmentrekrutteringsmønstre (Fig. 2 og 4c). Vi foreslår kandidat slægten Profundisolitarius (Pro. fun. di. so. li. ta’ri.us. L. adj. profundus dyb; L. adj. solitarius alene; N. L. masc. n. Profundisolitarius en eneste eneboer fra dybet) inden Candidatus Profundisolitariaceae fam. nov. til cl500-11-klyngen (klasse Anaerolinea).

på den anden side er SL56-gruppen den dominerende Slægt i Krisimov-reservoiret (maksimalt 1.1%), både ved 16S rRNA og kort-fisk analyser (Fig. 1 og 3). Maksimal overflod blev næsten altid fundet omkring 5-20 m ved temperaturer på ca. 15 C, hvilket tyder på, at denne gruppe primært er epilimnetisk (yderligere fil 1: figurer S3 og S4). Denne region af vandkolonnen (termoklin), bortset fra at have en temperaturgradient, har også signifikant lavere lysintensitet sammenlignet med overfladelag. 13 m dybde i de stratificerede sommerprofiler i søen falder sammen med den maksimale overflod af SL56 (yderligere fil 1: Figur S3). SL56 celler er stangformede og aflange (gennemsnitlig længde = 0,68 liter 0,25 liter; gennemsnitlig bredde = 0,35 liter 0,09 liter; n = 6; Fig. 3e). Så vidt vi ved, er dette den første rapport fra en ferskvandsspecifik Chlorfleksigruppe, der ser ud til at trives i epilimnion.

i alt 14 MAGs blev genvundet for SL56 klynge (1 indeholdende 16S rRNA) og danner en klasse-niveau afstamning, betydeligt divergerende fra alle kendte Chlorfleksi (Fig. 2). Deres eneste slægtning er en enkelt MAG (Chlorfleksi CSP1-4) beskrevet fra akvifersediment . 16S rRNA clade, som CSP1-4 angiveligt er tilknyttet , er Gitt-GS-136, og størstedelen af sekvenser i denne clade stammer fra enten jord-eller flodsedimenter (information fra SILVA taksonomi). Vi var imidlertid ikke i stand til at detektere nogen 16S rRNA-sekvens (delvis eller komplet) i den tilgængelige genomsekvens af CSP1-4. Den næste nærmeste clade (i 16S rRNA taksonomi) til Gitt-GS-136 og SL56 er KD4-96, hvis sekvenser blev opnået fra de samme levesteder (se yderligere fil 1: Figur S1B). Derudover stammer alle kendte 16S rRNA-sekvenser fra SL56-gruppen kun fra ferskvand (Lake Gatun, Lake Surich osv.). Samlet set ser det ud til, at de nærmeste fylogenetiske slægtninge til ferskvands SL56-slægten beboer jord-eller sedimenthabitater.

SL56 MAGs blev rekonstrueret fra geografisk fjerne steder (Europa, Nord-og Sydamerika, Fig. 2), og mindst ni forskellige arter kunne påvises (ANI, Fig. 1). Der blev ikke opnået nogen MAGs fra Biva-prøver, men tre 16S rRNA-sekvens blev hentet i ubundne contigs. De rekonstruerede MAGs distribueres globalt langs ferskvandsdatasæt fra epilimnion (ingen påvist i den dybe hypolimnion) (Fig. 4 og yderligere fil 1: Figur S6). Ingen SL56 MAGs blev rekonstrueret fra Det Kaspiske Hav, og ingen af de genvundne genomer rekrutteret fra Brakke metagenomer. Vi foreslår kandidat slægten Limnocylindrus (Lim.no.cy.lin ‘ Drus. Gr. fem. n. limne en sø; L. masc. n. cylindrus en cylinder; N. L. masc. N. Limnocylindrus en cylinder fra en sø) inden Limnocylindraceae fam. nov., Limnocylindrales ord.nov. og Limnocylindria classis. nov. til Klorofleksi SL56-klyngen.

