sammenlignende måling af CNP og NT-proCNP i humane blodprøver: en metodologisk evaluering

introduktion

C-type natriuretisk peptid (CNP), identificeret i 1990 af Sudoh et al., er det ældste medlem af den natriuretiske peptidfamilie . CNP stimulerer selektivt den humane natriuretiske peptidreceptor 2 (NPR2), som aktiverer den cGMP-afhængige kinase (cGK) ved at hæve den intracellulære koncentration af cGMP . Derudover binder CNP NPR3 og deaktiverer igen proteinkinase A ved Gi-proteinafhængig inhibering af adenylatcyclase . CNP har anti-proliferative og anti-migrerende egenskaber og blev også identificeret som en endotel afledt afslappende faktor . Desuden hæmmer CNP neointimal restenose, reducerer vaskulær constrictive remodeling og hjerte iskæmi-reperfusion skade . CNP spiller en vigtig rolle i knoglevækst, reproduktion, nervevækst, reendotelisering samt nyre -, bugspytkirtel-og hjertefunktion . Derudover er CNP for nylig blevet anerkendt for at være involveret i udviklingen af aterosklerotisk plakdannelse .

på grund af overflod af CNP-funktioner har dette peptid opnået stigende interesse for kardiovaskulær forskning i de seneste år. Undersøgelser vedrørende CNP-koncentrationer i blodprøver er imidlertid inkonsekvente. Nogle af disse undersøgelser målte koncentrationer af CNP eller dets amino-terminale pro-peptid (NT-proCNP) i serumprøver, og andre anvendte plasmaprøver . Desværre er detaljer om potentielle forsinkelser under blodprøveudtagning og efterfølgende prøvebehandling endnu ikke rapporteret. I den hidtil tilgængelige litteratur findes der ingen data om forskellen mellem CNP/NT-proCNP-koncentrationer mellem serum-og plasmaprøver. Indflydelsen af forsinkelsen af blodprøvebehandling forbliver også uklar. Derudover varierede CNP-koncentrationen i serum-og plasmaprøver markant (tabel 1). Derfor var formålet med denne undersøgelse at besvare følgende metodologiske spørgsmål: (1) forårsager forsinket behandling af blodprøverne, der opbevares ved stuetemperatur, bias? (2) er der nogen forskel mellem serum-og plasmakoncentrationer af CNP eller NT-proCNP? (3) er disse forskelle tidsafhængige?

metoder

vi studerede 12 mandlige frivillige (gennemsnitsalder 29 kg 2 år, normalvægt, ingen lægemiddelterapi, ingen historie med hjerte-kar-sygdomme eller andre sygdomme, 3 rygere). Fra alle undersøgte forsøgspersoner blev informeret samtykke opnået. Tripletter af fastende blodprøver blev taget fra alle frivillige klokken 8 om morgenen. Blodprøver blev opsamlet ved hjælp af 7,5 ml s-Monovette-opsamlingssystemet (Sarstedt, N–Pristmbrecht, Tyskland) indeholdende enten koagulationsaktivator (Kaolin) til serumprøver, natriumcitrat til plasmaprøver eller kalium-EDTA til fuldblodsprøver. Alle prøver til baseline-analyser blev straks centrifugeret ved 2.000 liter g i 10 minutter ved 4 liter C og supernatant blev opbevaret ved -70 liter C indtil analyse. Til midtvejsanalyser (30 minutter eller 2 timer) blev plasmaprøverne centrifugeret ved 2.000 liter g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten blev fjernet og opbevaret ved stuetemperatur i 30 minutter eller 2 timer. Efter blodkoagulation blev serumprøver behandlet identisk med plasmaprøver. Supernatant blev gemt og også opbevaret ved stuetemperatur i 30 minutter eller 2 timer. Fuldblodsprøver blev opbevaret ved stuetemperatur uden centrifugering. Efter 30 minutter eller 2 timer blev fuldblodsprøver centrifugeret ved 2.000 liter g i 10 minutter ved 4 liter C. Supernatant blev fjernet og opbevaret ved -70 liter C indtil analyse. Koncentrationen af CNP blev målt ved hjælp af CNP – 22 EIA Kit (#EK-012-03, Føniks Pharmaceuticals, Karlsruhe, Tyskland) i henhold til producentens protokol. NT-proCNP-koncentrationen blev målt ved hjælp af NT-proCNP EIA-kittet (Biomedica, Vienna, Østrig) i henhold til producentens protokol. Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning mellem grupper. Til parvise sammenligninger blev t-testen anvendt. Data vises som middel til standardafvigelse (SD) eller 95% konfidensinterval (95%-CI). Statistisk signifikans blev antaget ved p < 0,05. Data blev analyseret ved hjælp af MedCalc for vinduer, Version 10.0.1.0 (MedCalc, Mariakerke, Belgien).

