Sådan udføres DNA-ekstraktion fra tørrede blodpletter ved hjælp af Cheleksharpiks

hver biovidenskabsmand, der ønsker at analysere DNA, ved, at processen begynder med ekstraktion af DNA fra celler af interesse. Disse celler kan være RBC ‘ er, parasitter eller bakterier for at nævne nogle få. Desuden er der forskellige DNA-ekstraktionsmetoder1 at vælge imellem afhængigt af prøvetype, nedstrømsanalyse og så videre. Mange forskere starter med tørrede blodpletter (DBS), og så hvordan man ekstraherer DNA fra sådanne prøver er af særlig interesse. En DBS fremstilles almindeligvis ved at samle blod på et tegnepapir FTA-kort2 eller Tegnepapir kromatografisk 3 mm filterpapir og lade det tørre i en periode (~4 timer) før behandling. Denne metode til bio-prøveudtagning er blevet brugt i årtier.

en nyttig fremgangsmåde til isolering af DNA fra sådanne prøver ved anvendelse af BT Cheleks 100 Resin3 er beskrevet nedenfor.

trin et: Erythrocytlysis

• Skær en tør blodplade ud og anbring den i et mikrocentrifugerør (1,5 ml) ved hjælp af en hulpuncher. Glem ikke at mærke røret, især når du arbejder på flere prøver. Til kvalitetskontrol formål, også omfatte en positiv kontrol blod plet.
• tilsæt 1 ml 0, 5% saponin i mikrocentrifugerøret, der indeholder blodpletten. Luk, hvirvel, og inkuber ved 4 0C i mindst 4 timer, eller bedre endnu, natten over. I dette trin komplekser saponin med kolesterol i erytrocytmembranen, der fører til dannelse af porer i membranen og dermed hæmolyse.4 Saponin er et almindeligt anvendt lysreagens til frigørelse af parasitter (for eksempel malariaparasitter) fra røde blodlegemer.
• drej i et par sekunder ved 4.000 o / min for at fjerne dråber fra det indre låg og aspirere saponin fra røret ved hjælp af en ikke-barriere pipettespids fastgjort til en pasteur-pipette på en vakuummonteringsmaskine. En plastisk pasteurpipette kan også bruges. Forlad stedet i mikrocentrifugerøret.

trin To: vask

• tilsæt 1 ml fosfatbufret saltvand i mikrocentrifugen, luk, hvirvel og inkuber ved 4 0C i 20-30 minutter. Inkubering natten over vil ikke forårsage nogen skade. Dette trin sikrer, at saponin fjernes fra røret.
• Spin i et par sekunder ved 4.000 omdr. / min., og fjern derefter PBS, på samme måde som du fjernede saponin. Forlad stedet i mikrocentrifugerøret.

trin tre: DNA-ekstraktion med Cheleksharpiks

princip: Cheleksharpiks virker ved at forhindre DNA-nedbrydning fra nedbrydende stoffer (Dnaser) og fra potentielle forurenende stoffer, der kan hæmme analyser nedstrøms. Generelt vil Cheleksharpiksen fælde sådanne forurenende stoffer og efterlade DNA i opløsning. Det Cheleks harpiks arresterer kationer såsom Mg2+, en vigtig medfaktor for Dnasehandling, og beskytter dermed DNA ‘ et mod nedbrydning.5,6

• Pipette og tilsæt 150 liter 6,7% Cheleks harpiksopløsning i mikrocentrifugerøret, der indeholder stedet. Luk røret. En vigtig påmindelse: når du forbereder 6,7% Cheleks-opløsningen, skal du bruge vand, der er fri for Dnaser, nukleaser (eller noget, der kan skade og nedbryde DNA).
• inkuber ved 95 0C i 10 minutter ved hjælp af en varmeblok/ ryster. Det er vigtigt at åbne røret to gange hvert 2.minut for at frigive tryk og derefter ryste i et par sekunder derefter. Dette frigiver DNA til opløsning.

Trin fire: undgå Cheleksharpiksperler i det endelige ekstrakt

• Spin i 5 minutter ved 4.000 o / min
• Pipette så meget ekstrakt som muligt i et mindre mikrocentrifugerør (0,6 ml) ved hjælp af en aerosolbarrierespids, mens du undgår overførsel af Cheleksperler.
• centrifuger 0,6 ml mikrocentrifugen ved 4.000 o / min i 10 minutter. Ideen med det andet spin er at fjerne eventuelle resterende perler, der kan overføres til det endelige ekstrakt. Hvorfor er det vigtigt? To hovedårsager: 1) Cheleks binder til magnesiumioner (essentiel cofaktor for tak polymerase anvendt i PCR) og 2) cheleks fluorescerer. Hvis fluorescens er din måde at visualisere et resultat på, kan dette skabe en falsk positiv.
• pipetter ca.100 liter og overfør det endelige ekstrakt til en ny mikrocentrifuge. Mærk og opbevar i køleskab.

et par tip, mens du udfører DNA-ekstraktioner

• arbejde i et rent miljø fri for forurenende stoffer
• brug pipettespidser, der er fri for nukleaser
• Håndter alle prøver med handsker
• igen, undgå Cheleksperler i dit endelige ekstrakt

konklusion

Cheleks Resin7, giver en enkel og hurtig DNA-ekstraktionsmetode fra DBS til anvendelse i forskellige molekylære analytiske anvendelser. Denne metode kræver ikke dyrt udstyr og er pålidelig, når den testes mod andre metoder.

1. GE Healthcare (2010). Pålidelig ekstraktion af DNA fra FTA-kort. Anvendelsesnote 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, UK: GE Healthcare.
2. Tegnepapir (n.d.). Forberedelse af en FTA-disk til DNA-analyse. FTA-protokollen BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelateringsharpiks 100 og Chelateringsharpiks 20 instruktionsmanual. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad laboratorier.
4. Baumann, E., Stoya, G., V L. L., A., Richter, L., Lemke, C. Og Linss (2000). Hæmolyse af humane erythrocytter med saponin påvirker membranstrukturen. Acta Histochemica, 102 (1), 21-35.
5. IBRC (2016). Ekstraktionsprotokol. IBRC hjemmeside. Hentet fra http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stuart, J. og Staton, P. (n.d.). Udvikling og intern validering af en DNA-Ekstraktionsprotokol til Reference orale vatpinde.
7. P. S., D. A. og Higuchi, R. (2013). Bioteknologi 30 års jubilæum perle Cheleks 100 som et Medium til simpel ekstraktion af DNA til PCR-baseret Typing fra retsmedicinsk materiale. Bioteknologi, 54 (3), 134-139.