TK10 16S rRNA-sekvenser blev fundet ved højeste overflod i hypolimnion-prøver (maksimum ca. 2%) (Fig. 1a, c). Celler var ovoide med en estimeret længde på 1,08 liter 0,1 liter og bredde på 0,84 liter 0,09 liter (n = 12; Fig. 3e). En sammenhængende klynge af ni MAGs (tre indeholdende 16S rRNA yderligere fil 1: Figur S1) fra geografisk fjerne steder (Europa, Asien og Nordamerika) blev genvundet. Disse bemærkelsesværdigt kosmopolitiske organismer, der trives i dybere sølag, er ikke meget forskellige (ANI-værdier > 95%). Denne tilsyneladende lave mangfoldighed kan være en konsekvens af en meget specialiseret niche eller hvad der er mere sandsynligt, et resultat af en relativt nylig overgang til ferskvand, svarende til “Ca. Fonsibacter ” (LD12 Alphaproteobacteria) . Ingen 16S rRNA-repræsentanter blev påvist fortroligt i marine eller Brakke metagenomer, selvom nogle 16S rRNA-sekvenser af SILVA-databasen er opnået fra marine sedimenter og vandkolonne (yderligere fil 1: Figur S1). Nærmeste slægtninge fra 16S rRNA ser ud til at være enten fra jord eller fra sedimentprøver, der antyder, at disse kan være deres oprindelige habitat. Interessant nok er tk10-klyngen også dyb forgrening, først efter SL56 og CSP1-4 i Chlorfleksiens fylogenetiske træ som helhed, og alle andre Chlorfleksirepræsentanter (MAGs eller isolatgenomer) ser ud til at stamme fra en gren, der er forskellig for begge disse. Vi foreslår kandidat slægten Umbricyclops (Um.bri.cy ‘ clops.L. fem. N. umbra skygge; L. masc. n. cyclops(fra Gr. Runde øje; Cyclops) en cyclops; N. L. masc. n. Umbricyclops et rundt øje, der lever i skyggen) inden for Umbricyclopaceae fam. nov., Umbricyclopales ord.nov., og Umbricyclopia classis nov. for denne gruppe af organismer.

KORTFISKRESULTATER viser, at jg30-KF-CM66 celler er sfæriske med en estimeret diameter på 0,56 liter (0,15 liter; n = 8; Fig. 3e); imidlertid blev der observeret meget lave andele (< 0,28%) for JG30-KF-CM66 i søen og Lysimov Reservoir dybdeprofiler (yderligere fil 1: Figur S3 og S4). Vi opnåede 12 MAGs, hovedsagelig fra dybvandssøjlen (otte brak, fire ferskvand), en med en næsten komplet 16S sekvens, der dannede en ny klasse-niveau afstamning i fylogenomisk analyse (Fig. 1). De nærmeste slægtninge til disse MAGs er marine SAR202 og Dehalococcoidea (Fig. 1 og yderligere fil 1: Figur S1). Inden for denne klynge kan der skelnes mellem forskellige grupper af brak-og ferskvandsmag. Vi foreslår kandidat slægten Bathosphaera (Ba.tho.sphae ‘ ra. Gr. adj. bathos dyb; L. fem. n. sphaera en kugle; N. L. fem. n. Bathosphaera a coccoid bakterier, der lever i dybden) inden for Bathosphaeraceae fam. nov., Bathosphaerales ord.nov. og Bathosphaeria classis. nov. til Klorofleksi jg30-KF-CM66-klyngen.

vi gendannede også MAGs i klasserne Chlorofleksi (fire MAGs) og Caldilineae (to MAGs) (Fig. 1). Chlorfleksi-MAGs var relateret til mesofil Oscillochloris trichoides DG-6 i underordre Chlorfleksineae (en MAG) og tre andre MAGs til kouleotrichaceae aurantiaca i kouleotrichaceae fam. nov. danner en ny underordre, som vi foreslår navnet Kouleothrichniae underordre. nov. Ingen af disse MAGs viser nogen væsentlig fragmentrekruttering bortset fra deres oprindelsessted. Yderligere 14 MAGs fra kaspien tilknyttet SAR202-klyngen, som ikke vil blive diskuteret yderligere her, som de allerede er beskrevet .