resultater

som vist i figur 1a var baseline-koncentrationer af CNP i serum -, plasma-og fuldblodsprøver henholdsvis 0,997 liter 0,379 ng/ml, 1,933 liter 0,699 ng/ml og 0,991 liter 0,489 ng/ml. Plasmakoncentrationerne af CNP var signifikant højere sammenlignet med serum-og fuldblodsprøver på alle tidspunkter (ANOVA, p = 0,001 ved baseline, p < 0,001 ved 30′ min. og p = 0,003 ved 120 ‘ min.). Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem serum-og fuldblodsprøver på noget tidspunkt (ANOVA, p > 0, 05). Baselinekoncentrationer af NT-proCNP i serum -, plasma-og fuldblodsprøver var henholdsvis 58,5 g 28,3 g/ml, 60,3 g 23,9 g/ml og 50,7 g 21,4 g/ml (figur 1b). Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem grupperne på noget tidspunkt (ANOVA, p > 0,05). I fuldblodsprøver steg koncentrationen af lactat signifikant efter 2 timer sammenlignet med baseline-værdien (3,2 liter 0,8 mM vs. 2,0 liter 0,6 mM, p < 0,001). Derudover faldt pH-værdien fra 7,34 liter 0.03 ved baseline til 7,29 g 0,03 efter 2 timer (p < 0,001).

Diskussion

vores undersøgelse afslørede, at CNP og NT-proCNP er stabile i serum og i fulde blodprøver i mindst to timer ved stuetemperatur. Følgelig påvirkes stabiliteten af CNP-peptidet sandsynligvis ikke af nogen forsinkelse i prøvebehandlingen i mindst to timer. ProCNP er allerede rapporteret (producentens protokol, ukendte opbevaringsbetingelser for blodprøver) for at være stabile i mindst 2, 5 timer. Følgelig bekræftede vores eksperimenter stabiliteten af NT-proCNP selv ved stuetemperatur. Koncentrationen af NT-proCNP i alle prøvetyper forblev konstant i løbet af tidsforløbet i op til 2 timer, hvilket indikerer langvarig stabilitet af dette protein. Som anført i tabel 1 er den gennemsnitlige koncentration af nt-proCNP (56,5 liter 24.3 pg/ml) målt i dette studie lå inden for det rapporterede interval (Se tabel 1) for raske individer (3,7-432 pg/ml).

i modsætning til NT-proCNP var koncentrationen af CNP signifikant højere i plasmaprøver sammenlignet med serum-og fuldblodsprøver (Figur 1). Indtil videre fandt hverken vores gruppe eller fabrikantens tekniske service noget bevis for indflydelsen af prøvetype på ELISA-analysen, der blev brugt i denne undersøgelse. Ved baseline var supernatant af plasma og fuldblodsprøver imidlertid identiske med undtagelse af den anvendte type blodkoagulationsinhibitor. Denne hæmmer var natriumcitrat i plasmagruppen og EDTA i gruppen med fuld blodprøve. Fuldblodsprøver viste sammenlignelige resultater med serumprøver (p = 0,98). Det er derfor højst sandsynligt, at natriumcitrat i væsentlig grad kan påvirke den målte koncentration af CNP i plasma og følgelig forfalske de resultater, der opnås ved denne teknik.

uventet var baseline-koncentrationer af CNP i både plasma-og serumprøver ca .tusind gange højere end i andre rapporter (tabel 1). I alle disse undersøgelser blev Radioimmunoassay (RIA-Kit) anvendt til bestemmelse af CNP-koncentrationer. I modsætning hertil var de målte CNP-koncentrationer i serum-og plasmaprøver i to andre undersøgelser sammenlignelige med vores resultater med hensyn til størrelsen af dimensionen . Interessant nok blev det samme ELISA-Kit i sidstnævnte undersøgelser brugt som i vores undersøgelse. Selv efter omfattende evaluering af forskellige interne og eksterne faktorer kunne der ikke findes nogen tilfredsstillende forklaring på denne uoverensstemmelse. Kontrolmålinger ved anvendelse af eksogen CNP i humant serum afslørede en ikke-signifikant målefejl på +7,8% (95%-KI: –). CNP-peptidet, der blev anvendt til referencekurven, blev syntetiseret af producenten selv (Føniks). I modsætning hertil blev CNP-peptidet anvendt som den “eksogene” kontrol tilvejebragt af Bachem. Som sikret af begge producenter var sekvenser af aminosyrer identiske, og disulfidbindinger blev dannet i begge peptider.