ferskvandschlorfleksibidrag i økosystemfunktion

metabolisk indsigt i de rekonstruerede Chlorfleksim-MAGs (fuldstændighed 30%) antyder en primært heterotrofisk livsstil, som i nogle grupper forstærkes af lysdrevet energiproduktion via enten rhodopsiner (CL500-11, Chlorfleksaler, SL56 og TK10) eller aerob anoksygenisk fototrofi (Chlorfleksaler). MAGs af hver klynge indeholder nødvendige gener til central kulhydratmetabolisme, herunder glycolyse, glukoneogenese og tricarbonsyrecyklus. Nøglegener til assimilatorisk sulfatreduktion (3′-phosphoadenosin 5′-phosphosulfat (PAPS) syntase og sulfatadenylyltransferase) var fraværende i de fleste MAGs, hvilket antydede anvendelsen af eksogene reducerede svovlforbindelser . Denitrifikationsgener (nitratreduktase / nitritoksidoreduktase alfa-og beta-underenheder og nitritreduktase) blev fundet i Tk10-MAGs, men de efterfølgende stoffer, der var ansvarlige for produktionen af molekylært nitrogen, var fraværende.

i vandmiljøer er Thaumarchaeota og cyanobakterier den vigtigste kilde til cobalamin og dets corrinoide forløbere for det store samfund af hjælpestoffer eller de få, der er i stand til at redde . De novo syntese af cobalamin har en høj metabolisk pris, og den sorte Dronninghypotese er blevet fremsat som en forklaring på, hvorfor kun få medlemmer af samfundet foretager sin produktion . Ingen af de rekonstruerede Chlorfleksimags koder for nødvendige gener til corrinringbiosyntese fra bunden, og cobalamin med høj affinitet (BtuBFCD) eller andre mistænkte corrinoid (det1174-det1176) transportører manglede også, hvilket kan være en konsekvens af genomets ufuldstændighed eller anvendelse af en ubeskrevet transportør. Imidlertid synes ikke alle disse organismer at være hjælpestoffer som MAGs af JG30-KF-CM66 klyngekodegener for cobinamid til cobalamin bjærgningsvej, der bruger importerede corrinoider sammen med mellemprodukter fra riboflavin biosyntesevejen til at syntetisere cobalamin . H-chlor-G3 mag indeholder en næsten fuldstændig cobalamin bjærgning (kun manglende CobC) og riboflavin biosyntesevej (yderligere fil 3: Tabel S2).

flagellære samlingsgener var til stede i flere MAGs af cl500-11 og TK10 klynger (Fig. 1 og yderligere fil 3: Tabel S2). Imidlertid manglede l – og P-ringkomponenterne, der forankrer flagella til den ydre membran , i alle flagellerede MAGs og referenceklorfleksigenomer (f.eks. Derudover koder MAGs og referenceklorfleksigenomer ikke gener til LPS–biosyntese, og der blev ikke påvist nogen sekretionssystemer bortset fra Sec og Tat (type I-IV-sekretionssystemer, der er forankret i den ydre membran, er fraværende) (yderligere fil 3: Tabel S2). Samlet set styrker den komparative genomik af tilgængelige Chlorfleksigenomer slutninger om, at mens elektronmikrografer antyder to elektrontætte lag i de fleste medlemmer af denne fylum, har Chlorfleksi sandsynligvis en enkelt lipidmembran (monoderm) snarere end to (didermer) .

Rhodopsin-lignende sekvenser blev genkendt i 18 MAGs af denne undersøgelse fra repræsentanter for CL500-11, Chlorofleksi, SL56 og TK10, der er fylogenetisk tættest på hsantorhodopsin (yderligere fil 1: Figur S8A og B), og er indstillet til at absorbere grønt lys svarende til andre ferskvands-og kystnære rhodopsiner (yderligere fil 1: Figur S8C). Flere MAGs koder gener for carotenoidbiosyntese, der tillader muligheden for en carotenoidantenne, der er kendetegnende for ksantorhodopsiner . Af de rester, der er involveret i binding af saliniksantin (den overvejende carotenoid af Salinibacter ruber), fandt vi et overraskende højt antal konserveret (10 identiske ud af 12 i mindst en rhodopsinsekvens) (yderligere fil 1: Figur S8D), hvilket antyder, at en carotenoidantenne kan være bundet, hvilket i det mindste gør nogle af disse sekvenser bonafidksantorhodopsiner.

selv repræsentanter for CL500-11 og TK10, der primært findes i hypolimnion under stratificering, er i stand til fototrofi; de kan dog potentielt få adgang til det fotiske område om vinteren og det tidlige forår. Bortset fra rhodopsin-baseret fotoheterotrofi hentede vi også MAGs af klassen Chlorofleksi, der koder for gener til fotosystem type II reaktionscenterproteiner L og M (pufL og pufM), bakteriochlorophyll og carotenoidbiosyntese. PufM-gensekvenserne klynger sig sammen med andre Chlorfleksirelaterede pufM-sekvenser (yderligere fil 1: Figur S9). Imidlertid, ingen beviser for kulstoffiksering, via enten 3-hydroksipropionatvejen eller Calvin–Benson-cyklussen blev fundet i ethvert fotosystem, der bærer MAG, hvilket kan være en konsekvens af MAG ufuldstændighed. Det kan også være, at disse er aerobe anoksygeniske fototrofer, der ikke fikserer kulstof, f .eks.

evolutionær historie af pelagisk Chlorfleksi

det fremgår af de fylogenomiske analyser, at samlingen af repræsentanter for phylum Chlorfleksi genvundet i dette arbejde sammen med de eksisterende genomsekvenser fra isolater og MAGs, tilbyder kun en delvis skitse af den komplekse evolutionære historie af phylum som helhed. For eksempel er de mest divergerende grene “Ca. Limnocylindria “(sl56 klynge) og ” Ca. Umbricyclopia “(tk10-klynge) har praktisk talt ingen tæt hud bortset fra en akvifersedimentmag (relateret til ” Ca. Limnocylindria”). Imidlertid er relaterede 16S rRNA-kloner blevet genvundet fra jord/sedimenter for begge disse grupper, hvilket tyder på overgange til en pelagisk livsstil (yderligere fil 1: Figur S1B).

Factoring af fraværet af relaterede marine 16S rRNA-sekvenser for disse grupper ud over deres uopdagelighed i marine metagenomiske datasæt antyder også en herkomst fra jord/sediment snarere end saltvandsmiljøet. Selv om muligheden for en marin oprindelse ikke formelt kan udelukkes, forekommer retningen af en overgang fra jord/sediment til ferskvandsvandssøjler mest sandsynligt. I betragtning af at ” Ca. Limnocylindria ” og ” Ca. Umbricyclopia ” afviger forud for divergensen mellem klasserne Dehalococcoidea og marine SAR202 (klasse “Ca. Monstramaria”), som er den eneste økologisk relevante marine Klorofleksi, der endnu er kendt (førstnævnte i marine sedimenter og sidstnævnte i dybhavs vandsøjle), er det sandsynligt, at forfædres Klorofleksi stammer fra et jord/sedimenthabitat. Succesen med marine SAR202 i de dybe oceaner er bemærkelsesværdig; det er den mest udbredte, måske numerisk mest rigelige Chlorfleksigruppe på planeten. Imidlertid er nogle 16S rRNA-sekvenser fra dets nærmeste slægtninge, Dehalococcoidea, også blevet genvundet fra Ferskvandssedimenter, selvom langt størstedelen ser ud til at være fra dybe marine sedimenter (begge anoksiske levesteder).