resultaterne af interne kontrolmålinger kan dog opsummeres som følger: For det første viste de kontrolmålinger, der blev udført i vores undersøgelse, at ELISA-sætene blev brugt korrekt i overensstemmelse med producentens anvisninger. For det andet bekræftede målinger ved hjælp af kontrolprøver egnetheden af den anvendte standardkurve. For det tredje afslørede kontrolserumprøver indeholdende eksogen CNP acceptabel nøjagtighed, og resultaterne var inden for den forventede størrelsesorden. For det fjerde er en højere koncentration af CNP i plasmaprøver sandsynligvis en artefakt forårsaget af natriumcitrat.

som rapporteret af Clerico og kolleger er sammenligneligt store forskelle i resultater mellem forskellige RIA-og VVM-metoder også kendt for, f .eks. Clerico og kolleger konkluderede, at de store forskelle i disse resultater sandsynligvis skyldes specificiteten af monoklonale eller polyklonale antistoffer, der anvendes, designet af immunoassay system (competitive vs. non-competitive assay), den analytiske matrice (serum vs. EDTA vs. hepariniseret plasma) anvendt og overfloden af cirkulerende former for natriuretiske peptider, som tidligere rapporteret for ANP og BNP immunoassays . Disse metodologiske kilder til bias kan også tænkes for CNP-og NT-proCNP-analyser og forklarer således den store forskel i resultater i de citerede undersøgelser (tabel 1).

begrænsninger af undersøgelsen

vi anerkender, at en stikprøvestørrelse på 12 er for lille til at konkludere, at der slet ingen forskel er. Fra et statistisk synspunkt ville det imidlertid være vigtigt at specificere, hvor stor forskellen skal være for at være af medicinsk relevans. Så vidt vi ved, er sidstnævnte endnu ikke klart defineret. Derfor blev midlerne og 95% – konfidensintervallerne for alle foranstaltninger givet i figuren for at gøre det muligt for enhver læser at trække sin egen fortolkning ud fra dataene også.

med henvisning til serum-og plasmakoncentrationer skal det nævnes, at værdierne rapporteret i tabel 1 blev målt med forskellige metoder (RIA, ELISA) hos patienter, der lider af forskellige sygdomme. Det ville have været meget nyttigt at sammenligne CNP-RIA med CNP-ELISA-analyser direkte ved hjælp af de samme prøver, fordi en tusindfoldig forskel i størrelsesordenen forbliver mærkbar. Desværre var RIA-analysemålinger ikke tilgængelige i vores laboratorium. For NT-proCNP-koncentrationen blev sidstnævnte sammenligning undersøgt af Olney og kolleger, der viste, at den kommercielle ELISA (Biomedica Medisinprodukte GmbH & Co KG, Vienna, Østrig) gav værdier, der i gennemsnit var 21% (interval 11-52%) af RIA-værdierne. Krydsvalidering af referencestandarden for ELISA-kittet ved hjælp af RIA-analyse viste en uenighed på 15% .

Resume

målinger af CNP og NT-proCNP var sandsynligvis upåvirket af forsinkelse af prøveoptog eller type blodprøve (undtagen CNP i plasmaprøver). For plasmaprøver var kun EDTA antikoagulerede blodprøver egnede til CNP ELISA-analysen anvendt i denne undersøgelse. Derfor kan koncentrationen af CNP og NT-proCNP anvendes i kliniske anvendelser for at bestemme CNP-effekter. Det skal også overvejes, at koncentrationen af NT-proCNP, der kun er et biprodukt af det aktive peptid, kan skjule CNP ‘ s sande natur. Imidlertid, uoverensstemmelse i målte CNP-koncentrationer bestemt enten ved RIA-assays eller ved ELISA-assays forbliver stadig uforklarlig, men synes mest sandsynligt at skyldes metodologiske problemer. Derfor , som anbefalet til ANP og BNP, skal immunoassays for CNP også standardiseres eller harmoniseres i fremtiden.